实验七 考马斯亮蓝G250法测定的蛋白质含量
考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量
实验7 考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量蛋白质的存在影响酸碱滴定中所用某些指示剂的颜色变化，从而改变这些染料的光吸收。
在些基础上发展了蛋白质染色测定方法。
涉及的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。
目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。
考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。
2—5分钟即呈最大光吸收，至少稳定1小时。
在0.01—1.0 mg蛋白质/ml范围内均可。
该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性差。
高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂时测定有干扰。
缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。
考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英杯测定。
三、材料、试剂与器具（一）试剂1、染色液：取考马斯亮蓝G-250 100mg（20mg）溶于50ml （20ml）95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀释至1升。
该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。
2、标准蛋白溶液：称取25mg牛血清白蛋白，加蒸馏水溶解并定容至100ml，将此溶液稀释2.5倍，即为100μg/mL标准液。
4摄氏度保存备用。
3提取液：50mmol/L磷酸盐缓冲液（KPP）pH7.8：称取7.6gK2HPO4和0.89gKH2PO4蒸馏水溶解，定容至1L，调pH至7.8。
50mmol/LKPP（pH7.8）内含1%的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）四、操作步骤（一）标准曲线的制作3、用分光光度计比色测定吸光值A595nm。
(注意应在一小时内完成比色)4、以A595nm为纵坐标，标准蛋白色质浓度为横坐标，绘制标准曲线。
（二）样品的测定1、样品的提取：称取植物材料0.2g左右于预冷的研钵中，加入2mL预冷的提取液，研成匀浆，转至10mL离心管中，用提取液冲洗研钵2次（每次1mL），转至离心管中，总体系4mL，此即为蛋白质提取液。
考马斯亮蓝G-250
本次蛋白质含量对比评测中，我们运用可溶性蛋白质含量测定的方法：《考马斯亮蓝G -250法(刘延林等，1998)》来进行两种样品的对比标准曲线的制作：以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白质。
称50mg考马斯亮蓝G-250溶于25mL 95%乙醇和50 mL 85%(w/v)的磷酸混合液中，用蒸馏水定容至500mL，快速滤纸过滤后储存于棕色瓶中备用。
称取100mg BSA，溶于蒸馏水中，定容至100mL，则其浓度为1000μg/mL。
按表在6支具塞试管中分别加入BSA溶液和蒸馏水，配制成0～100μg/ml牛血清蛋白溶液各1ml，混匀后加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，盖塞、混匀，室温静置2min，用分光光度计在5 95nm处检测吸光度。
以测得的吸光值为纵坐标，表中各管蛋白浓度为横坐标，做标准曲线。
蛋白质标准曲线溶液配制表吸取待测样品1～5ml，放入具塞试管中，加入5ml考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，放置2分钟后用10mm光径比色杯在595nm下比色，记录其消光值，并通过标准曲线得到每毫升溶液中的蛋白质含量。
样品蛋白质含量(mg/L)=标准曲线上求得的蛋白质含量(μg)/测定取样体积(ml)实验结果：1 ，标准曲线与回归方程2 ，样品测定(稀释250倍)计算后得出灭菌奶的蛋白值含量比值是：伊利金典/蒙牛特仑苏＝1. 2. 1溶液的配制标准蛋白溶液的配制:精确称取牛血清白蛋白100 mg,用蒸馏水定容至100 mL,配成110 mg/mol的标准溶液。
考马斯亮蓝G - 250溶液的配制:精确称取考马斯亮蓝G - 250 100 mg,溶于50 mL 95%的乙醇,再加入120 mL 85%的磷酸,稀释定容至1 000 mL备用。
1. 2. 2乳制品中蛋白质含量的测定分别准确移取一定量的乳与乳制品样品于试管中,加入410 mL 考马斯亮蓝G - 250溶液,用蒸馏水定容至510 mL,摇匀,在室温下反应5 min,以空白(不加乳制品) 溶液作参比溶液, 分光光度计595 nm波长处测定样品组的吸光度。
实验七-考马斯亮蓝G250法测定的蛋白质含量
实验七-考马斯亮蓝G250法测定的蛋白质含量实验目的本实验的目的是通过考马斯亮蓝G250法测定蛋白质的含量，并了解该方法的基本原理。
实验原理蛋白质含量的测定方法有很多，其中比较常用的是考马斯亮蓝G250法。
该方法的基本原理是：靶蛋白质与染料考马斯亮蓝G250反应生成蓝色沉淀，通过比色法测定沉淀的吸光度，即可计算出蛋白质的含量。
具体来说，该方法的操作步骤如下：1.将待测蛋白质样品制备成一定的浓度，并加入一定体积的考马斯亮蓝G250试剂。
2.在一定时间内使反应到达平衡，将反应液离心沉淀。
3.由于考马斯亮蓝G250和蛋白质的结合比较强，一般可以近似认为反应液中大多数考马斯亮蓝G250都与蛋白质结合在一起。
因此，剩余的考马斯亮蓝G250浓度可以通过测定上清液的吸光度得到。
4.根据标准曲线（一般为已知浓度的蛋白质样品的吸光度与浓度的对应关系），可以将上清液的吸光度转化为蛋白质的含量。
实验步骤实验前准备准备工具和试剂，包括：•96孔微孔板•分光光度计•移液器、吸头•加样器•蒸馏水•NaOH溶液（1mol/L）•BSA标准品（2mg/mL）实验操作1.准备5个稀释比例的BSA标准品，分别为0.1、0.2、0.5、1.0和2.0mg/mL。
2.将标准品和待测样品分别加入96孔板中，每个样品重复3次。
3.加入一定体积（如200μL）的考马斯亮蓝G250试剂，混匀。
4.在室温下暗置约5min，使反应充分发生。
5.离心沉淀至液面完全透明。
6.将上清液吸取到另一个96孔板中。
7.加入100μL NaOH溶液，混匀。
8.制备一条标准曲线，测量各标准品和待测样品的吸光度。
数据处理根据标准曲线计算待测样品中蛋白质的含量。
实验注意事项•操作时要注意洁净卫生，避免交叉污染。
•要精确控制试剂的使用量，避免误差。
•每项操作要根据标准程序认真进行，做到数据准确可靠。
实验结果分析通过考马斯亮蓝G250法测定了不同浓度的BSA标准品和待测样品中的蛋白质含量，得到了标准曲线和待测样品的吸光度值。
考马斯亮蓝G-250标准曲线法测定蛋白含量
考马斯亮蓝G-250标准曲线法测定蛋白含量实验目的：学习和掌握考马斯亮蓝G-250 测定蛋白质含量的原理和方法。
实验原理：考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。
该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
材料、主要仪器和试剂1．实验材料新鲜绿豆芽2．主要仪器（1）分析天平、台式天平（2）刻度吸管（3）具塞试管、试管架（4）研钵（5）离心机、离心管（6）烧杯、量筒（7）微量取样器（8）分光光度计3．试剂（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1 000μg／mL 的原液。
（2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。
此溶液在常温下可放置一个月。
（3）乙醇（4）磷酸（85％）四、操作步骤1．标准曲线制作（1）0~100μg／mL 标准曲线的制作：取6 支10mL 干净的具塞试管，按表1 取样。
盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min 后用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。
用考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量
用考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量呵呵你的自己检查一下你的仪器蛋白质浓度的测定(四)??考马斯亮蓝染色法目的要求学习考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度的原理和方法。
实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beer’s law)。
此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。
蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10,100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1,10µg蛋白质。
此反应重复性好，精确度高，线性关系好。
标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。
此方法干扰物少，研究表明:NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，(NH4)2SO4无干扰。
强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。
Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如TritonX―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。
但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。
试剂与器材一、试剂考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)一、目的考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue) G-250法是比色法与色素法相结合的复合方法，由Bradford于1976年建立，具有简便快捷，灵敏度高，稳定性好等特点，是一种较好的蛋白质定量测定常用方法。
通过本实验学习应用该法测定蛋白质含量的原理，复习分光光度计的使用及标准曲线的绘制等基本实验技能。
二、原理考马斯亮蓝G-250是一种染料，游离态呈红色，与蛋白质结合后转变为青色。
在0~1000μg 范围内，蛋白质-色素结合物在595 nm下的吸光度与蛋白质含量正相关，可用比色法测定。
三、仪器、试剂和材料1．仪器设备：(具塞刻度)试管吸管分光光度计2．试剂(1) 标准蛋白质溶液称取100 mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100 ml，制成 1 mg/ml溶液。
(2) 考马斯亮蓝G-250蛋白试剂称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 ml 95%乙醇中，加入85% (m/v)的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000 ml (此溶液在常温下可放置一个月)。
(3) 样品蛋白液(10~100 μg/ml)四、操作步骤1标准蛋白质含量(μg)为横坐标、吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。
2．样品中蛋白质含量的测定取2支(具塞)试管，分别准确加入0.l ml样品蛋白液，再各加5 ml考马斯亮蓝G-50试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线0号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。
五、结果处理根据所测样品提取液的平均吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量(μg/ml)六、思考题1．考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白质定量法？2．如何正确使用分光光度计？。
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量_2
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量
原理:考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合后,染料的最大吸收从465nm变为596nm,蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数,因此蛋白质测定的灵敏度较高,最低检出量为1ug蛋白质.染料与蛋白质的结合,大约只需2min,结合物的颜色在1h内是稳定的.一些阳离子乙醇等物质不干扰测定,但去污剂严重干扰测定,少量的去污剂可通过用适当的对照而消除,犹豫染色法简单迅速,干扰物质少,灵敏度高,现已广泛用于蛋白质含量的测定.
试剂:○1标准蛋白质溶液：可用牛血清清蛋白。
或根据牛血清清蛋白的紫外消光系数来确定
○2蛋白染色剂的配置：取100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%愚蠢，假如100ml85%磷酸，将溶液用水稀释到1000ml。
试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%乙醇和8.5%磷酸
操作：1.标准曲线的绘制
（1）取7支试管，分别假如0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml，1.2ml，
1.4ml，1.6ml标准蛋白质溶液，用水不足到2ml
（2）去8支试管，0号加入0.1ml蒸馏水，1~7号试管一次加入0.1ml步骤（1）的标准蛋白质稀释液，然后各加入5ml
蛋白染色剂，充分振荡混合，2min后于595nm测定光吸收
值。
以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标
准曲线作为定量的依据。
2.样品的测定
去样品溶液0.1ml，用制定标准曲线的方法测595nm光吸度，用标准曲线计算蛋白质的含量。
实验结果
测定所用的标准曲线方程为：v=0．1296x＋0．0907。
考马斯亮蓝G-250法测量蛋白质含量与凯氏定氮法相比较误差范围3％～8％。
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
一 、实验目的
学会用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白 质含量
二、 实验原理
考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区结合，这种结 合具有高度的敏感性。考马斯亮蓝G-250的磷酸溶 液呈棕红色，最大吸收峰在465nm当它与蛋白质 结合形成复合物时呈蓝色其最大吸收峰改为 595nm，考马斯亮蓝G-250-复合物的高消光效应 导致了蛋白质定量测定的高敏感度。 在一定范围内，考马斯亮蓝G-250-复合物呈色后， 在595nm下吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故 可以用于蛋白质浓度的测定。
四、实验试剂
1、0.9％NaCL溶液。
2、标准蛋白液；牛血清白蛋白（0.1mg/ml）， 准备称取牛血清白蛋白0.2g，用0.9%NaCl溶液 溶解并稀释至2000ml。 3、染液：考马斯亮蓝G250(0.01%),称取0.1g考 马斯亮蓝G250溶于50ml95%乙醇中，再加入 100ml浓磷酸，后加蒸馏水定容到1000ml,过滤。
三 、实验器材
（1）旋涡混合器。 （2）试管1.5cm×15cm（×8） （3）吸管0.10ml（×1），0.50ml（×2）， 1.0ml（×2），2.0ml（×1），2.0ml（×1）。 （4）722型（或7220型）分光光度计。 （5）容量瓶1000ml（×1）。 （6）量筒100ml（×1）。 （7）电子分析天平。
0.8 0.2 4 80
A595nm
（二）样品的测定
另取一支干净试管，加入样品液1.0ml及 考马斯亮蓝染液4.0ml，混匀，室温静置 3min，于波长595nm处比色，读取吸光 度，由样品液的考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度——标准曲线的制备
管号 试剂 标准蛋白液/ml 0.9%NaCl/ml 考马斯亮蓝染液/ml 蛋白质浓度（μg/ml） 0 1 4 0
用考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量
用考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量呵呵你的自己检查一下你的仪器蛋白质浓度的测定(四)??考马斯亮蓝染色法目的要求学习考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度的原理和方法。
实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beer’s law)。
此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。
蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10,100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1,10µg蛋白质。
此反应重复性好，精确度高，线性关系好。
标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。
此方法干扰物少，研究表明:NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，(NH4)2SO4无干扰。
强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。
Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如TritonX―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。
但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。
试剂与器材一、试剂考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。
考马斯亮蓝G-250染色法
结果处理： 1、绘步骤 实验步骤】
1．组织样品的制备： 准确称取新鲜样品0.5g，用5mL生理盐水在冰 浴中研成匀浆。在3500rpm离心10min，取上清 液待测。 2. 血清样品的稀释 取血清 µl，加生理盐水至
表1不同蛋白质含量的牛血清蛋白质溶液配制表 试剂 管号 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋白质溶液 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.05 （100 µg/mL） 生理盐水（mL） 1.0 0.2 0.8 0.7 0.6 0.5 0.95 G-250试剂（mL） 3 3 3 3 3 3 3 蛋白质含量（µg）0 20 40 60 80 100 吸光度值
特点：
1、染料与蛋白质的结合，大约只需2分钟，结合物的 颜色在1小时内是稳定的。 2、一定范围内,溶液在595nm波长下的吸光度与蛋白 质含量成正比，可用比色法测定。 3、一些阳离子，如K+、Na+、Mg 2+、（NH4）2SO4， 乙醇等物质不干扰测定，但去污剂如Tritonx-100、 SDS等严重干扰测定，少量的去污剂可通过用适当 的对照消除。
优点： 试剂配制简单、操作简便快捷、灵敏度 高、重复性好、显色迅速、干扰物质较少。 测定范围1-100µg。
【实验仪器及试剂】 实验仪器及试剂】 实验仪器及试剂 1、仪器： 722分光光度计、天平、试管、 移液管、离心机
2、试剂： （1）标准牛血清蛋白质溶液： 100 µg/mL牛血清蛋白。 （2）考马斯亮蓝G-250溶液： 称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 90% 90%的乙醇中，加入100mL 85%（W/V）的磷酸， 100mL 85% W/V 再用蒸馏水定容至1L，贮于棕色瓶中。常温下可 保存一个月。 （3）生理盐水： 称取0.9g NaCl 加蒸馏水至100ml。
考马斯亮蓝G250.doc
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量定二、原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。
该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
二、材料、主要仪器和试剂1．实验材料香椿种子2．主要仪器（1）（2）刻度吸管（3）具塞试管、试管架（4）研钵（5）离心机、离心管（6）烧杯、量筒（7）微量取样器（8）分光光度计3．试剂（1）牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1 000μg／mL 的原液。
（2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。
此溶液在常温下可放置一个月。
（3）乙醇（4）磷酸（85％）四、操作步骤1．标准曲线制作（1）0~100μg／mL 标准曲线的制作：取6 支10mL 干净的具塞试管，按表1 取样。
盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min 后用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。
表1 低浓度标准曲线制作（2）0~1 000μg／mL 标准曲线的制作：另取6 支10mL 具塞试管，按表2 取样。
考马斯亮蓝测定蛋白含量总结
一原理考马斯亮蓝G－250(GooMAssIe BrIllIAnT Blue G－250)测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G－250在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中，当它与蛋白质的疏水区结合后变为青色，前者最大光吸收在465nM，后者在595nM。
在一定蛋白质浓度范围内(1～100μg)，蛋白质与色素结合物在595nM波长下的光吸收与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G－250结合在2Min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1H内保持稳定。
该反应快速灵敏(灵敏度比FolIn－酚法还高4倍)、易于操作、干扰物质少(考马斯亮蓝G－250和蛋白质通过范德华力结合，受蛋白质的特异性影响较小，除组蛋白外，其他不同种类蛋白质染色强度差异不大)，可测定微克级蛋白质含量，是一种比较好的蛋白质定量法。
但此方法也存在其缺点，考马斯亮蓝在蛋白质含量很高时线性关系偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有差异。
考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量在1ug左右。
二试剂配置三步骤1破碎细菌提取蛋白液大肠杆菌表达外源蛋白，在超声破碎的时候，用含有1%triton-X-100的PBS悬浮，然后超声的效果较好，1%triton-X-100的作用还是很明显的，对其他的一些细菌同样起作用，比如链霉菌。
(30% Triton X-100的配制Triton X-100 28.2ml0.1mol/L PBS(pH=7.3)或0.05mol/l TBS(pH=7.4) 72.8ml配制方法取Triton X-100及PBS（或TBS）混合，置37℃～40℃水浴中2～3h，使其充分溶解混匀。
用前取该储备液稀释至所需浓度。
通常将30%稀释到1%。
)注意：在表达重组蛋白后超声波破碎细胞，采用冰浴，400w，破2s停1s，但是不一会就产生大量泡沫，影响了破碎功率，pbs和tris缓冲液都是这样，最后都是破碎不完全，而我的目的蛋白就在这些未破碎的细胞中。
用考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量
用考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量呵呵你的自己检查一下你的仪器蛋白质浓度的测定(四)??考马斯亮蓝染色法目的要求学习考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度的原理和方法。
实验原理考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律(Beer’s law)。
此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。
蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5µL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10,100µg蛋白质，微量测定法测定范围是1,10µg蛋白质。
此反应重复性好，精确度高，线性关系好。
标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。
此方法干扰物少，研究表明:NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，(NH4)2SO4无干扰。
强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。
Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如TritonX―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。
但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。
试剂与器材一、试剂考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。
考马斯亮蓝法法测定蛋白质含量
（优选）考马斯亮蓝法法测定 蛋白质含量
【实验原理】
考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于 染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈棕 红色，最大吸收峰在465nm；当它与蛋白 质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色， 其最大吸收峰移至595nm，而且消光系数 更大。
考马斯亮蓝G-250在游离状态 下呈红色，最大光吸收在 465nm；当它与蛋白质结合 后变为青色，蛋白质-色素结 合物在595nm波长下有最大 光吸收。其光吸收值与蛋白质 含量成正比。
蛋白质与考马斯亮蓝G250的 结合十分迅速，约2min即可 反应完全，其复合物在1h内 保持稳定。
考马斯亮蓝R250与蛋白 质反应虽然比较缓慢， 但是可以被洗脱下去， 所以可以用来对电泳条 带染色。
在一定蛋白质浓度范围内 (1～1000µg/ml）,
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；
蛋白质－染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白 考马斯亮蓝试剂（mL）
蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速，约2min即可反应完全，其复合物在1h内保持稳定。 考马斯亮蓝法法测定蛋白质含量
质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。 当一束平行单色光(I0)照射有色溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液(I)
蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速，约2min即可反应完全，其复合物在1h内保持稳定。 由于蛋白质－染料复合物具有很高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度（最低检出量为1µg）。 考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。 （优选）考马斯亮蓝法法测定蛋白质含量
当它与蛋白质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色，其最大吸收峰移至595nm，而且消光系数更大。 可见光范围内波长和颜色的关系
考马斯亮蓝法测蛋白质含量实验报告
一、实验目的1. 熟悉考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的基本原理和方法。
2. 掌握实验操作步骤，提高实验技能。
3. 学习利用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的方法，并分析实验结果。
二、实验原理考马斯亮蓝法是一种常用的蛋白质定量方法，其原理基于染料结合法。
在一定条件下，考马斯亮蓝G-250染料与蛋白质发生结合，形成蛋白质-染料复合物。
该复合物在595nm波长下的光吸收值与蛋白质浓度成正比。
通过测定吸光度值，可以计算出样品中的蛋白质含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 标准蛋白质溶液（如牛血清白蛋白，BSA）- 待测蛋白质样品- 考马斯亮蓝G-250染料- 95%乙醇- 磷酸- 超纯水- 紫外分光光度计- 移液枪- 烧杯- 玻璃杯- 比色皿2. 实验步骤：1. 配制考马斯亮蓝G-250染液：称取0.01g考马斯亮蓝G-250，溶于5mL 95%乙醇中，加入85% (m/V) 磷酸10mL，最后用超纯水定容至100mL，装入棕色瓶中保存。
2. 配制标准蛋白质溶液：称取适量BSA，用超纯水配制成1mg/mL的标准溶液。
3. 样品处理：取适量待测蛋白质样品，用超纯水稀释至适当浓度。
4. 比色测定：a. 准备一系列标准蛋白质溶液，分别加入5mL考马斯亮蓝G-250染液，充分混匀，室温下放置10min。
b. 将上述溶液倒入比色皿，于595nm波长下测定吸光度值，记录数据。
c. 将待测蛋白质样品按照上述步骤进行处理，测定吸光度值。
5. 绘制标准曲线：以蛋白质浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
6. 计算待测蛋白质样品的蛋白质含量：将待测蛋白质样品的吸光度值带入标准曲线，计算蛋白质含量。
四、实验结果与分析1. 标准曲线：根据实验数据，绘制标准曲线，线性关系良好。
2. 待测蛋白质样品的蛋白质含量：将待测蛋白质样品的吸光度值带入标准曲线，计算得到蛋白质含量为XX mg/mL。
五、实验讨论1. 考马斯亮蓝法是一种快速、简便、灵敏的蛋白质定量方法，广泛应用于生物、医药、食品等领域。
考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量精
仪器和试剂
1．仪器：分析天平；吸管0.1ml×1、1ml×2、5ml×1； 试管10个；722型分光光度计；容量瓶100ml、1000ml 各一个；
2．试剂： （1）0.9% NaCl溶液； （2）标准蛋白质溶液：称取10mg 牛血清白蛋白，溶于 蒸馏水并定容至100ml，制成0.1mg/ml 的原液。 （3）考马斯亮蓝G-250（0.01%）染液：称取0.1g考马斯 亮蓝G-250，溶于50ml 90%乙醇中，加入85%（m/v） 的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容至1000ml。此溶液不 宜久存，在常温中可放置1-2个月。 （4）样品液：取牛血清白蛋白0.1mg/ml 的溶液，用 0.9% NaCl溶液稀释至一定浓度。
操作步骤
1．0~100μg／mL标准曲线的制作： 取6支试管，编号后，按下表加入试剂，
混匀，室温静置5min后，以管1为空白对照， 在595nm下比色测定。以标准蛋白质含量 （μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘出 标准曲线。
管号
123 4 56
蛋白质标准液 （ml）
0 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
0.9%NaCl溶液 1.0 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 （ml）
考马斯亮蓝染液 5 5 5 5 5 5
蛋白质含量（μg）
A595
2．样品中蛋白质含量的测定
另取两支干净的试管（做一重复），加 入合适浓度的待测样品，使其测定值在标 准曲线的范围内，测定方法同上，由样品 液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
实验目的
了解考马斯亮蓝法测定蛋白质的原理 掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的操作
步骤
实验原理
考马斯亮蓝G250在酸性的溶液中游离状态 呈红褐色，与蛋白质结合后呈蓝色，其最 大吸收波长由465nm转变为595nm。在一定 的蛋白质浓度范围内，595nm处的光密度值 与蛋白质浓度成反比，可用比色法进行蛋 白质定量测定。
考马斯亮蓝G250染色法测定啤酒中蛋白质含量
果， 见表 ３：
表３
考马斯亮蓝法测定啤酒中蛋白质含量
管号
１
２
３
蒸馏水
１ｍＬ
０
０
酒样（ １ｍＬ）
啤酒 Ａ 啤酒 Ｂ
考马斯亮蓝 Ｇ－ ２５０ 试剂 ３ｍＬ
３ｍＬ
３ｍＬ
ＯＤ５９５ｎｍ 蛋白质含量 ／ｍｇ·ｍＬ－１
０．０００ ０
０．２９２ １．５５
０．２３４ １．１１
ＣＶ％
０
０．５２
０．４７
４ ０ 啤酒 Ｃ ３ｍＬ ０．２５７ １．２８ ０．６８
摘 要： 建立了猕猴桃酒中多酚的 Ｒ Ｐ－ ＨＰＬＣ 检测方法。该方法的最低检测限小于 １．０ｍｇ／ Ｌ， 加标回收率均大
于 ９０％， Ｒ ＳＤ％小于 ６％， 说明该方法准确可靠。用该方法对自制猕猴桃酒中多酚物质进行检测， 得出样品中主
要有： 原儿茶酸、儿茶素、香草酸、咖啡酸、表儿茶素、香豆酸、槲皮素等 １３ 种多酚物质。
０．４
０．３
Ａ５９５
０．２
０．１
０ ０．２
０．４
０．６
ＳＤＳ 浓度 ／％ ０．８
图 ３ 考马斯亮兰 Ｓ ＤＦ 干扰曲线 ＳＤＳ 是分离 ＤＮＡ 时常用的一种阴离子除垢剂， 它的主要 作用是溶解膜蛋白及脂肪， 从而使细胞膜破裂； 溶解核膜和核
小体， 使其解聚， 将核酸释放出来； 能够与蛋白质结合形成
Ｒ－ Ｏ－ ＳＯ３－ …Ｒ＋－ 蛋白质复合物， 使蛋白质变性沉淀。 由图 ３ 可以看出， 十二烷基硫酸钠对考马斯亮蓝测蛋白
试管中， 按表 ２ 取样。盖塞以后， 将各试管中溶液纵向倒转混
合， 放置 ２ｍｉｎ 后用 １ｃｍ 光经的比色杯中在 ５９５ｎｍ 波长下比
色， 记录各管测定的光密度 ＯＤ５９５ｎｍ， 并做标准曲线， 见表 ２。
实验七考马斯亮蓝G250法测定的蛋白质含量
实验七考马斯亮蓝G250法测定的蛋白质含量一、试验目的1. 学习分光光度计的原理及操作2.学习利用染色方法提高蛋白质消光系数，以提高分光光度法检测灵敏度二、基本原理1. 根据物质的吸收光谱进行定性或定量分析的方法称为吸收光谱法或分光光度法。
该法所用的仪器称为分光光度计或吸收光谱仪。
该法所使用的光谱范围包括可见光和紫外光，即包括波长在200 - 800 nm之间的光。
2.分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，其中的紫外/可见分光光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。
3.紫外区可分为紫外（近紫外）和真空紫外（远紫外）。
由于吸收池（又称样品池、比色杯等）和光学元件以及氧气能吸收小于190nm波长的光，因此常规紫外测定集中在近紫外区，即200nm-400nm。
可见光区为400nm -800nm。
4.考马斯亮蓝G250法原理：考马斯亮蓝G250与蛋白质结合后，其最大吸收波长从465nm改变为595nm,该蛋白－染料复合物吸光系数很高，所以检测灵敏度很高，可以测定1μg /mL的蛋白质，染料和蛋白结合只需要2分钟，颜色在1小时内稳定。
操作简便，快速，是常用的蛋白含量测定方法之一。
去污剂，粘多糖等严重干扰该方法的测定三、试剂1. 标准蛋白质溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白溶液2. 考马斯亮蓝G250蛋白染色剂：四、操作步骤1.标准曲线的绘制：取6只试管，分别加入浓度为0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mg/ml的标准蛋白质溶液0.1ml，然后加入5ml考马斯亮蓝试剂，震荡混匀，2分钟后于595nm 测定吸光值，以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。
2.样品测定：样品液0.1mL , 然后加入5ml考马斯亮蓝试剂，震荡混匀，2分钟后于595nm 测定吸光值。
从标准曲线中查出相应的浓度。
五、试验结果3.样品的测定根据标准曲线可以找出样品对应的点（0.085，0.017），所以样品的浓度为0.085mg/ml。
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实验七考马斯亮蓝G250法测定的蛋白质含量
一、试验目的
1. 学习分光光度计的原理及操作
2.学习利用染色方法提高蛋白质消光系数，以提高分光光度法检测灵敏度
二、基本原理
1. 根据物质的吸收光谱进行定性或定量分析的方法称为吸收光谱法或分光
光度法。
该法所用的仪器称为分光光度计或吸收光谱仪。
该法所使用的光谱范围包括可见光和紫外光，即包括波长在200 - 800 nm之间的光。
2.分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广，其中的紫外/可见分光
光度技术更是生物化学研究工作中必不可少的基本手段之一。
3.紫外区可分为紫外（近紫外）和真空紫外（远紫外）。
由于吸收池（又称样
品池、比色杯等）和光学元件以及氧气能吸收小于190nm波长的光，因此常规紫外测定集中在近紫外区，即200nm-400nm。
可见光区为400nm -800nm。
4.考马斯亮蓝G250法
原理：考马斯亮蓝G250与蛋白质结合后，其最大吸收波长从465nm改变为595nm,该蛋白－染料复合物吸光系数很高，所以检测灵敏度很高，可以测定1μg /mL的蛋白质，染料和蛋白结合只需要2分钟，颜色在1小时内稳定。
操作简便，快速，是常用的蛋白含量测定方法之一。
去污剂，粘多糖等严重干扰该方法的测定
三、试剂
1. 标准蛋白质溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白溶液
2. 考马斯亮蓝G250蛋白染色剂：
四、操作步骤
1.标准曲线的绘制：
取6只试管，分别加入浓度为0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mg/ml的标准蛋白质溶液0.1ml，然后加入5ml考马斯亮蓝试剂，震荡混匀，2分钟后于595nm 测定吸光值，以蛋白质浓度为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。
2.样品测定：
样品液0.1mL , 然后加入5ml考马斯亮蓝试剂，震荡混匀，2分钟后于595nm 测定吸光值。
从标准曲线中查出相应的浓度。
五、试验结果
3.样品的测定
根据标准曲线可以找出样品对应的点（0.085，0.017），所以样品的浓度为
0.085mg/ml。
六.结果讨论
注意事项：
1.分光光度计必须放置在固定而且不受震动的仪器台上，不能随意搬动。
严
防震动、潮湿和强光直射。
2.盛待测液时，必须达到比色杯2/3左右，不宜过多。
若不慎使溶液流出比色
杯外面，必须先用滤纸吸干，再用擦镜纸或绸布擦净才能放入比色杯槽内。
移动比色杯槽要轻，以防溶液溅出，腐蚀机件。
3.千万不可用手、滤纸、毛刷等物摩擦比色杯光滑面。
4.用完比色杯后应立即用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净。
5.每套分光光度计上的比色杯及比色槽不能随意更换。