实验四 考马斯亮蓝方法和BCA法
BCA法与考马斯亮蓝法
Bicinchoninic acid (BCA )法是近来广为应用的蛋白定量方法。
其原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。
BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nM处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。
与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。
与Bradford 法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。
蛋白测定是在生命科学研究中最广泛应用的方法之一。
在蛋白提纯，电泳，免疫分析，细胞生物，分子生物和其他研究应用时评估蛋白浓度是必需的。
虽然目前有各种不同的蛋白测定方法，但仍然还没有一种测定方法被认为是广泛适合于所有的应用要求。
每种方法都有它的优点和限制。
一般来说，研究中经常需要用到一种以上的蛋白测定方法以排除一些未知的物质的干扰。
大多数蛋白样品可通过比色测定法定量。
在典型的蛋白测定中，化学试剂加入到蛋白样品溶液里产生颜色变化，这一变化可由分光光度计或酶标仪检测，并与已知浓度的蛋白标准曲线作比较。
博士德为大家提供两种蛋白测定手段，每种都有其独特的优点。
如果样品数量较多，可以同时使用两种测定用酶标仪自动检测。
当你选择一种蛋白测定方法时需要考虑两个因素：缓冲液的化学组成和检测的蛋白量。
Commassie法（Bradford法）：原理：在酸性条件，蛋白质与考马斯染料G-250结合，颜色从棕色变为蓝色，在595nm处检测吸光值然后与标准曲线对比，即可计算出待测蛋白的浓度。
BCA法：原理：在碱性条件下，蛋白将Cu++还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫色络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
现对这两种方法进行比较：一、实验材料：细胞总蛋白提取试剂盒（AR0103）M231bca蛋白定量试剂盒（AR0146）Commassie改良增强型蛋白质定量试剂盒（AR0145）二、操作步骤：Commassie法：1.将BSA冻干标准品（10mg/支）用生理盐水或PBS稀释成2000ug/ml，1000 ug/ml,500 ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625ug/ml八个浓度的蛋白标准溶液。
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的具体方法及步骤
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的具体方法及步骤蛋白质浓度测定的方法有很多，考马斯亮蓝测定蛋白质是实验室最常见的一种方式，它利用比色法和色素法混合方法、操作简便，下文介绍了考马斯亮蓝测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作以及注意事项。
实验原理考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465 nm变为595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。
考马斯亮蓝染色法的突出优点是：(1)灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1 mg。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
(2)测定快速、简便，只需加一种试剂。
完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。
由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
(3)干扰物质少。
如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
(2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等。
考马斯亮蓝法——完整版
二、试剂与器材
1. 试剂：
（1）考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml
85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml, 滤纸过滤。最终试 剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250, 4.7%（W/V）乙 醇，8.5%（W/V）H3PO4。
（2）标准蛋白质溶液： 纯的牛血清血蛋白，根据其纯度同0.15mol/L NaCl配制成100
考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5
摇匀，1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色
A595nm
以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
2、样品中蛋白质含量的测定
另取两支干净的试管（做一重复），加入合适浓度的 待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同 上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
双缩脲反应；磷 钼酸－磷钨酸试 剂 被 Tyr 和 Phe 还 原
非蛋白氮（可 用三氯乙酸沉 淀蛋白质而分 离）
硫酸铵； Tris缓冲液； 某些氨基酸
各种嘌吟和嘧 啶； 各种核苷酸
硫酸铵； Tris缓冲液； 甘氨酸； 各种硫醇
用于标准蛋白质 含量的准确测定； 干扰少；费时太 长
用于快速测定， 但不太灵敏；不 同蛋白质显色相 似
2缺点四bradford法的优缺点1由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差在制作标准曲线时最好选用球蛋白为标准蛋白质以减少这方面的偏差
考马斯亮蓝法——完整版
一、基本原理
酸性溶液两者结合，使染料溶液 的最大吸收峰的位置，由465nm变 为595nm，溶液的颜色也由棕黑色 变为兰色。
BCA法与考马斯亮蓝法
Bicinchoninic acid (BCA)法是近来广为应用的蛋白定量方法。
其原理与Lowery法蛋白定量相似，即在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。
BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nM处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。
与Lowery法相比，BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质影响小。
与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受去垢剂的影响。
蛋白测定是在生命科学研究中最广泛应用的方法之一。
在蛋白提纯，电泳，免疫分析，细胞生物，分子生物和其他研究应用时评估蛋白浓度是必需的。
虽然目前有各种不同的蛋白测定方法，但仍然还没有一种测定方法被认为是广泛适合于所有的应用要求。
每种方法都有它的优点和限制。
一般来说，研究中经常需要用到一种以上的蛋白测定方法以排除一些未知的物质的干扰。
大多数蛋白样品可通过比色测定法定量。
在典型的蛋白测定中，化学试剂加入到蛋白样品溶液里产生颜色变化，这一变化可由分光光度计或酶标仪检测，并与已知浓度的蛋白标准曲线作比较。
博士德为大家提供两种蛋白测定手段，每种都有其独特的优点。
如果样品数量较多，可以同时使用两种测定用酶标仪自动检测。
当你选择一种蛋白测定方法时需要考虑两个因素：缓冲液的化学组成和检测的蛋白量。
Commassie法（Bradford法）：原理：在酸性条件，蛋白质与考马斯染料G-250结合，颜色从棕色变为蓝色，在595nm处检测吸光值然后与标准曲线对比，即可计算出待测蛋白的浓度。
BCA法：原理：在碱性条件下，蛋白将Cu++还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫色络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
现对这两种方法进行比较：一、实验材料：细胞总蛋白提取试剂盒（AR0103）M231bca蛋白定量试剂盒（AR0146）Commassie改良增强型蛋白质定量试剂盒（AR0145）二、操作步骤：Commassie法：1.将BSA冻干标准品（10mg/支）用生理盐水或PBS稀释成2000ug/ml，1000ug/ml,500 ug/ml,250 ug/ml,125 ug/ml,62.5 ug/ml,31.25 ug/ml,15.625ug/ml八个浓度的蛋白标准溶液。
考马斯亮蓝法
实验九蛋白质浓度的测定(四)──考马斯亮蓝染色法目的要求学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法。
实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。
此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。
蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10－100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10µg蛋白质。
此反应重复性好，精确度高，线性关系好。
标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。
此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4无干扰。
强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。
Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。
但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。
试剂与器材一、试剂考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。
考马斯亮蓝法测蛋白浓度
考马斯亮蓝法（Bradford)测蛋白浓度考马斯亮兰法：一种蛋白定量法具体操作步骤:（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。
完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。
由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
（3）干扰物质少。
如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。
考马斯亮蓝法测蛋白浓度
考马斯亮蓝法（Bradford)测蛋白浓度考马斯亮兰法：一种蛋白定量法具体操作步骤:（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。
完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。
由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
（3）干扰物质少。
如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量
考马斯亮蓝法测蛋白质含量实验概要bradford法是最常用的蛋白质快速定量方法。
coomassie brilliant blue g-250与蛋白质结合使染料的最大吸收峰由465 nm变为595 nm，溶液的颜色由棕色变为蓝色，595nm波长下吸光度值与蛋白含量成正比。
灵敏度比lowry法高4倍，与bca法相当。
反应迅速，2分钟即可达到平衡并在1小时内保持稳定。
操作简便，只需要一种反应试剂。
实验原理考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue)法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465 nm变为 595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。
主要试剂考马斯亮蓝g-250染色工作液： 10mg考马斯亮蓝g-250粉末溶于5ml 95%乙醇中，彻底溶解后，加入10ml 85%磷酸中，边加边搅拌（市售液体磷酸（h3po4）的质量分数≥85.0%，稠状透明液体，可直接使用，对皮肤有很强的腐蚀作用，建议使用5ml移液枪缓慢吸取使用）蒸馏水稀释至100ml。
后经滤纸过滤后储存于棕色试剂瓶中，避光保存。
长时间不用，可放置于4℃冰箱中保存1年，再次使用还需过滤，加入反应管前需要升至室温，否则虽不影响精度，但测得的od值较低，对仪器要求较高。
标准牛血清白蛋白（bsa）：精确称取4mg bsa粉末，溶于1ml 0.15mol/l nacl溶液配制成4mg/ml标准蛋白溶液，-20℃保存。
（如用1cm比色皿测定，建议精确称取40mg bsa 粉末，溶于10ml 0.15mol/l nacl溶液配制成4mg/ml标准蛋白溶液，分装成小管，-20℃保存。
实验四 考马斯亮蓝方法和BCA法
MicroBCA：0.5-20 mg/ml；
二、光学检测
1、荧光检测：邻苯二甲醛（OPT）法，强还原剂与氨基酸/肽反应产生强荧光性 化合物，激发波长为340nm,荧光波长为455nm，可用于氨基酸自动分析系统。
2、紫外光检测：10 mg/ml （芳香族氨基酸残基对280nm的紫外光有最大吸收）
三、电泳或免疫化学检测 ：如PAGE、Western Blot、ELISA等
①实验对测定所要求的灵敏度和精确度； ②蛋白质的性质； ③溶液中存在的干扰物质； ④测定所要花费的时间
实验内容
1、制备蛋白样品； 2、分别制作两种测定方法的标准曲线； 3、分别用两种方法测定样品。
实验流程
1 制备总蛋白样品：
小白菜（梗+叶）10 g，碾成匀浆，加水10 ml后继 续碾10 min，倒入离心管中，另加20 ml水将剩余物洗入两 个50 ml离心管，称重平衡后10000 r/min离心10 min。小心 地将少量上清（约15～20 ml）倒入小烧杯，取烧杯中上 清10 ml定容到100 ml，待测。
2、蛋白质样品和呈色剂都不应有沉淀，有沉淀应过 滤除去
3、染料与蛋白质结合后，形成的蓝色复合物易轻度 沾附试管壁或比色皿，每次使用不能用有着色的 比色皿。使用完后应立即用95%乙醇清洗干净
标准曲线的制作
吸光值(A562)
蛋白质标准曲线
0.14 0.12
0.1 0.08 0.06 0.04 0.02
用量筒量取剩余上清的体积，计算上清总体积。
Bradford法 实验表格
X’+Y’=1ml
管号
ml 样品
1 2 3 4 5 6 7 C 白菜抽提液
《生物化学》实验指导(8个实验)
《生物化学》实验指导(8个实验)生物化学实验指导吕杰编著新疆大学资源与环境科学学院生态学教研室内容介绍《生物化学实验指导》是新疆大学资源与环境科学学院《生物化学》课程组的教师在参考国内重点院校、科研院所的生物化学实验与实习教材的基础上，结合教师的教学经验汇编而成。
该实习指导围绕教学大纲设计了8个实验内容。
目目录实验一氨基酸纸层析4实验二DNS-CL法测定N末端氨基酸5实验三考马斯亮蓝法测定蛋白质的浓度7实验四酪蛋白的制备8实验五葡萄糖标准曲线的绘制10实验六酵母蔗糖酶的提取及活力测定12实验七酵母RNA的分离及组分鉴定14实验八维生素C的定量测定16 实验一一氨基酸纸层析一、实验目的1、通过氨基酸的纸层析分离，学习纸层析的基本原理和操作方法。
二、实验原理纸层析：是以滤纸作为支持物的分配层析法，是20世纪40年代发展起来的一种生化分离技术。
由于设备简单，操作方便，所需样品量少，分辨力较高等优点而广泛的用于物质的分离，并可进行定性和定量的分析。
缺点是展开时间较长。
分配层析法：是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的的一种实验方法。
在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数是一个常数即=溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。
溶剂系统：由有机溶剂和水组成，水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相，有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相，由于混合液中各种氨基酸的分配系数值不同，其在两相中的分配数量及移动速率（即迁移率Rf值）就不同，从而达到分离的目的。
三、实验材料、仪器和试剂：1、实验材料：标准氨基酸溶液2、仪器:层析缸，层析纸，毛细管，天平，吹风机等。
3、、试剂：（1）氨基酸标准溶液：0.1M丙氨酸和0.1M谷氨酸标准溶液。
（2）溶剂系统：正丁醇：甲酸：水=15：3：2（体积比）摇匀；（3）0.1%的茚三酮丙酮溶液；茚三酮15克，丙酮100毫升四、实验步骤：纸层析(1)取一长方形滤纸，在滤纸纵向对应的两边距边沿2cm处，用铅笔轻轻的各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔2cm画一个+作为点样位置，共5个点。
实验四 蛋白质的定量测定方法
1.实验器材
分光光度计；试管；移液管；容量瓶。
2.实验试剂
(1)标准蛋白质溶液：称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水中并定容至 100mL，制成100μg/mL的溶液。 (2)考马斯亮蓝G250 试剂：称取100mg考马斯亮蓝G250，溶于50mL 95％乙醇中，加入 85%(m/v)的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液可在常温下 放置一个月。 (3)样品溶液：配制约50μg/mL的牛血清白蛋白溶液作为样品。
【实验材料】
1.实验器材 100毫升容量瓶2只；移液管1毫升4支，5毫升2支；分光光度计。 2.实验试剂 (1)Fo1in酚试剂甲：将lg碳酸钠溶于50mL0.lmol／L氢氧化钠溶液中， 再把0.5g硫酸铜(CuSO4∙5H2O)溶于100mL1％酒石酸钾(或酒石酸钠)溶液， 然后将前者50mL与后者lmL混合。混合后1日内使用有效。 (2)Folin酚试剂乙：在1.5L容积的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠 (Na2WO4∙2H2O)、25g钼酸钠(Na2MoO4∙2H2O)、700mL蒸馏水、50mL85％磷酸 及100mL浓盐酸，充分混匀后回流10h。回流完毕，再加150g硫酸锂、50mL 蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴，冷却后 定容到1000mL。过滤，如显绿色，可加溴水数滴使氧化至溶液呈淡黄色。 置于棕色瓶中暗处保存。
1.实验器材 实验器材 分光光度计；恒温水浴槽；移液管；微量进样器；试管架和试管。 2.实验试剂 实验试剂 (1)BCA试剂的配制 ①试剂A，1L：分别称取10gBCA(1%)，20gNa2CO3·H2O(2%)，1.6g Na2C4H4O6·2H2O(0.16%)，4gNaOH(0.4%)，9.5gNaHCO3(0.95)，加水至1L， 用NaOH或固体NaHCO3调节pH值至11.25。 ② 试剂B，50mL：取2gCuSO4·5H2O(4%)，加蒸馏水至50mL。 ③ BCA试剂：取50份试剂A与1份试剂B混合均匀。此试剂可稳定一周。 (2)标准蛋白质溶液：称取40mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水中并定容至100mL， 制成400µg/mL的溶液。 (3)样品溶液：配制约50µg/mL的牛血清白蛋白溶液作为样品。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量实验步骤
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实验四 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
5.0
充分振荡混匀后，两分钟于595nm处比色。
以蛋白质质量为X轴，吸光度A为Y轴做图，绘制标准曲线，求出样品蛋白质含量。
（2）取9支试管，编号为0～7号和样品管。0 号管加入1.0ml水，1～6号和样品管依次加 入对应的蛋白稀释液与水。然后各加入 5.0ml蛋白质染色液。充分振荡混匀后，两 分钟于595nm处比色。以蛋白质浓度为X轴， 吸光度A为Y轴做图，绘制标准曲线，求出 样品蛋白质含量。
此外，有BCA法和胶体金检测法。
实验目的
• 掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原 理和方法。 • 掌握标准曲线的制作方法。 • 进一步熟悉分光光度计的原理和操作。
考马斯亮蓝法
Bradford
1976年由Bradford建立的考马斯亮蓝法， 是根据蛋白质与染料相结合的原理设计 的。这种方法是目前灵敏度最高的蛋白 质测定方法之一。
蛋白质浓度=1.45×A280－0.74×A260 (mg/ml)
干扰物质： 嘌呤、嘧啶、核酸等 （可适当校正核酸的干扰） 缺点： 准确度较低、干扰物质多 优点： 简便、灵敏（50-100 μg） 、快速（5-10 min） 不消耗样品，测定后仍能回收使用 此法适用于只需测定蛋白质浓度的变化，而不 需知道其绝对值。
优点： 灵敏度高 ~ 5μg 这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一，应用 比较广泛。
（五）考马斯亮蓝法（Bradford法）
原理：
考马斯亮蓝 G-250 染料在酸性溶液中与蛋白质 结合，使染料的最大吸收峰的位置由 465nm 变为 595nm ， 溶 液 的 颜 色 也 有 棕 黑 色 变 为 蓝 色 ， 在 595nm下测定的吸光度值与蛋白质的浓度成正比。
BCA法和考马斯亮蓝法测蛋白质浓度
分光光度法介绍分光光度法是利用溶液中特定溶质的光吸收测定其浓度的方法，其基本原理是根据Lambert 和Beer 定律。
一 Lambert 定律当一束平行单色光垂直照射于一均匀物质溶液时，溶液将吸收一部分光能，使光的强度减弱。
若溶液的浓度不变，则在溶液中的光程越长，光线强度的减弱也越显著。
设：入射光强度为I 0，透射光强度为I ，L 代表光在溶液中的光程。
lg I0I=K 1L K 1是常数，受光线波长，溶液性质，溶液浓度影响。
二 Beer 定律当一束光通过一溶液时，光能被溶液介质吸收一部分，若光程不变，则溶液的浓度越大，光吸收越强，透射光强度的减弱也越显著，光线减弱的比例与溶液浓度呈正比。
lg I0I=K 2C K 2为吸收系数，是常数。
溶液对光吸收的强弱与溶液浓度C 成正比。
三 Lambert-Beer 定律 将以上两个定律合并： lg IoI=KCL 令A=lg Io I T= IIo 则A=KCL=-lgTT 为透光度，A 为吸光度，K 为消光系数四 待测样品浓度的计算 A 标=KC 标L A 样=KC 样L由于是同一物质及相同的光程，则：A 样/A 标=KC 样L/KC 标L=C 样/C 标 即：C 样=（A 样/A 标）*C 样故已知标准溶液的浓度及吸光度，依据公式可计算出待测样品溶液的浓度。
一实验名称： BCA法测定蛋白质含量二实验原理：BCA即二奎碄甲酸。
在碱性条件下，蛋白的肽键结构将二价铜离子还原为亚铜离子，亚铜离子与BCA试剂形成稳定的紫色络合物，并在562nm处有最大的光吸收值，该复合物颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，故可通过吸收值的大小对蛋白质进行定量。
三实验步骤：A 标准品的稀释：将9支干燥的1.5ml离心管编号，按表加入下列试剂：BCA法标准曲线和样品测定1.2ml离心管ddH2O（μL）2mg/mLBSA（μL）蛋白质终浓度（μg/mL)A 0 50μL标准品2000B 125 375μL标准品1500C 325 325μL标准品1000D 175 175μL B管混合液750E 325 325μL C管混合液500F 325 325μL E管混合液250G 325 325μL F管混合液125H 400 100μL G管混合液25I 400 0 0=BlankB 配置BCA工作液：依据样品数量，将试剂A和试剂B按体积比50:1配制适量BCA工作液，并充分混匀。
蛋白质含量测定-考马斯亮蓝法
蛋白质含量测定 ——考马斯亮蓝法
精选课件
1
实验目的
1. 掌握考马斯亮蓝法测定样品蛋白 含量的原理和操作步骤;
2. 进一步熟练分光光度计的原理和 操作方法;
3. 掌握标准曲线的制作和使用。
精选课件
2
双缩脲（NH3CONHCONH3）：凡具有两个酰 胺基或两个直接连接的肽键，都有双缩脲反应。 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。
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15
A238
1 0.8 0.6 0.4 0.2
0 0
-0.2
y = 0.0018x - 0.0125 R 2 = 0.9954
100
200
300
400
500
600
蛋白质浓度/(μg/ml)
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16
四.注意事项
（1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后 的5-20 min内测定光吸收，因为再这段时间 内颜色最稳定。
用标准蛋白质为横坐标，用吸光值A595为纵 坐标，作图 ，即得一标准曲线。由此标准曲 线，根据测出的未知样品吸收值，即可查出样 品蛋白质含量。
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标准曲线的制作
坐标纸法
电脑软件法
精选课件
11
标准曲线的制作-坐标纸
(1)标准液浓度的选择：在制备标准曲线时，标准液浓 度选择一般应能包括待测样品的可能的最低与最高值， 可选择5种浓度。浓度差距最好是成倍增加或等级增加， 并应与被测液同样条件下显色测定。
Folin—酚试剂法（Lowry法） Folin—酚试剂 中的磷钼酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残 基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）， 在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。 该法的灵敏度是双缩脲法的100倍.
蛋白质的定量分析方法
蛋白质的定量分析方法1．蛋白质的常规检测方法1.1 凯氏定氮法一种最经典的蛋白质检测方法。
原理：样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨，氨又与硫酸作用变成硫酸铵。
然后加碱蒸馏放出氨，氨用过量的硼酸吸收，再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。
优点：范围广泛、测定结果准确、重现性好。
缺点：操作复杂费时、试剂消耗量大。
1.2 双缩脲法常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质检测。
原理：双缩脲是三分子的脲经180C左右加热，放出一份子氨后得到的产物，在强碱性溶液中，双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物（肽链中的氮原子和铜离子配价结合），称为双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅和蛋白质浓度成正比，因此可用来测定蛋白质含量。
优点：较快速、干扰物质少、不同蛋白质产生的颜色深浅相近。
缺点：灵敏度差、三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA 等会干扰该反应。
1.3 Folin 酚试剂法原理：与双缩法大体相同，利用蛋白质中的肽键和铜离子结合产生双缩脲反应。
同时也由于Folin 酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸试剂被蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色的钼蓝和钨蓝的混合物。
在一定条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比，由此可测定蛋白质的含量。
优点：灵敏度高、对水溶性的蛋白质含量的测定很有效。
缺点：费时，要精确控制操作时间；Folin 酚试剂的配制比较繁琐，且酚类和柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油、还原剂（二硫代苏糖醇、巯基乙醇）、EDTA 和尿素均会干扰反应。
1.4 紫外吸收法原理：蛋白质中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基使其在280nm 处具有紫外吸收，其吸光度与蛋白质含量成正比。
此外，蛋白质溶液在280nm 处的吸光值与肽键含量成正比。
利用一定波长下蛋白质溶液的吸光值与蛋白质含量的正比关系可以测定蛋白质含量。
优点：简便、灵敏、快速、不消耗样品，测定后能回收。
缺点：测定蛋白质含量的精确度差、专一性差；干扰物质多，若样品中含有嘌呤、嘧啶等能吸收紫外光的物质会出现较大的干扰。
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缺点：由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford 法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差；去污剂、甘油、乙酸和0.1 M的NaOH会 干扰此法的测定。
BCA法 原理
BCA（2,2-联喹啉-4,4-二甲酸二钠， Bicinchoninic acid）能与含二价铜离子的硫酸铜组 成BCA工作试剂。在碱性条件下，二价铜离子可 以被蛋白质还原成一价铜离子，一价铜离子与 BCA相互作用，两分子的BCA螯合一个铜离子， 形成紫色复合物。在562nm处显示强吸光性。在 一定浓度范围内，复合物的光密度与蛋白质含量 呈线性关系。
注意
1、自己制备的蛋白质溶液测定含量时，注意稀释度 控制在测定范围内
2、蛋白质样品和呈色剂都不应有沉淀，有沉淀应过 滤除去
3、染料与蛋白质结合后，形成的蓝色复合物易轻度 沾附试管壁或比色皿，每次使用不能用有着色的 比色皿。使用完后应立即用 95%乙醇清洗干净
值(A562) 光
0.14 0.12
0.1 0.08
吸 0.06
0.04
0.02
0
0
蛋白质标准曲线
0.2 0.4 0.6 0.8
1
1.2
浓度(mg/ml)
1、比较两种方法测得的小白菜中蛋白质的含量 （单位：mg/ml），说明有什么不同（混合蛋 白质溶解物中可能含有什么物质）？
2、为什么有些人会把三聚氰胺加入到奶粉中？哪 种蛋白质含量的测定方法不受三聚氰胺的影响？
考马斯亮蓝 G250（Coomassia Brilliant Blue G-250）能在酸性溶液中 与蛋白质的疏水区结合，最大光吸收 峰从 405nm变为 595nm，溶液的颜色 也从棕黑色变为蓝色，所显示蓝色至 少在 1 小时内是稳定的。在一定浓度 范围内，复合物的光密度与蛋白质含 量呈线性关系。
MicroBCA：0.5-20 mg/ml；
二、光学检测
1、荧光检测：邻苯二甲醛（OPT）法，强还原剂与氨基酸/肽反应产生强荧光性 化合物，激发波长为340nm,荧光波长为455nm，可用于氨基酸自动分析系统。
2、紫外光检测：10 mg/ml （芳香族氨基酸残基对280nm的紫外光有最大吸收）
三、电泳或免疫化学检测 ：如PAGE、Western Blot、ELISA等
X' X1 X2 X3 Y' Y1 Y2 Y3 5555
混匀，室温 放置10min
吸光度值 （A595）
每管蛋白质的 含量（mg）
C为未知浓度蛋白质溶液 （ 10-100 mg/ml）
管号
ml
1
样品
标准蛋白质 100 mg/ml
0
H2O
1
BCA工作液 2
吸光度值 （A562）
每管蛋白质 含量 (mg)
①实验对测定所要求的灵敏度和精确度； ②蛋白质的性质； ③溶液中存在的干扰物质； ④测定所要花费的时间
实验内容
1、制备蛋白样品； 2、分别制作两种测定方法的标准曲线； 3、分别用两种方法测定样品。
实验流程
1 制备总蛋白样品：
小白菜（梗+叶）10 g，碾成匀浆，加水10 ml后继 续碾10 min，倒入离心管中，另加20 ml水将剩余物洗入两 个50 ml离心管，称重平衡后10000 r/min离心10 min。小心 地将少量上清（约15～20 ml）倒入小烧杯，取烧杯中上 清10 ml定容到100 ml，待测。
优点：准确灵敏,5-200 mg/ml; 测定快速简便；经济实用; 干扰物质少；检测不同 蛋白质分子的变异系数远小于Bradford法
缺点：与荧光蛋白质定量等方法相比，属于化学呈色法的BCA法检测灵敏度尚 不够。蔗糖、尿素、NH4+和EDTA影响测定结果。
每种蛋白质测定法各有其优缺点
----在选择方法时应考虑的因素
3、对于难溶于水的蛋白（如毛发等）如何测定蛋 白含量？
实 验 四：蛋白质的定量测定
考马斯亮蓝法（Bradford ）和BCA法
实验目的及要求
? 了解考马斯亮蓝法（Bradford法）和BCA法 的原理及干扰因素
? 掌握标准曲线法测定蛋白质含量的方法
蛋白质检测及含量的测定
一、化学检测
1、凯氏定氮法（Kjeldahl)：0.2~1.0 mg/ml (平均含氮量16%) 2、双缩脲法（Biuret）：1~10 mg/ml （肽键在碱性溶液中与铜离子络合呈紫红色） 3、Folin-酚试剂法（Lowry）：20-250 mg/ml （干扰因素多） 4、考马斯亮蓝法（Bradford）：10~100 mg/ml （受蛋白质内氨基酸组成影响较大） 5、BCA法（bicinchoninic acid二喹林甲酸）：5-200 mg/ml；
BCA法 实验表格
2 3 4 5 6 C'
X'+Y'=1ml
白菜抽提液
0.1 0.2 0.4 0.8 1 X' X1' X2' X3' 0.9 0.8 0.6 0.2 0 Y' Y1' Y2' Y3' 2 2 22222 22
混匀，60度温育30min，冷却至室温
C为未知浓度蛋白质溶液 （ 5-200 mg/ml）
用量筒量取剩余上清的体积，计算上清总体积。
Bradford法 实验表格
X'+Y'=1ml
管号
ml 样品
1234567
标准蛋白质 100 mg/ml
0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1
H2O 考马斯亮蓝 G-250溶液
1 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 5555555
C 白菜抽提液