药物分离技术第六章 制备色谱分离技术-3

第六章 制备色谱分离技术
第一节 概述 第二节 凝胶色谱分离技术 第三节 高速逆流色谱分离技术 第四节 制备薄层色谱分离技术 第五节 制备柱色谱分离技术 第六节 亲合色谱分离技术
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第三节 高速逆流色谱分离技术
一、简介
1、概念
逆流色谱：是一种不用固态支撑体或载体的液液分配色谱技术，是一种特 殊的连续萃取装置。 2、发展 最早的逆流色谱是液滴逆流色谱（DCCC），后来发展了离心逆流色谱 （CCCC）和高速逆流色谱（HSCCC）。 3、特征： 互不相溶的两相在分离过程中做逆流运动，溶质组分由于在两相中分配系 数不同而得到分离。 4、应用： 适合分离极性物质和具有生物活性的物质。
一、薄层色谱条件 1、固定相选择
应从被分离物质极性和固定相的性能的强弱这两方面考虑。
被分离物质极性
固定相性能/活性 展开剂极性
大
弱（稍小）
大
小
强
小
极性大的物质应选用极性略小的吸附剂，否则由于作用力大而难于洗脱；极
性小的物质，则选用极性强的吸附剂，否则会因作用力小而不能分离。
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常用固定相吸附剂简介
常用的反相硅胶有C18、C8等。反相色谱多用于柱层析。
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常用固定相吸附剂简介
(2) 氧化铝
有三种类型：碱性氧化铝（PH 9）、中性氧化铝（pH 7～7．5）及酸性氧 化铝（pH 3．5～4．5）。它们都是由氢氧化铝制得，但条件不同。
活性：与其含水量有关。 目前除了生物碱等碱性物质外，很少用。
（1）分配系数考虑
通常调整固定相达到管柱总体积的50%以上，将分配系数调整在0.5~2。
K＜0.5样品很快随流动相留出来； K ＞2分离时间长，同时溶剂消耗量大。
（2）满足固定相保留率
尽量选择挥发性强的溶剂，溶剂体系的沉淀时间应小于30s。
固定相保留率测定方法：各取2ml平衡后的上下相溶液，移入一个5ml的刻度玻璃 管中，密封上下摇动5次后静置于水平面上，并测定两相分层时间—沉淀时间。
5.收集：展开确定了所要的谱带后，用适宜工具如刀片将所需成分的谱带同 吸附剂一起刮下，收集，选取适宜溶剂将所要组分洗脱下来，并清洗工具， 合并洗脱液。
将洗脱液收集，浓缩即可。如必要，可对收集物进行重结晶，以提高 提取物的纯度。
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第四节 制备薄层色谱分离技术
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常用固定相吸附剂简介
(3) 纤维素
纤维素种类：有两种。
（1）天然纤维状纤维素：简称纤维素，（2）微晶纤维素：是用棉花等原料制成，纤维素分子由排列得比较规则的 微小结晶区域（一般约占分子组成的 85％）和分子排列杂乱的无定形区 域交链而成，微晶纤维素的粒度为20～40μm。
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第三节 高速逆流色谱分离技术
二、液滴逆流色谱
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第三节 高速逆流色谱分离技术
二、离心液滴逆流色谱
离心液滴逆流色谱比液滴逆流色谱进步的地方就是使用离心加快重力分离。
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第三节 高速逆流色谱分离技术
二、离心液滴逆流色谱
离心液滴逆流色谱比液滴逆流色谱进步的地方就是使用离心加快重力分离。
（3）化合物在两相中分配系数的测定 各取1ml平衡后的上下相溶液于试管中，加入适量样品溶液，充分振摇后静置，
用高效液相测定。或用薄层色谱分离显色后，比较上下层样品斑点颜色深浅。
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第三节 高速逆流色谱分离技术
1、溶剂系统选择
具体操作方法： （1）首先通过上述方法考察被分离物质的极性，然后在调整获得极性合适的分离体系 （2）首先选出一个能使样品全部溶解的溶剂体系，再调整溶剂比例，使被分离组分满 足K值和α要求，以提高分离度。
极性溶剂为乙酸乙酯体系， 由水和乙酸乙酯组成，再加 入甲醇、乙醇、正丁醇等调 整体系极性。 非极性溶剂正己烷体系。
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第三节 高速逆流色谱分离技术
2、应用
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第三节 高速逆流色谱分离技术
2、应用
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第三节 高速逆流色谱分离技术
2、应用
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第四节 制备薄层色谱分离技术
制备色谱：以色谱为手段从混合物中分离提纯所需要的纯化合物。
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第四节 制备薄层色谱分离技术
特点：快速、简便、高分辨率。 薄层厚度：
分析用的薄层厚度一般为0.25mm；制备用薄层其厚度为0.5～3mm。 样品量一般在1mg~1g。
三、离心薄层层析（RPC ）
1、概述 是薄层色谱的重要分支，也称强迫流动薄层色谱，是通过外力强迫展
但加热到100℃左右，此结合水能被可逆地除去，硅胶又恢复吸附能
力。我们在制备薄层板后需进行活化，即为此目的。
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常用固定相吸附剂简介
荧光硅胶
在硅胶中加人荧光剂，制成的薄层在紫外光照射下显荧光，而样品斑点处 不显荧光，呈暗色，从而可检出斑点位置；这适用于那些本身无色，在紫 外灯下也不显荧光，又无适当显色剂显色的化合物。
缺点：流动相进口和出口必须使用旋转流体密封件，易耗损。 限制流动相的流速和离心速度。
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第三节 高速逆流色谱分离技术
三、高速逆流色谱
高速逆流色谱：利用了一种特殊的流体动力学（单向流体动力学平衡）现 象，使两个互不相溶的溶剂相在高速旋转的螺旋管中单向分布。其中一相 作固定相，由恒流泵输送载着样品的流动相穿过固定相，利用样品在两相 中分配系数的不同实现分离。
3．展开： 4．显色 ：必须是不破坏型，不能用试剂显色， 可采用
（1）碘蒸气显色
（2）紫外线显色
若必须化学方法进行显色，则也可用一玻璃板遮住中间部分，使其两侧
各露出一小条，然后喷雾显色。
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第四节 制备薄层色谱分离技术
二、薄层色谱操作技术
铺板→活化→点样→展开→（显色）→收集
（定量分析、制备纯样品、定性检出 ）
静置区
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第三节 高速逆流色谱分离技术
三、高速逆流色谱
高速逆流色谱：分析型、半制备型和制备型三大系列。 不但非适合极性化合物，也适应极性化合物。
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第三节 高速逆流色谱分离技术
三、高速逆流色谱
1、溶剂系统选择
溶质在固定相的量 k 溶质在流动相的量
K——分配系数；
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第四节 制备薄层色谱分离技术
一、薄层色谱条件
2、展开剂的选择 多元混合展开剂的应用
（1）弱极性溶剂体系：大多由石油醚、苯、环己烷等组成，适用于极性小的物质， 实验中可根据需要加入甲醇、乙醇，乙酸乙酯调节溶剂的极性，以获得较好的 分离效果。
（2）中等极性的溶剂体系：由氯仿和水基本两相组成，由甲醇、乙醇，乙酸乙酯 等来调节，适合于蒽醌、香豆素，以及一些极性较大的木脂素和萜类的分离。
2、展开剂的选择 主要考虑样品中各组分的极性、溶剂对于样品中各组分溶解度及吸附
剂的活性等因素来考虑。
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第四节 制备薄层色谱分离技术
一、薄层色谱条件
2、展开剂的选择 初步筛选：可采用微量圆环技术。
方法: (1)将样品溶液点于薄层板上，挥去溶剂，滴少量溶剂与薄层的斑点 上，若样品斑点未发生扩散或位移，则需增加展开剂的极性; (2)若样品斑点向展开剂前沿快速扩散，则需降低展开剂的极性。
溶剂极性大小： 石油醚＜环己烷＜四氯化碳＜甲苯＜苯＜氯仿＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜正
丙醇＜乙醇＜甲醇＜水＜冰醋酸
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一、薄层色谱条件
2、展开剂的选择
溶剂系统选好后，则可在制备薄层板上 进行验证并根据实验结果进行进一步 调整，以便达到分离的目的。
薄层色谱的比移值（Rf值）可衡量分离 效果。
（3）强极性溶剂：由正丁醇和水组成，也由甲醇、乙醇，乙酸乙酯等来调节，适 合于极性很大的有机碱类化合物的分离，如生物碱的类化合物的分离。
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问题
有个中药提取物，其中含有某黄酮苷及其苷元，硅胶薄层色谱展开 后，那个成分的Rf值较大？若用氯仿甲醇溶剂系统进行展开时，期中一 个成分在原点没有移动，如何调节展开剂使之移动？
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第四节 制备薄层色谱分离技术
制备薄层与常规薄层的区别
薄板的厚度不同； 板的大小； 分离的样品量大 ； 检测必须是不破坏型，即不能用试剂显色。 样品连同吸附剂一起刮下，放入烧杯中（或装入柱中）选用适当溶剂
将组分洗脱出来。
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第四节 制备薄层色谱分离技术
甲基纤维素钠、5%的聚丙烯酸水溶液或5%的淀粉浆。 硅胶薄层一般在105～110℃活化30～60min，活化程度与加热时间有关。 活化好的薄层一定要放在干燥箱中保存。因为吸附剂非常易吸水，在50％
湿度的空气中放置5min，可以吸收失去水分50％，10min吸收 80％。 制备好的薄层板可现行用适当的溶剂进行预展开，以除去吸附的杂质。
硅胶
硅胶的分离效率取决于其颗 粒大小和粒度分布范围，颗 粒大范围宽效果差，但是展
开快，斑点分散。
(1) 硅胶：SiO2 xH2O 是一种极性吸附剂。 硅胶的活化：硅胶的吸附活性与其表面吸附的水的量有关，硅胶表面
存在硅醇基，通过氢键与极性化合物结合，用于分离有机物；也可通过 氢键与水结合，当吸水大于12%时，则失去活性或吸附性，不能用作吸附 色谱，只能用作分配色谱的载体。