考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的具体方法及步骤

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考马斯亮蓝法测定蛋白浓度

3.测定荧光强度。使用荧光光度计测定样品的荧光强度。
4.计算蛋白浓度。根据荧光强度的值，使用标准曲线法计算出蛋白浓度。
考马斯亮蓝法是一种快速、准确的测定蛋白浓度的方法，广泛应用于生物学研究、药物分析、食品工业等领域。该方法测定结果精确，但受到样品纯度、测量温度、pH值等因素的影响。因此，在使用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度时，应注意控制样品的质量，保证测量的准确性。
此外，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度时还应注意：
样品的处理应尽量简单，以免影响测定结果的准确性。
考马斯亮蓝溶液的配制应精确，以免影响测定结果的准确性。
在测量过程中应保持室温，以免影响测定结果的准确性。
考马斯亮蓝法是一种常用的测定蛋白浓度的方法。该方法的原理是：蛋白质中含有苯并嘧啶基团，当蛋白质与考马斯亮蓝发生反应时，会产生蓝色的荧光。因此，可以根据荧光的强度来测定蛋白浓度。
测定蛋白浓度的具体步骤如下：
1.准备样品。取一定量的蛋白样品，加入适样品中，搅拌均匀。

蛋白质浓度测定(考马斯亮蓝法)

三、主要仪器：
（1）分析天平、台式天平（2）具塞刻度试管（3）吸管（4）研钵（5）漏斗（6）离心机、离心管（7）容量瓶（8）微量取样器（9）分光光度计
四、试剂：
（1）标准蛋白质溶液称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成 100 μg／ml的原液。
（2）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂称取100mg考马斯亮蓝G－ 250，溶于50ml 90％乙醇中，加入 85％（m／v）的磷酸 100ml，最后用蒸馏水定容到 1000ml。
（1）准确称取约200mg新鲜绿豆芽下胚轴，放入研钵中，加入5ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆，离心（4000r／min，10min），将上清液倒入 10ml容量瓶，再向残渣中加入2ml蒸馏水，悬浮后再离心10min，合并上清液，定容至刻度。（2）另取2支具塞试管，准确加入0.5 ml样品提取液，再加入0.5 ml蒸馏水，4ml考马斯亮蓝G－250试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线1号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。
剂法（Lowry法）
2．制作标准曲线及测定样品时，为什么要将各试管中溶液纵向倒转混
合？（将各试管中溶液纵向倒转混合目的是使反应充分，并且使整个反应液均一，否则在比色测
定时，结果会有较大偏差，使ห้องสมุดไป่ตู้准曲线的制作不标准，后续的测定结果就不可靠。）
3．如何正确使用分光光度计？
八、实验报告：按常规。
分光光度计的使用与注意事项
1. 接好电源线。 2. 启动电源开关，仪器显示“F7230”，预热20分钟（要打开比色皿盒盖）。 3.（1）设置年、月、日、时、分：按“CLEAR”键，仪器显示“YEA”进入年份设置，按数字键，输入

4 蛋白质浓度测定(考马斯亮蓝结合法)

实验三、蛋白质浓度测定
（考马斯亮蓝结合法）
六、注意事项：
比色出现蓝色应在2 min～l h内完成。（蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合的
反应十分迅速，在2min 左右反应达到平衡；其结合物在室温下1h 内保持稳定。因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低。）
七、思考题：
质定量法？（微量凯氏（Kjeldahl）定氮法、双缩脲法（Biuret法、紫外吸收法、Folin—酚试
分光光度计的使用与注意事项
5. 调节波长旋纽使波长移到所需之处。 6. 四个比色皿，其中一个放入参比试样（装量要合适），其余三个放入待测试样。将比色皿放入样品池内的比色皿架中，夹子夹紧盖上样品池盖。 7. 将参比式样推入光路（注意听‘咔嚓’声），按‚100%t‛键，至显示 ‚T100.0‛（调100）。 8. 打开样品池盖，按‚0%t‛键，仪器显示‚T0.0‛（调零）。 9. 盖上样品池盖，按‚100%t‛键，至显示‚T100.0‛（调100）。 10. 然后将待测试样推入光路，显示试样的‚T‛值（测定）。 11. 如需测定‚A‛或‚C‛，则‚MODE‛键转换即可。 12. 如果要想将待测试样的数据记录下来，只要按‚PRINT‛键即可（打印）。
实验三、蛋白质浓度测定
（考马斯亮蓝结合法）
一、实验目的：
蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G－250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。通过本实验学习考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。

(完整word版)考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程

考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程：该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。

如核糖核酸酶或溶菌酶。

去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。

如TritonX-100、SDS、NP-40等。

1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。

2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。

如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。

通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。

3．将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。

4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。

5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。

染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。

注意，显色反应不得超过30min．6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。

注意：考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。

待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。

适用范围考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。

当考马斯亮蓝G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从465nm 变为595nm。

在考马斯亮蓝G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝G-250 从吸收峰为465nm 的形式转变成吸收峰为595nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。

一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在595nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。

考马斯亮蓝法测蛋白质含量

尺度曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量一、尺度曲线一般用分光光度法测物质的含量，先要制作尺度曲线，然后根据尺度曲线查出所测物质的含量。

因此，制作尺度曲线是生物检测分析的一项基本技术。

二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin-酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—尺度曲线制作（一）、试剂：1、考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。

最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。

2、尺度蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。

（二）、器材：1、722S型分光光度计使用及原理（）。

2、移液管使用（）。

（三）、尺度曲线制作：1、1）、利用尺度曲线查出回归方程。

2）、用公式计算回归方程。

3）、或用origin作图，测出回归线性方程。

即A595nm=a×X( )+6一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。

4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。

（四）、蛋白质含量的测定：样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操纵步调1操纵，测出样品的A595nm，然后利用尺度曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。

一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。

（五）、注意事项：1、玻璃仪器要洗涤干净。

2、取量要准确。

3、玻璃仪器要干燥，防止温度变更。

4、对照：用被测物质以外的物质作空白对照。

药品的配制（磷酸缓冲液的配制）一、药品的配制步调（一）、实验准备：1、准备所需的药品和玻璃仪器。

考马斯亮蓝结合法

牛奶（酸奶）和豆浆中蛋白质浓度的测定一、目的学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度。

二、原理考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。

考马斯亮蓝G250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。

当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰改变为595nm，考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物的高消化效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。

在一定范围内，考马斯亮蓝G250—蛋白质复合物成色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系。

故可以用于蛋白质浓度的测定。

三、实验器材1..试管8支2.吸管3. 722型分光光度计4.容量瓶1000ml5.量筒100ml四、实验试剂1.0.9%NaCl溶液2.标准蛋白液：牛血清白蛋白（0.1mg/ml),准确称取牛血清白蛋白0.2g，用0.9%NaCl溶液溶解并稀释至2000ml3.染液：考马斯亮蓝G250(0.01%),称取0.1g考马斯亮蓝G250溶于50ml95%乙醇中，再加入100ml浓磷酸（即市售的质量百分浓度为85%的磷酸），然后加蒸馏水定容到1000ml。

4.样品液：取牛血清白蛋白（0.1mg/ml)溶液，用0.9%NaCl稀释至一定浓度。

五、操作1.标准曲线的制备取7只干净试管，按表1进行编号并加入试剂。

混匀，室温静置3min，以第一管为空白，于波长595nm处比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（ug/ml)作为纵坐标作图得标准曲线。

表1 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度——标准曲线的制备试剂管号1（空白）2 3 4 5 6 7标准蛋白液/ml0.9%NaCl/ml考马斯亮蓝染液/ml 蛋白质浓度/(ug/ml)——1.04.00.10.94.0100.20.84.0200.30.74.0300.40.64.0400.60.44.0600.80.24.080A595nm2.样液的测定另取一支干净试管，加入样品液1.0ml及考马斯亮蓝染液4.0ml，混匀，室温静置3min,于波长595nm处比色，读取吸光度，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。

考马斯亮蓝测蛋白

考马斯亮蓝测蛋白法
试剂：蛋白标准液母液：
精确称取10mg牛血清白蛋白(BSA)溶解于50mL生理盐水中得0.2mg/mL标液；取
0.2mg/mL标液1mL+19mL生理盐水得10μg/mL溶液，配置1-10μg/mL一系列浓度；
考马斯亮蓝G―250染料试剂：
称10mg考马斯亮蓝+5mL 95%乙醇+12mL 85%的磷酸，定容至100mL。

步骤：（1）制作标准曲线:
① 4.5 mL样品（按照标线进行一定的稀释后的样品，可提前离心PBS清洗去除
培养基）加入0.2 mol/L NaOH溶液0.5 mL；
②100℃沸水浴10min并10,000rpm离心10min；
③取4 mL上清再加配制的考马斯亮蓝试剂1 mL，混合静置5 min；
④测试450nm与595 nm处吸光值，以595/450的值做回归
（2）样品中蛋白测定：
将取样的第二组5mL溶液离心分离上清液测PH，底下沉积物加入4.5mL蒸馏水，然后按照步骤①进行测试即可。

试剂：
①Tris－HCl缓冲液（0.05mol/L）：称取三羟甲基氨基甲烷0.6037g，加0.1mol/L的
HCl 17.2mL，蒸馏水定容至100mL，pH为8.4；
②氯化三苯基四氮唑（TTC）（0.1％）：称取0.05gTTC溶于50mL蒸馏水中，即成
0.1％的TTC溶液（每周新配）；
③亚硫酸钠（0.36％）：称0.3657g亚硫酸钠溶于100mL蒸馏水中；
④丙酮、甲醛（分析纯）；
⑤10%硫化钠：称取10g硫化钠（分析纯），定容至100mL棕色容量瓶中；
⑥0.1mol／L葡萄糖溶液：称取1．98179葡萄糖(分析纯)溶于100mL蒸馏水。

考马斯亮蓝法测蛋白质含量的流程

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蛋白质含量测定法考马斯亮蓝法

蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法[实验目的]学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量的方法[实验原理]（蓝色）变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250m ax λ−−→−+-[器材与试剂]器材722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支试剂1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA ），配制成1.00mg/ml 。

2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。

[实验方法]标准方法1.取10支试管，分别编号后按表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。

每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。

2.加完染料20min 后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。

3.用标准蛋白浓度（mg/ml ）为横坐标，用A 595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。

根据测得的未知样品的A 595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。

根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g 鲜重)=）测定时提取液体积（）样品重（）提取液总体积（）查得的蛋白质（ml g ml g g ⨯⨯/μ以蛋白标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

计算出回归方程。

如Y=aX+b让后把待测样品的吸光值代入回归方程，算出待测样品浓度 SDS 干扰实验1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。

每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。

2.加完染料20min 后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。

[实验数据与结果分析]（一）标准方法的数据和图表1 考马斯亮蓝标准法实验表格根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。

考马斯亮蓝法测蛋白浓度

考马斯亮蓝法（Bradford)测蛋白浓度考马斯亮兰法：一种蛋白定量法具体操作步骤:（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。

1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。

这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。

这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。

经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。

在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。

Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。

这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。

（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。

完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。

由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。

因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。

（3）干扰物质少。

如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。

考马斯亮蓝测定蛋白质

植物总蛋白含量测定
植物总蛋白的测定采用Bradford于1976年建立的考马斯亮兰（Coomassie Brilliant
Blue）染色法。

试剂配制：
1考马氏亮蓝G－250染色液：
称取100mg考马氏亮蓝G－250溶解于50毫升95％的乙醇中，加入100毫升85％的磷
酸，用蒸馏水稀释到1升。

2蛋白标准（0.1mg/ml）：
准确称取100.0mg牛血清白蛋白，在100ml容量瓶中加生理盐水至刻度，溶后分装于
1ml带盖eppendorf管中，-20℃冰箱保存。

3标准曲线绘制（1mg/ml）
按下表操作，在试管中分别加入0、10、20、40、60μl蛋白标准溶液，用水补足到1ml，
加入5ml考马斯亮兰染色液，混匀后在595nm波长比色，读出吸光度，以各管的标准
蛋白浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘制标准曲线。

编号 1 2 3 4 5 蛋白标准(ml) 0 0.01 0.02 0.04 0.06
蒸馏水(ml) 1.0 0.99 0.98 0.96 0.94
染色液(ml) 5 5 5 5 5 4 称取一定质量的植物组织，研磨后，加入水冲洗至小试管中，后定容至1mL。

加入5ml
考马斯亮兰染色液，混匀后在595nm波长比色，根据吸光度和标准曲线测定蛋白质
浓度，然后根据所称质量计算出单位质量植物组织的蛋白质总量。

注：（1）考马斯亮蓝为G-250，不是R-250。

（2）植物组织质量具体称取多少，要通过预实验测定。

一般比色时的吸光度值在
0.2-0.8为宜。

Bradford法测蛋白质浓度

Bradford法测蛋白质浓度一、实验目的配制一组浓度分别为0.10mg/ml ，0.08mg/ml，0.06mg/ml ，0.04mg/ml ，0.02mg/ml，0 mg/ml 的牛血清蛋白（BSA）溶液，测定这组溶液的吸光度，得到蛋白质浓度对吸光度的一条标准曲线。

测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线得到蛋白质的浓度。

二、实验原理考马斯亮蓝（CBB）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。

考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有最大该法试EP管中，再分别加入900ul，920ul，940ul，960ul，980ul的磷酸缓冲溶液（PBS）配成1ml的溶液，震荡使溶液混合均匀。

得到一组浓度分别为1.0mg/ml ，0.8mg/ml，0.6mg/ml ，0.4mg/ml ，0.2mg/ml 的BSA溶液。

移液枪分别移取100ul刚配好的一组BSA溶液，置于1.5ml的EP管中，各加入900ul的PBS 溶液，震荡使溶液混合均匀。

得到一组浓度分别为0.10 mg/ml ，0.08mg/ml，0.06mg/ml ，0.04mg/ml ，0.02mg/ml的BSA溶液。

另外量取1ml的PBS溶液（BSA溶液浓度为0 mg/ml）作对照试验。

用移液枪分别移取50ul配好的一组BSA溶液，滴加到孔板中，再分别加入200ul的考马斯亮——仅供参考蓝（CBB）。

静置10min后，用酶标仪测得这组BSA溶液的吸光度。

四、实验数据及处理测得的BSA溶液的吸光度如下：用orgin作出吸光度对BSA浓度的关系曲线。

五、实验结果分析得到的吸光度对BSA浓度的关系曲线为y=3.09x+0.6807，R2=0.9541。

可以看出吸光度—浓度——仅供参考。

实验考马斯亮蓝测蛋白质含量

实验考马斯亮蓝测蛋白质含量蛋白质是构成生物体的基本组成部分，对于生命的正常运行起着重要的作用。

因此，准确测量蛋白质的含量对于生物学研究至关重要。

考马斯亮蓝法（Coomassie Brilliant Blue method）是一种常用的蛋白质定量方法，本文将介绍这一实验方法的步骤和原理。

实验步骤：1. 样品制备准备待测样品，可以是纯蛋白质溶液、组织细胞提取液或药物制剂等。

确保样品无颗粒物和杂质，使用管道和其他实验工具保持清洁。

2. 标准曲线制备准备一系列已知浓度的蛋白质标准溶液，推荐使用0.1mg/ml至1.0mg/ml的浓度范围。

将标准溶液分别与考马斯亮蓝试剂混合，并在可见光波长范围内（通常为595nm）测量吸光度。

绘制标准曲线，将吸光度值作为纵坐标，蛋白质浓度作为横坐标。

使用线性回归等方法确定标准曲线的拟合方程。

3. 样品测量将待测样品与考马斯亮蓝试剂按照适当比例混合，使混合液呈现出明显的蓝色。

搅拌混合液以确保充分反应。

放置混合液在室温下静置一段时间，通常为10-30分钟。

4. 吸光度测量使用分光光度计设置在595nm处，选择比较液为含有等量水的空白样品，记录吸光度值。

对于待测样品，同样记录吸光度值。

5. 蛋白质含量计算根据标准曲线的拟合方程，将待测样品的吸光度值代入，计算出对应的蛋白质浓度。

实验原理：考马斯亮蓝法基于考马斯亮蓝G-250试剂与蛋白质之间的非共价相互作用。

在酸性条件下，考马斯亮蓝G-250试剂分子的分子结构被蛋白质分子上的亲水基团改变，使其从无色转变为蓝色。

吸光度测量蛋白质试剂复合物的蓝色强度，可推断蛋白质的含量。

实验注意事项：1. 仪器校准在开始实验之前，确保分光光度计在595nm处校准准确。

通过使用已知浓度的蛋白质标准溶液验证仪器的准确性和灵敏度。

2. 每个样品的重复测量为了保证测量结果的准确性，建议对每个样品进行重复测量，并计算平均值和标准偏差，以评估实验的可重复性。

3. 注意混合液比例样品与考马斯亮蓝试剂的比例需根据样品的特性进行调整。

蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝染色法(实验报告)

蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝染色法（实验报告）实验日期：2015年4月28日实验温度：室温实验地点：生物化学与遗传学实验室指导老师：***班级：2013级生物技术1班姓名：** 学号：********I.实验目的1.学习考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的原理和方法；2.熟悉蛋白质含量测定的影响因素。

II.实验原理考马斯亮蓝是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的，这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质浓度的方法。

考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大吸收波长465nm，与蛋白质结合后变为蓝色，最大吸收波长595nm，在一定的蛋白质浓度范围内吸光度与蛋白质含量成正比。

蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合，反应2min即可到达平衡，复合物在室温下1h内保持稳定。

蛋白质—考马斯亮蓝G-250复合物吸光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。

III.实验试剂与仪器1.实验试剂(1) 100μg/mL标准蛋白质溶液5mg酪蛋白溶于50mL 的0.1mol/L氢氧化钠溶液。

(2)考马斯亮蓝G-250试剂50mg考马斯亮蓝G-250溶于25mL的95%乙醇中，加85%的磷酸50mL，蒸馏水定容至500mL。

(3)正常人血浆。

2.实验器材可见分光光度计，100μL微量移液器16支，5mL刻度吸管8支，中试管。

IV.实验操作步骤1.绘制标准曲线取中试管8支，按下表加入各种试剂混匀，室温放置5min后即可比色。

以“0”号管为空白，记录于下表，绘制标准曲线。

标准曲线绘制数据表A5950 0.517 0.805 0.941 1.157 1.192 1.465 1.4402.样品测定中试管2支分别加未知浓度蛋白质（或人正常血浆）0.4mL，各加5.0mL考马斯亮蓝试剂摇匀，室温放置5min，以“0”号管为空白比色，以所测A595于标准曲线查蛋白质含量。

V.实验结果分析结果分析：实验未能达到预期的一条直线，原因可能为：①血浆样本放置时间太久，蛋白质变性；②实验比色杯由于使用后未及时擦洗，导致比色误差（原因小）；③人为操作不当，导致误差。

蛋白质的定量测定---考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度

蛋白质的定量测定---考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度【实验原理】考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理。

考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液时呈茶棕色，最大吸收峰在465nm 。

当与蛋白质结合后变成深蓝色，最大吸收峰转至595nm ，且其光吸收值与蛋白质含量（10~100μg/ml 蛋白质浓度）成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。

（蓝色）变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250max λ−−→−+-该方法灵敏度高，其最低蛋白质检测量可达1μg 。

这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度改变的变化很大。

由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford 法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。

【实验准备】一、试剂（1）考马斯亮蓝试剂：称取考马斯亮蓝G-250 100mg 溶于50ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml 。

（2）生理盐水：0.9% NaCl 溶液。

（3）标准蛋白质溶液：牛血清蛋白（BSA ），用0.9% NaCl 稀释成0.1mg/ml 蛋白标准溶液。

二、器材：试管和试管架、紫外分光光度计、移液枪、漩涡振荡器【实验步骤】一、制作标准曲线取7支干燥洁净的试管，编号按下表加入试剂各管加入试剂立即置于漩涡振荡器上混匀后，静置5min ，以0号管为空白管调零，在595nm 波长下分别测定各管溶液的吸光度值（A 595值），如下表所示。

编号蛋白浓度（ug/mL）吸光度（A）5951 10 0.1522 20 0.1993 40 0.3324 60 0.4575 80 0.5716 100 0.667以吸光度（A595值）为纵坐标，标准蛋白质浓度（mg/ml）为横坐标，进行直线拟合，得到标准曲线，如y=0.0059X+0.093，R2=0.9975（注：一般相关系数应在0.995以上，至少2个9以上）。

考马斯亮蓝法实验报告

考马斯亮蓝法实验报告实验目的，通过考马斯亮蓝法对蛋白质的浓度进行测定，探究其原理和操作方法。

实验原理，考马斯亮蓝法是一种常用的蛋白质浓度测定方法，其原理是将蛋白质与考马斯亮蓝反应生成蓝色化合物，通过测定蓝色化合物的吸光度来计算蛋白质的浓度。

实验步骤：1. 制备标准曲线，分别取不同浓度的蛋白质标准溶液，加入考马斯亮蓝试剂，混合均匀后测定吸光度，得到吸光度与蛋白质浓度的标准曲线。

2. 测定样品，将待测样品加入考马斯亮蓝试剂，混合均匀后测定吸光度。

3. 计算浓度，根据标准曲线，通过样品的吸光度值计算出样品中蛋白质的浓度。

实验结果，根据实验操作和测定数据，得到了样品中蛋白质的浓度。

实验分析，通过考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度的实验，我们可以了解到该方法的操作步骤和原理，同时也可以得到样品中蛋白质的浓度数据。

这对于生物化学、生物医学等领域的研究具有重要意义。

实验结论，考马斯亮蓝法是一种简单、快速、准确的蛋白质浓度测定方法，通过本次实验可以得到样品中蛋白质的浓度数据，为后续的实验和研究提供了重要参考。

实验注意事项：1. 实验操作要严格按照步骤进行，避免操作失误导致数据不准确。

2. 蛋白质标准溶液的制备要准确，避免因为标准曲线不准确而影响样品浓度的计算。

3. 实验中的试剂使用要注意安全，避免接触皮肤和吸入气体。

实验改进方向：1. 可以尝试使用其他蛋白质浓度测定方法进行对比实验，验证考马斯亮蓝法的准确性和可靠性。

2. 可以尝试对不同类型的样品进行测定，了解不同样品中蛋白质的浓度差异。

通过本次实验，我们对考马斯亮蓝法有了更深入的了解，同时也得到了样品中蛋白质浓度的数据，为后续的研究工作提供了重要参考。

希望本实验报告能够对相关领域的研究工作有所帮助。

考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量

考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量一、实验目的掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理和方法。

学习分光光度计的原理及使用方法。

二、实验原理三、实验步骤试剂试管编号0 1 2 3 4 5 6 7标准蛋白质溶液/ml 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 样品0.1 样品0.1相当于蛋白质含量/微克0.00 20 40 60 80 100 未知未知蒸馏水/ml 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0 0 考马斯亮蓝染液/ml 3 3 3 3 3 3 3 31、打开分光光度计，预热30min。

2、取8支洁净的干燥试管，按上表进行编号，0~5号用于标准曲线的绘制，6号、7号用于样品溶液的测定。

3、取微量注射器，用蒸馏水清洗3次，再用标准蛋白质溶液润洗2次。

按上表在0~5号试管中加入标准蛋白质溶液，然后用蒸馏水洗3次，再按上表在0~5号试管中加入相应含量的蒸馏水。

4、微量注射器用样品润洗2次，抽取100微克的样品加入到6号试管，再抽取100微克加到7号试管。

用蒸馏水清洗微量注射器。

5、取5ml的移液管，用蒸馏水清洗3次，用考马斯亮蓝染液润洗2次。

在0~7号试管中各加入3.0ml的考马斯亮蓝染液。

振荡试管，混合均匀。

6、待其充分反应（约2分钟）后，用分光光度计分别测它的吸光值。

7、用0~5号的数据。

以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。

8、由样品液的吸光值查标准曲线求出蛋白质含量。

四、实验结果与分析试管编号0 1 2 3 4 5 6 7A595 0 0.383 0.603 0.871 1.093 1.189 0.876 0.836样品溶液吸光值=（0.876+0.836）/2=0.856查标准曲线得样品液的蛋白质含量为66.0微克分析：考马斯亮蓝G-250能与蛋白质结合，染液与蛋白质结合后引起染料最大吸收峰的改变，从464nm变为595nm，光吸收值增加。

同时蛋白质——染料复合物具有高的消光系数，大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1微克蛋白质。

考马斯亮蓝法测定蛋白浓度

考马斯亮蓝法测定蛋白浓度一、实验原理考马斯亮蓝G250比色法，也被称为Bradford法是常用的一种蛋白质浓度的测定方法。

考马斯亮蓝G250是一种染料，能与蛋白质通过疏水作用结合，形成蛋白质-染料复合物，颜色由红色转变为蓝色，最大光吸收波长为595nm，并且在低浓度范围（0.01~1.0mg/mL）内，与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。

二、实验材料1、实验设备电子天平、分光光度计、恒温水浴锅2、试剂考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、NaCl、95%乙醇、85%磷酸三、操作步骤（一）试剂配制1、考马斯亮蓝G250溶液配制准确称取0.1 g考马斯亮蓝G250，溶于50mL 95%乙醇，加入100mL 85%磷酸，最后用蒸馏水稀释定容到1000mL。

备注：考马斯亮蓝G250溶液的用量100mL足够。

2、牛血清蛋白溶液配制准确称取50mg牛血清蛋白，加入0.526gNaCl，溶于少量蒸馏水中，然后稀释定容到500mL，配制成浓度为100 μg/mL的牛血清蛋白原液。

（二）标准曲线的制作1、取5-7支试管，分别准确配制不同浓度梯度的牛血清蛋白溶液（浓度控制在10~100μg/mL范围内）1mL，具体操作：取100-900 μl牛血清蛋白原液，水补足到1 mL，浓度相当于所取原液量的十分之一；2、在不同浓度的1mL牛血清蛋白溶液中，分别加入5mL考马斯亮蓝溶液，混合均匀，置于25℃水浴保温10min；3、以1mL蒸馏水加5mL考马斯亮蓝溶液为空白对照，冷却后测定波长595nm处的吸光值；4、以配制的标准蛋白浓度为横坐标，对应吸光值为纵坐标制作标准曲线，并做线性回归分析，求线性方程。

（三）目标样品的蛋白浓度测定取目标蛋白样品按标准曲线方法测定A595。

依据线性方程计算目标样品的蛋白质浓度。

五、注意事项1、染料-蛋白复合物形成受温度和时间影响较大，反应需控制在同一条件下进行。

2、比色杯易受蓝色污染，应注意用乙醇清洗。