第五章 减压柱色谱分离技术要点
色谱柱分离技术的研究与应用
色谱柱分离技术的研究与应用第一章：引言色谱柱分离技术是化学分析中最为常用的一种技术之一。
它可以将混合物中的各种化合物分离开来，然后进行检测和分析。
在医学、生命科学、食品检测等领域中，色谱柱分离技术已经得到了广泛的应用。
在本文中，我们将详细探讨色谱柱分离技术的研究与应用，以期对该技术的理解和运用有更深入的认识。
第二章：色谱柱分离技术的原理色谱柱分离技术源于分子分配平衡原理，即化合物在两相间不断分配，直至达到一个动态平衡状态。
核心原理是分离物的物理和化学性质存在差异，使得在色谱柱内的运动速度存在差异。
通过在色谱柱内静止相和动态相之间的相互作用，这些化合物得以分离。
在操作过程中，将待分离的样品通过液相或气相进入柱子，通过柱子内的各种物理、化学现象，不同分子的化合物不同的速率经过柱子，从而被分离出来。
而液相层析和气相色谱则是用于在分离中使用的两种技术。
在液相色谱中，液相作为移动相，将待分离物质混合进入柱子，样品与柱内的固相材料持续相互作用，确立效率分离过的化合物被从流动相中隔离出来。
而在气相色谱中，样品通过柱子时，是以气态形式运输。
与液相柱不同的是，气相柱中移动相都是气体，样品和气体一起通过固定的柱子，进而与固相作用，最后被分离。
这种技术是分离不易被液相色谱分离的挥发物质时的优选选择。
第三章：色谱柱分离技术的分类根据液相色谱和气相色谱的不同，色谱柱分离技术可以被分为以下两种：液相色谱柱：1、反相色谱柱（RPC）：RPC柱是指其固相是一种亲水性材料，移动相为疏水性溶液，组成相反一般的流动相介质。
此时极性物质由于互相强占有水分子，因此流动相为水可以很好的将相异性化合物从区间进行分离。
2、正相色谱柱（NPC）：NMC柱是指其固相是的一种疏水性材料，移动相为亲水性溶液，组成相反位于流动相介质。
此时极性物质由于互相强占有水分子，因此流动相为水可以很好的将相异性化合物从区间进行分离。
气相色谱柱：1、毛细管柱：毛细管柱是气相柱的一个常见类型，其型号和长度是顺应分析过程而定制。
请你总结柱色谱的操作步骤及注意事项
请你总结柱色谱的操作步骤及注意事项
柱色谱是常用的分离和分析技术之一，通常有以下操作步骤及注意事项：
操作步骤：
1. 样品制备：将需要分离的混合物溶解或悬浮在合适的溶剂中，经过过滤或离心等处理，得到样品溶液。
2. 填充柱料：将柱料填充到柱中，常用的柱料有硅胶、脱脂棉、高效液相色谱柱等。
3. 平衡柱料：用适当的溶剂通过柱料进行平衡，以保证柱料内部的平衡状态。
4. 装样：将样品溶液使用适当的方法（如注射器）装载到柱中。
5. 洗脱：通过柱料添加适当的洗脱剂，将混合物中的目标成分逐一洗脱出来。
6. 收集洗脱液：将洗脱液逐一收集到相应的集样器中，可以根据需要选择收集不同时间段或体积段的洗脱液。
7. 分析：对收集的洗脱液进行后续的分析，如测量吸光度、进行色谱质谱分析等。
注意事项：
1. 柱料的选择：根据样品特性选择合适的柱料，以保证分离效果。
2. 柱料的平衡：进行柱色谱操作前，要确保柱内的柱料处于平衡状态，以获得稳定的分离结果。
3. 柱色谱条件的控制：调整洗脱剂的流速、浓度等条件，可以影响分离效果和分离时间。
4. 样品的预处理：对样品进行合适的预处理，如过滤、离心、
浓缩等，以避免堵塞柱料。
5. 柱的保养与维护：定期对柱进行保养和维护，如洗涤、再生、更换等，以保证柱的使用寿命和分离效果。
6. 操作的环境控制：在操作过程中，注意保持干净的工作台和无尘环境，以避免杂质的干扰。
柱色谱分离技术
柱色谱分离技术第一篇：柱色谱分离技术实训操作规程柱色谱分离技术操作规程1．装柱装柱的好坏直接影响分离效率。
装柱之前，先将空柱洗净干燥，然后将柱垂直固定在铁架台上。
如果色谱柱下端没有砂芯横隔，就取一小团脱脂棉，用玻璃棒将其推至柱底，再在上面铺上一层厚0.5~1cm的石英砂，然后进行装柱。
装柱的方法有湿法和干法两种。
①湿法装柱：将吸附剂用洗脱剂中极性最低的洗脱剂调成糊状，在柱内先加入约3/4柱高的洗脱剂，再将调好的吸附剂边敲打柱身边倒入柱中，同时打开柱子的下端活塞，在色谱柱下面放一个干净并干燥的锥形瓶，接收洗脱剂。
当装入的吸附剂有一定的高度时，洗脱剂流下速度变慢，待所用吸附剂全部装完后，用流下来的洗脱剂转移残留的吸附剂，并将柱内壁残留的吸附剂淋洗下来。
在此过程中，应不断敲打色谱柱，以使色谱柱填充均匀并没有气泡。
柱子填充完后，在吸附剂上端覆盖一层约0.5cm厚的石英砂或覆盖一片比柱内径略小的圆形滤纸。
②干法装柱：在色谱柱上端放一个干燥的漏斗，将吸附剂倒入漏斗中，使其成为细流连续地装入柱中，并轻轻敲打色谱柱柱身，使其填充均匀，再加入洗脱剂湿润。
2．加样液体样品可以直接加入到色谱柱中，如浓度低可浓缩后再进行分离。
固体样品应先用少量的溶剂溶解后再加入到柱中。
在加入样品时，应先将柱内洗脱剂排至稍低于石英砂表面后停止排液，用滴管沿柱内壁把样品一次加完。
在加入样品时，应注意滴管尽量向下靠近石英砂表面。
样品加完后，打开下旋塞，使液体样品进入石英砂层后，再加入少量的洗脱剂将壁上的样品洗脱下来，待这部分液体的液面和吸附剂表面相齐时，即可打开安置在柱上装有洗脱剂的滴液漏斗的活塞，加入洗脱剂，进行洗脱。
3．洗脱在洗脱过程中，样品在柱内的下移速度不能太快，如果溶剂流速较慢，则样品在柱中保留的时间长，各组分在固定相和流动相之间能得到充分的吸附或分配作用，从而使混合物，尤其是结构、性质相似的组分得以分离。
但样品在柱内的下移速度也不能太慢(甚至过夜)，因为吸附剂表面活性较大，时间太长有时可能造成某些成分被破坏，使色谱带扩散，影响分离效果。
柱色谱的分离应用实验原理
柱色谱的分离应用实验原理引言柱色谱是一种广泛应用于化学、生物化学、环境科学等领域的分离技术。
通过在柱子中填充或涂覆固定相，利用样品在固定相上的相互作用和分配系数的差异，实现不同组分的分离和纯化。
本文将介绍柱色谱的分离应用实验原理。
实验原理柱色谱的分离实验主要涉及以下几个方面：1.柱子的填充物选择：柱子中的填充物通常为固定相，它应具有一定的亲水性或亲油性以及一定的化学稳定性。
常用的填充物有硅胶、活性炭、聚合物和离子交换树脂等。
填充物的选择应根据待分离的样品性质和分离条件来确定。
2.样品的处理：在进行柱色谱实验前，需要对待分离的样品进行处理。
通常包括溶解、过滤和预处理等步骤。
样品的处理可以提高分离效果和色谱峰的分辨率。
3.色谱柱的装配和操作：将填充物填充或涂覆在柱子中，然后进行柱子的装配，包括柱子的连接和适当的封堵。
在进行柱色谱实验时，需要通过注射器将待分离的样品注入柱子中，并进行流动相的输送。
4.流动相的选择：流动相是柱色谱中的移动相，它的选择对分离效果有重要影响。
流动相通常是一种液体溶剂，可以通过调整流动相的成分和流速等参数来控制分离效果。
常用的流动相有水、有机溶剂和缓冲液等。
5.色谱条件的优化：柱色谱实验中，需要对色谱条件进行优化。
包括柱温、流速、吸附时间等参数的选择和调整。
通过优化色谱条件，可以提高分离效果和色谱峰的分辨率。
实验步骤1.准备柱子：选择合适的柱子和填充物，填充或涂覆固定相，并进行柱子的装配。
2.样品处理：将待分离的样品溶解并过滤，根据需要进行预处理，如调整pH值、加入离子交换剂等。
3.色谱条件优化：根据样品性质和分离需求，选择适当的流动相和色谱条件。
4.样品注射：使用注射器将待分离的样品注入柱子中。
5.开始分离：通过控制流动相的输送，开始进行分离。
可以采集出流液以及色谱峰出现的时间和高度。
6.分析结果：根据分离效果和色谱峰的分析，对样品进行分析和定量。
结论柱色谱是一种重要的分离技术，广泛应用于化学、生物化学和环境科学等领域。
第五章 减压柱色谱分离技术解读
d． VLC处理量大．分离几十克的样品，仍能 以较快的速度完成。在 FCC中，由于玻璃分离 柱的限制，处理6g以上的样品时就常困难．常 压柱层析虽然没有样品量的限制，但是极其耗 时，所用的固定相的量亦很大，
三、上样
放掉真空后，常压下加入低极性 溶剂于吸附剂表面上，减压使溶 剂均匀流过吸附剂。如有空隙， 需要重装。使柱子抽干后，重复 1～2次，即可准备上样。
A．用低极性溶剂或洗脱剂（如石油醚、 正己烷）溶解样品。常压下小心加入 柱顶端，再加入洗脱剂或溶剂覆盖吸 附剂表面，慢慢减压，使样品在柱顶 端形成样品层。
VLC不同于常压柱层析和快速柱层析Fcc，因为后 两者洗脱剂是连续的，在操作中不会间断；而VLC 进行溶剂洗脱时，在加洗脱剂后，在柱后减压下全 部抽出，每一次洗脱收集一次，抽干后，再更换溶 剂，并再进行下一个流分的收集，所以在这一点上 VLC与PTLC多次展开极为相似。（展开一次后吹 干，再展）。
由于经典的柱层析费时费力，需要大量的固定 相和洗脱液，工作效率低，为此人们相继建立 了离心薄层、 VLC、 FCC等快速层析分离的 方法。其中VLC在天然产物分离中应用最多。
该法1969年由澳大利亚Coll J.C提出，1977年首 次应用于分离澳洲软珊瑚中2个新的二萜化合
物(Cembrenoids).
1.固定相；
常10u采m用～4T0LuCm用硅硅胶胶6、0HA或l26O03G,（）粒聚度酰：胺 等
2. 装柱：干法装柱法。
将吸附剂装入漏斗或短柱中，轻轻拍 紧或减压拍打或从顶端挤压，直至吸 附剂紧密，最后变得坚硬。吸附剂的 高度一般不超过5cm。
柱色谱分离技术
实训操作规程柱色谱分离技术操作规程1．装柱装柱的好坏直接影响分离效率。
装柱之前，先将空柱洗净干燥，然后将柱垂直固定在铁架台上。
如果色谱柱下端没有砂芯横隔，就取一小团脱脂棉，用玻璃棒将其推至柱底，再在上面铺上一层厚0.5~1cm的石英砂，然后进行装柱。
装柱的方法有湿法和干法两种。
①湿法装柱：将吸附剂用洗脱剂中极性最低的洗脱剂调成糊状，在柱内先加入约3/4柱高的洗脱剂，再将调好的吸附剂边敲打柱身边倒入柱中，同时打开柱子的下端活塞，在色谱柱下面放一个干净并干燥的锥形瓶，接收洗脱剂。
当装入的吸附剂有一定的高度时，洗脱剂流下速度变慢，待所用吸附剂全部装完后，用流下来的洗脱剂转移残留的吸附剂，并将柱内壁残留的吸附剂淋洗下来。
在此过程中，应不断敲打色谱柱，以使色谱柱填充均匀并没有气泡。
柱子填充完后，在吸附剂上端覆盖一层约0.5cm厚的石英砂或覆盖一片比柱内径略小的圆形滤纸。
②干法装柱：在色谱柱上端放一个干燥的漏斗，将吸附剂倒入漏斗中，使其成为细流连续地装入柱中，并轻轻敲打色谱柱柱身，使其填充均匀，再加入洗脱剂湿润。
2．加样液体样品可以直接加入到色谱柱中，如浓度低可浓缩后再进行分离。
固体样品应先用少量的溶剂溶解后再加入到柱中。
在加入样品时，应先将柱内洗脱剂排至稍低于石英砂表面后停止排液，用滴管沿柱内壁把样品一次加完。
在加入样品时，应注意滴管尽量向下靠近石英砂表面。
样品加完后，打开下旋塞，使液体样品进入石英砂层后，再加入少量的洗脱剂将壁上的样品洗脱下来，待这部分液体的液面和吸附剂表面相齐时，即可打开安置在柱上装有洗脱剂的滴液漏斗的活塞，加入洗脱剂，进行洗脱。
3．洗脱在洗脱过程中，样品在柱内的下移速度不能太快，如果溶剂流速较慢，则样品在柱中保留的时间长，各组分在固定相和流动相之间能得到充分的吸附或分配作用，从而使混合物，尤其是结构、性质相似的组分得以分离。
但样品在柱内的下移速度也不能太慢(甚至过夜)，因为吸附剂表面活性较大，时间太长有时可能造成某些成分被破坏，使色谱带扩散，影响分离效果。
柱色谱法分离
氧化铝 砂芯
柱色谱装置
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四、操作规程
收集黄色产物于一已知重量烧瓶中
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五、操作要点
1 、色谱柱一定要干燥，若潮湿可用吹风机吹干或用无
水有机溶剂（甘油等）清洗。
2 、装柱要紧密均匀，无裂缝，无气泡，是分离效果好 坏的关键。但装填时过分敲击，又会太紧密而流速 太慢。 3 、加入砂子的目的是在加料时不致把吸附剂冲起，而 影响分离效果。
流下时，由于不同化合物吸附能力不同，往下洗脱的速度 也不同，于是形成了不同层次，即溶质在柱中自上而下按
对吸附剂亲和力大小分别形成若干色带，再用溶剂洗脱时
2
已经分开的溶质可以从柱上分别洗出收集；或者将柱吸干，
挤出后按色带分割开，在用溶剂将各色带中的溶质萃取出
来。对于柱上不显色的化合物分离时，可用紫外光照射后 所呈现的荧光来检查，或在用溶剂洗脱时，分别收集洗脱
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4、在整个洗脱过程中，为了保持色谱柱的均一性，应
使柱中洗脱剂液面始终保持不低于石英砂面。否则 柱中溶剂流干时，就会使柱身干裂，影响渗滤和显 色的均一性。
5、 最好用移液管或滴管将分离溶液转移至柱中。
6、 可以每次倒入、了解掌握柱色谱原理和方法 2、进一步掌握旋转蒸发仪的使用方法。 二、试剂
5g氧化铝，自制乙酰二茂铁（溶于1.5ml正己烷）， 石英砂。洗脱剂：① 正己烷，②1 ：1=二氯甲烷：正己 烷，③ 9 ：1=二氯甲烷：正己烷，④ 9 ：1=二氯甲烷： 甲醇。
5
三、装置图
溶剂 石英砂
3
化合物的吸附性与它们的极性成正比。
色层的展开首先使用极性较小的溶剂，使最容易脱
附的组分分离。然后加入不同比例的极性溶剂配成的洗
脱剂，将极性较大的化合物自色谱柱中洗脱下来。所用 溶剂必须纯粹、干燥。吸附剂用量为被分离样品量的
(完整版)柱层析的操作步骤和注意事项
柱层析技术常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。
我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。
由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。
柱子可以分为：加压，常压，减压。
压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。
所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。
减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝聚），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。
以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。
加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。
压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。
非凡是在轻易分解的样品的分离中适用。
压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。
个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。
关于柱子的尺寸，应该是粗长的最好。
柱子长了，相应的塔板数就高。
柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。
试想假如柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。
而假如样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较轻易得到完全分离了。
当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。
现在见到的柱子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具体的选择要具体分析。
假如所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm×20cm 的柱子）；假如相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm 的，也可以减小淋洗剂的极性等等。
《柱色谱法分离》课件
REPORTING
选择合适的固定相和流动相
总结词
选择合适的固定相和流动相是柱色谱 法分离的关键步骤，直接影响分离效 果。
详细描述
固定相应与目标物质具有较高的吸附 或结合能力，同时也要有良好的稳定 性和耐用性。流动相应选择对目标物 质溶解度适中、粘度较低的溶剂，以 提高分离效率和效果。
控制洗脱速度和洗脱方式
中药有效成分的分离
中药有效成分的种类
中药有效成分包括生物碱、黄酮、皂苷等，具有抗肿瘤、抗炎、抗 病毒等作用。
分离原理
利用中药有效成分在固定相和流动相之间的吸附和解吸性质不同， 实现各成分的分离。
分离流程
中药提取物经过滤、浓缩后，上柱分离，通过调整流动相的组成和洗 脱速度，分段收集洗脱液，得到纯度较高的各有效成分。
总结词
洗脱速度和方式对柱色谱分离效果具有重要影响。
详细描述
应根据目标物质的性质和分离要求，合理控制洗脱速度，以实现最佳的分离效 果。同时，选择合适的洗脱方式，如梯度洗脱或分段洗脱，可以提高分离精度 和分离效率。
优化装柱和上样方法
总结词
装柱和上样方法的优化可以提高柱色谱分离的效率和效果。
详细描述
在装柱过程中，应保证固定相填充均匀、紧密，避免出现空隙或颗粒物，以提高分离效果。在上样过程中，应控 制样品的浓度和上样量，避免过载或欠载，以保证分离效果和分离精度。同时，可以采用一些技巧如梯度洗脱、 多次洗脱等来提高分离效果。
通过收集不同时间流出的组分，可以得到纯度 较高的各个组分。
柱色谱法的应用
在化学合成中，柱色谱法 常用于分离纯化有机化合 物。
在天然产物提取中，柱色 谱法用于分离植物、动物 或矿物中的有用成分。
在生物领域，柱色谱法用 于蛋白质、酶、核酸等生 物大分子的分离纯化。
柱色谱分离-陈启明
层析柱分离的一般是本身有颜色或在紫外灯下有荧光的物质。
必须先做薄层色谱（TLC）分离试验，以寻找柱色谱的最佳分离条件。
1.薄层色谱操作方法：所需的东西主要有溶剂、展开剂、玻璃点样毛细管（内径0.3mm）、硅胶铝箔板、染缸。
将被分离的试样用溶剂溶解后，用玻璃点样毛细管（内径0.3mm）蘸取少量溶液，在距薄层板底端约10mm处点样，斑点直径不要过大，约2mm即可，待样点干后放入盛有少量展开剂的染缸中展开。
试样中各组分在薄层板上上升的高度依赖于组分在展开剂中的溶解能力和被吸附剂吸附的程度，选取合适的展开剂就可将代表各组分的样点分离开。
注意：样点要在染缸中展开剂的液面以上。
化合物在薄层板上上升的高度与展开剂上升的高度的比值称为该化合物的比移值Rf（0≤Rf≤1）。
（计算上升高度的起始位置是样点的原始位置）同等条件，极性小的组分Rf大，极性大的组分Rf值小。
单一溶剂极性和展开能力递增顺序：石油醚<正己烷<环己烷<四氯化碳<苯<甲苯<氯仿<二氯甲烷<乙醚<乙酸乙酯<吡啶<异丙醇<丙酮<乙醇<甲醇<水<乙腈。
多元展开剂应互溶，且被分离物也最好能溶解于其中。
由实验确定所需用的展开剂的方法为：选用一个极性强的溶剂和一个极性弱的溶剂并按不同比例调配，即在非极性溶剂中加入少量极性溶剂，极性由弱到强，比例由小到大，以得到合适的比例。
一般最常用的是乙酸乙酯（极性较高）和石油醚（非极性）。
先用乙酸乙酯作为展开剂点板，若样点随展开剂整体移动位移较大，用如上的方法，在石油醚中逐渐加大乙酸乙酯的比例，可找到合适的比例将样点分开；若样点能明显的分开，用乙酸乙酯即可；如若样点在原地不动或动的很少，则需加大展开剂的极性，选用乙醇作展开剂，再和石油醚配比，以求能分开，如用乙醇样点仍原地不动或动的很少，则需再加大展开剂的极性，直至样点能分开。
（若待分离的试样极性特别高可选用乙腈+水+少量磷酸二氢钾）。
柱色谱分离的操作和注意事项
特别注意：有机溶剂对身体特有害别是心肺；肝脏等所有过柱操作都要在通风橱里进行！！！柱色谱是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。
下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望对大家能有所帮助。
1、柱子可以分为：加压，常压，减压压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。
所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。
减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。
以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。
加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。
压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。
特别是在容易分解的样品的分离中适用。
压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。
个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。
2、关于柱子的尺寸，应该是粗长的最好柱子长了，相应的塔板数就高。
柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。
试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。
而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。
当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。
现在见到的柱子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具体的选择要具体分析。
如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等。
中药化学 第五章 色谱分离技术-吸附色谱、聚酰胺
（二）吸附柱色谱操作技术
操作步骤
色谱柱的选择 内径与柱长比：1：10～1：20
装柱 上样 洗脱检查
1、装柱
干法装柱：直接用小漏斗将吸附剂均匀装入柱内的方法。 湿法装柱：将吸附剂装入盛有洗脱液的柱内，或将吸附剂 与洗脱液混合成混悬液再装入柱中，吸附剂慢慢沉降。
二、吸附色谱基本构成要素
吸附剂（固定相） 展开剂（流动相、移动相） 被分离的成分
（一）吸附剂
1、基本要求 一般来说，吸附剂要有较大的表面积和适宜
的活性，与移动相溶剂及被分离各成分不起化学 反应、颗粒均匀，并且在所用各种溶剂中不溶解。
2、种类 极性吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺、氧化镁、 硅酸镁、碳酸钙和硅藻土等。 非极性吸附剂：活性炭
2、种类 亲脂性有机溶剂：石油醚、环己烷、四氯化碳、苯、 甲苯、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等。 亲水性有机溶剂：丙酮、乙醇、甲醇等。 极性吸附能力的大小与选择展开剂的极性 和被分离成分的极性大小有关。
一般来说，当选用常用的硅胶或氧化铝这类极性 吸附剂时，展开剂的极性越大，解吸附能力越强， 否则越弱。
色谱分离技术按色谱原理分吸附色谱分配色谱离子交换色谱凝胶色谱色谱分离技术按操作形式分平面色谱tlcpc柱色谱毛细管电泳色谱色谱分离技术按流动相分液相色谱hplc气相色谱gc超临界流体色谱sfc二分类由于色谱法具有强大的分离能力众多的分离模式和灵活的检测手段因而被广泛用于化工医药生化和环境保护等领域尤其对中药化学成分的分离精制定性和定量检测等方面行之有效
影响聚酰胺吸附能力的主要因素如下：
1. 形成氢键的能力与溶剂有关。一般聚酰胺在水中 与化合物形成氢键的能力最强，在有机溶剂中较弱， 在碱性溶剂中最弱。因此溶剂对聚酰胺的洗脱能力 的次序为： 水〈甲醇或乙醇〈丙酮〈稀氢氧化钠溶液或稀氨水 〈甲酰胺或二甲基甲酰胺。
《柱色谱分离实验》课件
硫酸或氢氧化钠：用 于调节洗脱液的pH 值。
蒸馏水：用于制备洗 脱液和清洗实验器具 。
03 实验步骤与操作
实验前的准备
实验材料
硅胶、氧化铝、活性炭、 硅藻土等；玻璃色谱柱、 吸附剂、砂芯漏斗、脱脂 棉等；样品和溶剂。
实验设备
分液漏斗、烧杯、玻璃棒 、天平等。
实验试剂
不同比例的溶剂，如石油 醚、乙酸乙酯、乙醇等。
指标的合理性。
误差分析
对实验误差进行分析，找出误差产 生的原因，并提出减小误差的措施 。
结果讨论
根据实验结果，讨论柱色谱分离实 验的影响因素和优化方法，为改进 实验提供依据。
05 结论与展望
实验结论总结
柱色谱分离实验是一种有效的分离方法，能够将混合物中的各组分进行有效的分离 。
通过实验，我们观察到了各组分在柱子上的吸附和解吸过程，并成功分离出了目标 组分。
换吸附剂。
03
实验结果分析
在实验结束后，应对实验结果进行分析和总结，以便更好地了解各组分
的性质和含量。同时，应将实验数据和结果记录在实验报告中，以便后
续的查阅和分析。
04 实验结果与分析
实验结果展示
分离后的色谱图
展示实验中得到的色谱图，包括 各组分的出峰时间、峰高、峰面 积等数据。
分离效果评估
通过对比标准品和实验样品的色 谱图，评估分离效果，包括分离 度、纯度等指标。
实验操作流程
01
02
03
04
准备色谱柱
选择合适的吸附剂，填充色谱 柱，确保填充均匀。
上样
将样品溶液缓慢加入色谱柱顶 部，同时用少量溶剂冲洗砂芯
漏斗，以避免样品残留。
洗脱
选择合适的溶剂系统，按照一 定顺序进行洗脱，收集洗脱液
柱色谱分离经验
关于过柱的实验方法和技巧注意：有机溶剂对身体特有害别是心肺；肝脏等所有过柱操作都要在通风橱里进行！！常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。
我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。
由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。
1、柱子可以分为：加压，常压，减压压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。
所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。
减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。
以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。
加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。
压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。
特别是在容易分解的样品的分离中适用。
压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。
个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。
2、关于柱子的尺寸，应该是粗长的最好柱子长了，相应的塔板数就高。
柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。
试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。
而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。
当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。
现在见到的柱子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具体的选择要具体分析。
如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等。
柱色谱注意事项
柱色谱注意事项柱色谱是一种常用的分离和纯化技术，具有高效、准确、可重复性好等优点。
为了确保柱色谱的正常运行和提高分离效果，有几个需要注意的事项。
首先，要选择合适的柱。
柱子的选择应根据样品的性质和分离要求来确定。
常见的柱子有反相、离子交换、凝胶过滤、糖化柱等。
在选择柱子时要考虑到样品的溶解度、分离的目的、样品量等因素。
其次，要注意样品的前处理。
样品的前处理包括溶解、过滤、稀释、洗脱等过程。
样品必须溶解在适当的溶剂中，以避免柱子堵塞。
如果样品中有杂质，可以通过过滤或洗脱的方法去除。
再次，需要将柱子正确连接到系统中。
柱子通常由进样口、色谱柱和检测器等组成。
在连接之前，要确保柱子和连接部件都是干净的。
正确安装柱子并且密封好连接件，以免发生泄漏。
同时，要检查流路是否完整，避免死角。
此外，要控制流速和压力。
流速和压力是影响分离效果的重要因素。
流速过大会使分离不充分，流速过小会延长分析时间。
因此，要根据实际情况调整流速和压力，以获得最佳的分离效果。
另外，要定期检查和维护柱子。
柱子在使用过程中会发生老化、堵塞等问题，因此需要进行定期检查和维护。
检查柱子的状态，如是否有泄漏、堵塞等问题，并及时更换或清洗柱子。
最后，要记录实验数据和结果。
实验数据和结果的记录是柱色谱分析的重要部分，可以用来追踪实验过程和结果的准确性。
要注意将记录的数据整理归档，方便后续的分析和验证。
综上所述，柱色谱是一种非常有用的分离和纯化技术，在使用过程中需要注意选择合适的柱子、进行样品的前处理、正确连接柱子、控制流速和压力、定期检查和维护柱子，并记录实验数据和结果。
只有这样，才能保证柱色谱的正常运行和获得准确的分离效果。
第五章减压柱色谱分离技术
第五章减压柱色谱分离技术
一、VLC特点
VLC 实 质 上 是 柱 色 谱 ， 它 综 合 了 制 备 薄 层 （Preparative PTLC）和真空抽滤技术。
VLC不同于常压柱层析和快速柱层析Fcc，因为后 两者洗脱剂是连续的，在操作中不会间断；而VLC 进行溶剂洗脱时，在加洗脱剂后，在柱后减压下全 部抽出，每一次洗脱收集一次，抽干后，再更换溶 剂，并再进行下一个流分的收集，所以在这一点上 VLC与PTLC多次展开极为相似。（展开一次后吹 干，再展）。
（2） l．0克 pH 9-12的 Acontium columbianum粗 提 生 物 碱 混 合 物 ， 使 用 6 5 gTLC 用 Al2O3 60 (Merck,H basic,Type E，EM1085)．
甲苯：氯仿＝1：4(V／V)洗脱， 于28-30号流份中 得到 talatizamine(3)265mg;
第五章减压柱色谱分离matography
真空液相色谱法，简称VLC，也称减压液相色 谱法。
是近几年来国外实验室迅速发展起来的新技术， 它是利用柱后减压使洗脱剂迅速通过固定相从 而很好的分离样品的色谱技术。
VLC具有快速，简易，高效，价廉等优点，目 前已成功的应用于有机制备以及天然产物如萜 类，类酯，双萜及多种生物样品的分离。
结合 TLC和核磁共振谱，非常满意地分离和确 定了10余种萜类、脂肪酸及其酯、甾体化台物 (见图)．若用常压柱层桥，需要370g硅胶，费 时30小时，耗用10 L溶剂，才得到同样的效 果．
第五章减压柱色谱分离技术
第五章减压柱色谱分离技术
七. 小 结
综上所述，与常压柱层析和快速柱层析相 比，真空柱层析具有以下特点： a．分离操作时间短，一般仅需数个小时， b．装置简单、易得，装柱方便，且要求不 高， c．分离效果好，这主要是由于固定相的细 小颗粒(平均10 μm)、较大的表面积( 500 m2/／g) 和合理的装柱方法的原因，
常用柱色谱分离技术2010
2．被分离混合物样品为极性较小的固体 • 尽可能使其溶于流动相后上柱。但应注意，样品 在流动相中的溶解度一般较小。如果样品体积太 大，分辨能力就会降低。另一方面，如果样品浓 度过浓，就可能在柱顶部形成沉淀。
• 可选择极性较小的溶剂溶解后上柱. 可选用的溶 剂: CH2Cl2, CCl4, 甲苯，环己烷，石油醚。
3、干法/湿法装柱 4、上样、洗脱与收集
• 40-63um硅胶为吸附剂时，柱的大小、硅较用量、 加样量、每次收集的体积见表
5、压力泵 • 一般要求0.4-0.3Kg/cm2 即可。 约2bar/30psi • 可通过控制流速来实现。与层析柱上端 相接的塞子是一个压力控制伐，可调节 压力而调节流速 如图所示。
3．洗脱液收集 洗脱液采用等份法收集，例如5， 10，20，30或50ml为一份。根据分离样品多寡 而定。用小试管或小三角烧瓶收集。
4．控制洗脱液流出速度。不能太快，太快柱中 交换来不及平衡，从而影响分离效果。一般以 1-2滴/秒为宜。 5．洗脱液TLC检测与合并。将每一个小接收瓶 按编号点样展开，将Rf值相同者合并，浓缩-蒸 干，最后进一步纯化（蒸馏或重结晶等）。
实验室常用的柱色谱有：
• 以硅胶和氧化铝为吸附剂的吸附柱色谱； • 以硅胶、纤维素和聚酰胺为载体（支持剂，担 体），以其吸收较大量的液体作为固定相的分 配色谱（这里支持剂本身不起分离作用）。 • 以葡聚糖凝胶为固定相的分子排阻柱色谱； • 以离子交换树脂为固定相的离子交换柱色谱， • 以生物大分子亲和相为固定相的亲和色谱等。
漏斗装于柱子上端。
旋转蒸发时，一定要加防爆球，以防样品硅胶 爆沸。
（三）．洗脱与分离
1．洗脱剂的选择应以TLC检测为依据。
• 被分离物质的最佳 Rf值应在0.2-0.5 内 。
色谱柱分离技术
7.5.3 柱色谱柱色谱（Column Chromatography）是最常见的色谱分离形式，茨维特的色谱实验是一个典型例子。
它具有高效、简便和分离容量较大等特点，常用于复杂样品分离和精制化合物的纯化。
柱色谱主要有吸附色谱和分配色谱两类。
前者常用氧化铝或硅胶为柱填料。
后者以硅胶、硅藻土和纤维素为支持剂，以吸收一定量的特殊液体作为固定相。
7.5.3.1 吸附柱色谱法分离原理吸附柱色谱法是利用各组分在吸附剂与洗脱剂之间的吸附和溶解（解吸）能力的差异而达到分离的。
当组分分子到达吸附剂表面时，由于吸附剂表面和组分分子的相互作用，使组分分子吸附在吸附剂表面。
当洗脱剂连续通过吸附剂表面时，由于洗脱剂对组分分子的作用力，组分分子会被洗脱剂溶解下来，在一定的温度下，吸附和溶解达到平衡。
但由于洗脱剂不断地移动，这种吸附和溶解过程会反复发生并建立新的平衡，组分分子就随洗脱剂移动，移动速度与组分分子的平衡常数和洗脱剂的流速有关。
当流速一定时，各组分就依据吸附平衡常数的不同而得到分离。
7.5.3.2 吸附色谱柱填料在吸附色谱色谱中，为了使试样中各种在吸附能力稍有差异的组分能够分开，必须选择适当的固定相（吸附剂）和流动相（洗脱剂）。
吸附剂的选择主要根据吸附剂性质和分析要求通过实验来现在。
对吸附剂的一般要求：（点击）具有较大的表面积和足够的吸附能力对不同组分有不同的吸附能力化学惰性，即不溶于流动相，不与样品组分和流动相起化学反应颗粒均匀，具有一定的机械强度的粒度一般采用白色或无色吸附剂，便于观察实验常用的吸附剂硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺、纤维素等。
（1）硅胶色谱硅胶是由弹性多聚硅酸脱水制成，其吸附中心是硅醇基。
硅酸性能稳定，是带有微弱酸性的极性吸附剂，特别是它具有很好的惰性、吸附容量大、容易制成各种不同尺寸的颗粒。
硅胶可用于分离酸性和中性物质，如有机酸、氨基酸、萜类和甾体等。
（2）氧化铝色谱氧化铝由氢氧化铝在300~400℃时脱水制得，它吸附能力比硅胶强。
减压柱层析的操作及在纯化新化合物中的应用
减压柱层析的操作及在纯化新化合物中的应用"减压柱层析技术：高灵敏度、高精度纯化新化合物的关键."减压柱层析是一种十分有效的分子分离技术，它利用能够对不同类别的分子具有不同的吸附力来分离它们。
这种技术可以用于各种种类的分子，包括有机化合物、金属有机框架（MOFs）、多肽、和小分子物质，能够有效地减少杂质同时纯化成分。
本文就减压柱层析的操作及其在纯化新化合物中的应用做一个介绍。
1. 减压柱层析的操作减压柱层析的操作非常简单，其基础原理是通过特殊的溶剂洗涤等操作，将各种不同类型的分子用不同的吸附剂选择性地分集到各自的位置，然后通过改变溶剂的流量，让它们从柱子中不同的位置顺利流出，实现快速准确的分子分离功能。
具体而言，减压柱层析操作步骤如下：(1) 将样品溶液（由需要分离的物质组成）加到分离柱中；(2) 使用专门的纯化溶剂淋洗柱，使样品分子与吸附剂的表面完全接触；(3) 增加溶剂的流量，让物质从柱中以不同的速度不断流出，出口是每种物质；(4) 收集多种物质的某一种，即可得到清晰纯净的物质。
2. 减压柱层析在纯化新化合物中的应用减压柱层析技术具有高效快速、操作容易等优点，并有较强的抗高温、高湿度和无流动性等优越性能，能够有效地减少有机酸、羧酸、电解质等有害物质，在分离新化合物的过程中发挥着十分重要的作用。
例如，在新药的研究开发中，为了提高所研究新药的进程和生产效率，常常用减压柱层析技术对所合成新药或相关物质进行均质、扩大、提纯、水解等操作；在食品和药品工业中，也经常使用减压柱层析来去除污染物、改善产品的质量和组成等问题。
总的来说，减压柱层析的操作方法简单易行，且抗高温和高湿度，能够有效地减少杂质，而且可用于多种类型的分子，从而大大提高了纯化新形成的化合物的质量和效果，是一种十分有效的分子分离技术。
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1.固定相；
常10u采m用～4T0LuCm用硅硅胶胶6、0HA或l26O03G,（）粒聚度酰：胺 等
2. 装柱：干法装柱法。
将吸附剂装入漏斗或短柱中，轻轻拍 紧或减压拍打或从顶端挤压，直至吸 附剂紧密，最后变得坚硬。吸附剂的 高度一般不超过5cm。
3，吸附剂用量：
（1）对于微量分离，样品＜100mg,可采用直径 为0.5～1cm色谱柱或漏斗，吸附剂高度为5cm， 一般固定相用量为10～15：1倍，如图4-a,可在 小试管中收集流分。
1 9 7 9 年 美 国 Targett.NM 将 该 法 命 名 为 Vacuum liquid chromatography (VLC), 并且详细报道了实验装置和操作方法。
从此以后，VLC便逐渐为广大化学家所 接受，并且在实验装置上作了进一步改 进。
一、VLC特点
VLC 实 质 上 是 柱 色 谱 ， 它 综 合 了 制 备 薄 层 （Preparative PTLC）和真空抽滤技术。
由于经典的柱层析费时费力，需要大量的固定 相和洗脱液，工作效率低，为此人们相继建立 了离心薄层、 VLC、 FCC等快速层析分离的 方法。其中VLC在天然产物分离中应用最多。
该法1969年由澳大利亚Coll J.C提出，1977年 首次应用于分离澳洲软珊瑚中2个新的二萜化
合物(Cembrenoids).
第一节 真空液相色谱技术
Vacuum Liquid Chromatography
真空液相色谱法，简称VLC，也称减压液相色 谱法。
是近几年来国外实验室迅速发展起来的新技术， 它是利用柱后减压使洗脱剂迅速通过固定相从 而很好的分离样品的色谱技术。
VLC具有快速，简易，高效，价廉等优点，目 前已成功的应用于有机制备以及天然产物如萜 类，类酯，双萜及多种生物样品的分离。
为避免每一流分拆卸漏斗，可采用图B的方 法，该抽滤甁底部为磨口，减去负压后，更 换接受甁。
六、应用实例
1. VLC 法可用雀花碱)于220℃， 0．1 mmHg下 发生裂解反应，生成 Pyrodelphine (焦翠雀 灵)．两者的混台物用甲苯：丙酮＝24：1洗脱， 得到896mg Pyrodelphinines; 甲苯：丙＝19：1 洗脱，得到108 mg Delphinine．分离全程仅仅 花费2小时．
B．可也采用固体上样法。即先将样 品溶于极性溶剂，加入5～10份吸附 剂，旋转蒸发至干后，加到吸附剂的 表面上，然后进行洗脱。
四，VLC流动相选择
与柱层析相同，先用TLC来选择条件。VLC更 适用于梯度洗脱，可用二元，三元混合溶剂系 统。一般先用极性较小溶剂，如石油醚、正己 烷 、 环 己 烷 ， 然 后 逐 渐 加 大 极 性 （ CH2Cl2、 Et2O、AcOEt、CH3OH）
极性溶剂的增加开始要缓慢（1%，2%，3% 等），然后增加的幅度可逐渐增大（5% 10% 20%等），通常收集20～25个流分可将所有成 分洗脱。
五、洗脱与收集
用适当溶剂系统洗脱或用梯度洗脱 （gradient elution）。
在常压下，加入溶剂后，将柱抽干，收集为 一个流分。真空度要求20～70mmHg；抽干 后再更换溶剂和容器，重复以上操作，并用 TLC跟踪每一个流分的分离情况（先摸一摸 再行动）。
第五章 减压柱色谱 分离技术
为加快柱分离的速度和/或增加分离 度，通常采用在柱前加压和柱后减压 的方法进行柱层析与分离。 —柱前加压法通常称为加压柱色谱 —柱后减压法通常称为减压柱色谱
第一节 真空液相色谱技术 Vacuum Liquid Chromatography 第二节 半干柱液相色谱 Semi-Dry Column Chromatography SDC
三、上样
放掉真空后，常压下加入低极性 溶剂于吸附剂表面上，减压使溶 剂均匀流过吸附剂。如有空隙， 需要重装。使柱子抽干后，重复 1～2次，即可准备上样。
A．用低极性溶剂或洗脱剂（如石油醚、 正己烷）溶解样品。常压下小心加入 柱顶端，再加入洗脱剂或溶剂覆盖吸 附剂表面，慢慢减压，使样品在柱顶 端形成样品层。
（2）对于0.5～1.0g样品，柱中装有2.5×4cm高 度的吸附剂较合适。
（3）对于1～10g样品的分离，可在柱中装入 5×5cm的吸附剂。
（4）较大样品分离，最好采用250ml砂芯漏斗中 进行。吸附剂的高度为5cm。（如图b）可用 三角烧瓶收集之。
加大吸附剂与样品比例，可提高分离度。常 用比例为30：1～300：1
VLC不同于常压柱层析和快速柱层析Fcc，因为后 两者洗脱剂是连续的，在操作中不会间断；而VLC 进行溶剂洗脱时，在加洗脱剂后，在柱后减压下全 部抽出，每一次洗脱收集一次，抽干后，再更换溶 剂，并再进行下一个流分的收集，所以在这一点上 VLC与PTLC多次展开极为相似。（展开一次后吹 干，再展）。
FCC采用柱前加压，而VLC采用柱后加压。
VLC可分离样品量达几十克，而FCC只能分离几克。
VLC吸附剂经处理后可反复使用。
二、实验装置与操作
1986年，Coll和Bowden曾介绍过一种 十分简单的用于实验室小规模的减压 液相色谱法装置（图－a,b）。
Pelletier在1986年，介绍可使用于较大规模的分 离的装置（图－2）
2. VLC法用于多种天然化合物的分离
（1）曾有人用VLC法对姜中辛辣成分的分离
先将冷冻干燥的姜粉用丙酮提取，经过一系列溶剂分 配后，得所需部位。
选用一内径为3.5cm的100ml的布氏漏斗内装硅胶60 （40～63μm,Merck公司）9.5g, 高度3cm.
300mg姜提取物的溶液与硅胶60混和，蒸发除去溶剂 后，均匀分布于硅胶柱床表面上，并在样品表面上覆 盖一张与漏斗内径相同的滤纸，缓缓加入25ml的己烷。 待溶剂透过柱床后，开始减压抽干柱床，得第一流分。 继续用极性增大的溶剂（己烷－乙醚－乙醚－甲醇） 洗脱，每份25ml，共得20份洗脱液，利用该法可将姜 醇与姜烯酚完全分开。