考马斯亮蓝法(Bradford法)
Bradford法测蛋白质浓度
Bradford法测蛋白质浓度Bradford法测蛋白质浓度Bradford 蛋白检测就是考兰法。
特点1.快速：10分钟既可完成测定。
2.稳定：加样，混匀后 2 分钟既可测定， 1 小时内吸光度变化不超过10%。
3.高敏感度：可精确定量 1～1000 μg/ml 的蛋白样品。
4. 595 nm检测4.不受绝大部分样品中的化学物质的影响。
巯基乙醇的浓度可高达1M，二硫苏糖醇的浓度可高达5 mM。
但受略高浓度的表面活性剂影响。
若SDS高于0.1%，TritonX-100高于0.1%，Tween20，60，80高于0.06%，可取少量样品加水稀释到适当浓度，再行测定。
考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质浓度1、试剂：（1）考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml, 滤纸过滤。
最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250, 4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。
（2）标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，根据其纯度同0.15mol/L NaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
2. 器材：（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器3、标准曲线的制作试管编号 0 1 2 3 4 5 6100ug/ml标准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.60.15mol/L NaCl （ml） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4考马斯亮蓝试剂（ml） 5 5 5 5 5 5 5摇匀，1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色A595nm以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
4、样品中蛋白质含量的测定另取两支干净的试管（做一重复），加入合适浓度的待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
Bradford法
原理：这一方法基于考马斯亮蓝G-250 有红蓝两种不同的形式。
在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳定。
反应化合物在465-595nm处有最大的光吸收值，化合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系，因此可检测595nm的光吸收值的大小计算蛋白的含量。
溶液：1）Bradford储存液100ml95%乙醇200ml88%磷酸350mgServaG蓝室温下长期保持稳定。
2）Bradford工作液425ml双蒸水15ml95%乙醇30ml88%磷酸30ml Bradford储存液用滤纸过滤，保存于室温棕色瓶中，可保存数周，但在使用前需要过滤。
3）配制1mg/ml牛血清蛋白（BSA）做标准曲线：取样品即可测量。
注意事项：1、样品制备，样品制备是做好2-d 的关键，样品中离子浓度不能过大，最好用新鲜的样品提取蛋白质，如果不确定蛋白提取情况，建议先跑sds-page检验。
2、上样量的问题，ipg 胶条是13 厘米的上样量在50ng-80ng之间，上样量不合适，丰度低的将会被丰度高的所遮盖。
3、ipg 胶条ph 的选择，根据不同样品选择不同pH值。
4、针对不同的蛋白质，分离胶的浓度需调整。
一、实验原理双缩脲法（biuret法）和folin—酚试剂法（lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由bradford建立的考马斯亮兰法（bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
实验二 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
实验二考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量一、目的与要求1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质含量的原理与方法2. 熟练分光光度计的使用和操作方法。
二、实验原理考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种，它与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。
它在酸性溶液中呈棕红色，最大光吸收峰在465nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰改变为595nm。
考马斯亮蓝G-250—蛋白质复合物呈蓝色，在一定范围内，595nm下光密度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。
考马斯亮蓝结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法，本方法具有操作方便、快速、干扰因素少的特点。
附：（一）、分光光度法原理：光的吸收定律（朗伯-比尔定律）：一束单色光(强度为I0)通过某吸光物质的溶液时,其光能量的被吸收与该物质浓度的关系符合朗伯—比尔定律即当入射光波长、温度和溶液的厚度一定时，吸光度与溶液的浓度成正比。
用公式表示为：T = I／I0则A = lg（1／T）=Kbc式中T —透光率I —透过光强度I0—入射光强度 A —吸光度K —比例常数 b —溶液的厚度 c —溶液的浓度（二）、离心机的使用说明：1.要离心的离心管和管套要称重，重量不等时将水加在管套里。
2．离心管的放置是对角线放置，要求必须对称。
3. 先将离心机转速旋钮恢复到零刻度后，再定时间，定好时间后缓慢旋转转速旋钮，使离心机均匀的提速到预定转速。
（三）、分光光度计的使用说明：1.接通电源开关，预热20min后，再选择须用的单色光波长。
2.放入已加入溶液的比色皿，盖上样品室盖，推动试样架拉手，使对照比色皿（溶液装入4／5高度，置第一格）置于光路上，调节100％透射比按钮，使吸光度值A=0.00。
3.推动试样架拉手，使样品比色皿置于光路上，读出吸光度值。
4.测量完毕，取出比色皿，洗净后置于乙醇溶液中浸泡脱色。
5.电源开关置于“关”，拔下电源插头。
考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质含量：分光光度的使用
2．校正 （1）打开吸收池暗室盖，调节[0% T]旋钮， 使数字显示为“00.0”，将参比溶液置于光路， 盖上吸收池盖，调节透光率[100% T] 旋钮， 数字显示为“100.0”。 （2）如果显示不到“100”，则可适当增加电 流放大器灵敏度档数，当改变灵敏度 后必须重 新校正“0”和“100”。 （3）按（1）连续几次调整“00.0”和 “100.0”后，将选择开关置于“A”，调节吸光 度调零旋钮，使数字显示为“.000”，即可进行 吸光度A的测量.
考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋 白质含量：分光光度的使用
【实验目的】
1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测
定蛋白质的原理与方法。 2. 熟练分光光度计的使用和操作
方法。
【实验原理】 考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量 属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝 G250在酸性溶液中呈棕红色，最大吸 收峰在465nm；当它与蛋白质通过范 德华键结合成复合物时变为蓝色，其 最大吸收峰移至595nm，而且消光系 数更大。
灵敏度
0
100
暗盒盖
调波长旋钮
比色皿拉杆
1．调整
（1） 接通电源。 （2） 调波长调节器至所需波长。 （3） 开启电源开关，指示灯亮，选择开关置
于“T”，将灵敏度旋钮调至”1”档位，调节透 光率[100%T]。预热20min . 预热仪器应在不测定时，将比色皿暗箱盖打开， 使光路切断。
液。残渣用2.0ml蒸馏水悬浮，
4000rpm离心10min，合并上清液并含量测定:
取3支试管，各吸取样品提取液0.1ml，
加入考马斯亮蓝G250试剂3.0ml，充分振荡
混合,放置5min后，测 A595值。
3. 根据A595值，在标准曲线上求出样品中蛋 白含量。
蛋白质含量测定法考马斯亮蓝法
蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法[实验目的]学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量的方法[实验原理]（蓝色）变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250max λ−−→−+-[器材与试剂]器材722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支 试剂1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA ），配制成1.00mg/ml 。
2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。
[实验方法]标准方法1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
3.用标准蛋白浓度（mg/ml ）为横坐标，用A 595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。
根据测得的未知样品的A 595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。
根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g 鲜重) =）测定时提取液体积（）样品重（）提取液总体积（）查得的蛋白质（ml g ml g g ⨯⨯/μSDS 干扰实验1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
[实验数据与结果分析]（一）标准方法的数据和图表1 考马斯亮蓝标准法实验表格根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。
图1 考马斯亮蓝标准法根据线性拟合公式y=a x+b计算所测溶液的蛋白质的含量。
（二）SDS干扰数据和图表2 考马斯亮蓝SDS干扰实验表格根据表2，以A595为纵坐标，SDS浓度为横坐标，作图2。
bradford法
双 缩 脲 法 （Biuret法）
中速 20~30 分 钟
多肽键＋碱性Cu2 ＋→紫色络合物
紫外吸收法
较为灵敏 50～100µg
快速 5～10分 钟
蛋白质中的酪氨 酸和色氨酸残基 在 280nm 处 的 光 吸收 双缩脲反应；磷 钼酸－磷钨酸试 剂 被 Tyr 和 Phe 还 原
各种嘌吟和嘧 啶； 各种核苷
灵敏度高 ～5µg
慢速 40～60 分钟
硫酸铵； Tris缓冲液； 甘氨酸； 各种硫醇
耗费时间长；操 作要严格计时； 颜色深浅随不同 蛋白质变化
考马斯亮蓝法 (Bradford法)
灵敏度最高 1～5µg
快速 5～15分 钟
考马斯亮蓝染料 与蛋白质结合时， 其 λ max 由 465nm 变为595nm
方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法 （Kjedahl法） 灵敏度低，适 用 于 0.2~ 1.0mg 氮 ， 误 差为 ±2％ 灵敏度低 1～20mg 费时 8～10小 时 将蛋白氮转化为 氨，用酸吸收后 滴定 非蛋白氮（可 用三氯乙酸沉 淀蛋白质而分 离） 硫酸铵； Tris缓冲液； 某些氨基酸 用于标准蛋白质 含量的准确测定； 干扰少；费时太 长 用于快速测定， 但不太灵敏；不 同蛋白质显色相 似 用于层析柱流出 液的检测；核酸 的吸收可以校正
2、缺点 、
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量 不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏 差，在制作标准曲线时最好选用 γ—球蛋白为标准蛋白质， 以减少这方面的偏差。 （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有： 去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1M 的NaOH （3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进 行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
蛋白质的速测技术—考马斯亮蓝法(Bradford法)和考马斯亮蓝速测管法
蛋白质的速测技术—考马斯亮蓝法(Bradford法)和考马斯亮蓝速测管法1．速测原理考马斯亮蓝法(Bradford法)按照蛋白质与染料相结合的原理设计。
G250(Coomassie G250)是一种甲基取代的，分子中磺酸基的蓝色染料。
考马斯亮蓝G250能与蛋白质通过范德华互相作用形成蛋白质-考马斯亮蓝复合物青蓝色溶液，在595nm处有最大汲取值，复合物溶液色彩的深浅与蛋白质的浓度成正比。
Bradford法敏捷度高，最低测试蛋白质量在1ug左右；测定迅速、简便，只需加1种试剂。
完成一个样品的测定，只需5 min左右。
因为染料与结合的过程，大约只要2min即可完成，其色彩可以在1h内保持稳定，且在5～20min之间，色彩稳定性好。
这种蛋白质测定法具有突出优点，正在得到广泛应用。
2．速测范围利用溶液色彩的差异举行比色测定，适合于蛋白质类的定量分析，尤其适合于稀少蛋白质的微量分析。
3．试剂与材料 (1)标准蛋白质溶液。
用球蛋白G或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/mL和0.1mg/mL的标准蛋白质溶液。
(2)考马斯亮蓝G-250染料试剂。
称100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 95％的后，再加入120mL 85％的，用水稀释至1L。
(3)器材：可见光分光光度计，旋涡混合器，试管16支。
4．速测步骤 1)标准办法 (1)取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按挨次分离加入样品、水和试剂，即用1.0mg/mL的标准蛋白质溶液给各试管分离加入：0、0.01、0.02、0.040、0.06、0.08、0.1mL，然后用无离子水补充到0.1mL。
最后各试管中分离加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，每加完一管，立刻在旋涡混合器上混合(注重不要太强烈，以免产生大量气泡而难于消退)。
(2)加完试剂2～5 min后，即可开头用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光汲取值A595，空白对比为第一号试管，即0.1mL H2O加5.0mL G-250试剂。
蛋白质含量测定法考马斯亮蓝法
蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法[实验目的]学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量的方法[实验原理]（蓝色）变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250m ax λ−−→−+-[器材与试剂]器材722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支 试剂1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA ），配制成1.00mg/ml 。
2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。
[实验方法]标准方法1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
3.用标准蛋白浓度（mg/ml ）为横坐标，用A 595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。
根据测得的未知样品的A 595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。
根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g 鲜重)=）测定时提取液体积（）样品重（）提取液总体积（）查得的蛋白质（ml g ml g g ⨯⨯/μ以蛋白标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
计算出回归方程。
如Y=aX+b让后把待测样品的吸光值代入回归方程，算出待测样品浓度 SDS 干扰实验1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
[实验数据与结果分析]（一）标准方法的数据和图表1 考马斯亮蓝标准法实验表格根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。
考马斯亮蓝法完整版
考马斯亮蓝法（Bradford法）
徐亮
xuliang@
Tianjin Medical University
一、基本原理
酸性溶液两者结合，使染料溶液 的最大吸收峰的位置，由465nm变 为595nm，溶液的颜色也由棕黑色 变为兰色。
四、Bradford法的优缺点
1、优点
（1）灵敏度高：蛋白质－染料复合物具有很高的消光 系数，因此蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为 1ug蛋白质。
（2）测定快速、简便：染料与蛋白质的结合，大约只 需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。
（3）干扰物质少。
四、Bradford法的优缺点
2、缺点
用于层析柱流出 液的检测；核酸 的吸收可以校正
耗费时间长；操 作要严格计时； 颜色深浅随不同 蛋白质变化
考马斯亮蓝法 (Bradford法)
灵敏度最高 1～5g
快速 5～15分 钟
考马斯亮蓝染料
与蛋白质结合时， 其 max 由 465nm 变为595nm
强碱性缓冲液； TritonX-100; SDS
考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5
摇匀，1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色
A595nm
以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
2、样品中蛋白质含量的测定
另取两支干净的试管（做一重复），加入合适浓度的 待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同 上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
ug/ml蛋白溶液。
2. 器材： （1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程：该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。
如核糖核酸酶或溶菌酶。
去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。
如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。
2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。
如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。
通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。
3．将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。
4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。
5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。
染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm 波长下测定其吸光度。
注意，显色反应不得超过30min．6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。
注意：考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。
待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。
适用范围考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。
当考马斯亮蓝G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从465nm 变为595nm。
在考马斯亮蓝G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝G-250 从吸收峰为465nm 的形式转变成吸收峰为595nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。
一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在595nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度含(_Bradford_法)
反应化合物在595nm处有最大光吸收，化合物颜色 的深浅在一定范围内与蛋白质浓度成正比，，因
此可通过测定595nm处的光吸收值来计算蛋白的含
量。
考马斯亮蓝染色法的优点：
（1）灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍），测 其最低蛋白质测量可达1mg。 (2)测定快速,简洁。只需加入一种试剂， 完成一个样品的测定，只需5min左右。 (3)此方法干扰物少 如干扰Lowry法的K+、 Na+、Mg+例子，Tris缓冲液、蔗糖、甘油、
思考题
1.考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理 是什么？ 2.为什么不能用试管刷来清洗比色皿？ 3.能否将卫生纸塞入比色皿中吸干余液？ 4.为什么最后要用95%的乙醇来润洗比 色皿？
尽管相对于其他方法来说尽管相对于其他方法来说??尽管相对于其他方法来说此法的干扰物较少尽管相对于其他方法来说此法的干扰物较少此法的干扰物较少此法的干扰物较少但但由于每种蛋白质与该染料的结合能力不同由于每种蛋白质与该染料的结合能力不同故故标准品的选择非常重要选择标准品的选择非常重要选择尽可能与待测蛋白尽可能与待测蛋白一致的样品一致的样品做标准能最大限度的提高该方法的做标准能最大限度的提高该方法的准确性
七.补充
蛋白质含量测定方法比较
蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最
常用、最基本的分析方法之一。目前常用 的有四种古老的经典方法，即定氮法，双 缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法 （Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种 近十年才普遍使用起来的新的测定法，即 考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中 Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外 吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100 倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确， 往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法 的标准蛋白质。
考马斯亮蓝法测蛋白浓度
考马斯亮蓝法（Bradford)测蛋白浓度考马斯亮兰法：一种蛋白定量法具体操作步骤:（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。
完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。
由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
（3）干扰物质少。
如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。
发酵液中的蛋白质含量测定
发酵液中的蛋白质含量测定
发酵液中的蛋白质含量可以通过多种方法进行测定，以下是其中一些常见的方法：
1. 考马斯亮蓝法（Bradford 法）：这是一种常用的蛋白质定量方法，基于考马斯亮蓝染料与蛋白质结合后在特定波长下的吸光度变化。
该方法具有快速、简便、灵敏的特点，但对不同类型的蛋白质可能存在一定的偏差。
2. 紫外吸收法：蛋白质在280nm 波长处有特征吸收，可以通过测定发酵液在该波长下的吸光度来估算蛋白质含量。
该方法简单快捷，但对于含有其他在该波长下有吸收的物质的发酵液可能不太准确。
3. bca 法：这种方法利用了bca（二喹啉甲酸）试剂与蛋白质结合后在特定波长下的吸光度变化。
bca 法常用于微量蛋白质的测定，具有较高的准确性和灵敏度。
4. 凯氏定氮法：这是一种经典的蛋白质定量方法，通过测定发酵液中氮的含量，并根据蛋白质的氮含量来计算蛋白质含量。
凯氏定氮法是一种较为准确的方法，但操作复杂，需要较长的时间。
选择合适的蛋白质含量测定方法应根据具体的实验需求和发酵液的特点来决定。
在进行测定时，应注意控制实验条件和操作步骤，以确保结果的准确性和可重复性。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量(原理
考马斯亮蓝法测蛋白质含量(原理考马斯亮蓝法（Bradford Assay）是一种常用的蛋白质含量测定方法。
它基于蛋白质与一种铜离子络合的原理，通过测定在碱性条件下蛋白质-考马斯亮蓝配合物与吸光度之间的关系，来确定蛋白质含量。
考马斯亮蓝法有以下几个特点：1. 敏感度高：考马斯亮蓝法对大多数蛋白质具有很高的灵敏度，可以检测到微量的蛋白质。
2. 特异性好：虽然考马斯亮蓝法可以测定多种类型的蛋白质，但对不同蛋白质的反应程度是有差别的，因此它在特异性上表现较好。
3. 操作简便：考马斯亮蓝法具有简单、快速、稳定性好等优点，非常适合大规模蛋白质含量的测定。
4. 利用范围广：除了用于测定溶液中的蛋白质含量外，考马斯亮蓝法还可用于固相蛋白质含量测定、酶联免疫吸附试验（ELISA）等领域。
1. 制备标准曲线：首先需要制备一组蛋白质浓度已知的标准溶液，常用的标准蛋白质有牛血清白蛋白、胰蛋白酶等。
将这组标准溶液分别加入少量试剂和适量去离子水，制备出一系列不同浓度的样本溶液，用吸光度计测定它们的吸光度值，并以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 取待测样本：从所需样本中挑选适量，加入量一般为10~100 μg，用去离子水稀释至一定浓度。
3. 添加试剂：向标准溶液和样品中分别加入适量的考马斯亮蓝试剂，0.5 ml的试样通常需要添加0.1 ml试剂。
4. 摇匀反应：使用磁力搅拌器或振荡器将样品和试剂充分混合，使反应达到最大化。
5. 测定吸光度：待反应结束后，用吸光度计测定样品的吸光度值，一般在595 nm波长处读数。
6. 读取浓度：根据标准曲线，将测出的吸光度值与标准曲线上对应浓度值对照，就可以推测样品中蛋白质的含量。
需要注意的是，考马斯亮蓝法本身也有一些缺陷。
例如，不同蛋白质的反应程度有差别，容易受到其他物质的影响而产生误差。
此外，在测定含有其他物质的样品中，需要对反应条件进行优化和校正，才能更准确地测定蛋白质含量。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量
考马斯亮蓝法测蛋白质含量实验概要bradford法是最常用的蛋白质快速定量方法。
coomassie brilliant blue g-250与蛋白质结合使染料的最大吸收峰由465 nm变为595 nm，溶液的颜色由棕色变为蓝色，595nm波长下吸光度值与蛋白含量成正比。
灵敏度比lowry法高4倍，与bca法相当。
反应迅速，2分钟即可达到平衡并在1小时内保持稳定。
操作简便，只需要一种反应试剂。
实验原理考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue)法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465 nm变为 595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。
主要试剂考马斯亮蓝g-250染色工作液： 10mg考马斯亮蓝g-250粉末溶于5ml 95%乙醇中，彻底溶解后，加入10ml 85%磷酸中，边加边搅拌（市售液体磷酸（h3po4）的质量分数≥85.0%，稠状透明液体，可直接使用，对皮肤有很强的腐蚀作用，建议使用5ml移液枪缓慢吸取使用）蒸馏水稀释至100ml。
后经滤纸过滤后储存于棕色试剂瓶中，避光保存。
长时间不用，可放置于4℃冰箱中保存1年，再次使用还需过滤，加入反应管前需要升至室温，否则虽不影响精度，但测得的od值较低，对仪器要求较高。
标准牛血清白蛋白（bsa）：精确称取4mg bsa粉末，溶于1ml 0.15mol/l nacl溶液配制成4mg/ml标准蛋白溶液，-20℃保存。
（如用1cm比色皿测定，建议精确称取40mg bsa 粉末，溶于10ml 0.15mol/l nacl溶液配制成4mg/ml标准蛋白溶液，分装成小管，-20℃保存。
考马斯亮蓝(Bradford)法蛋白浓度测定试剂盒
考马斯亮蓝(Bradford)法蛋白浓度测定试剂盒 M2031 产品说明书考马斯亮蓝(Bradford)法蛋白浓度测定试剂盒Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit产品简介：Bradford法（考马斯亮蓝法），是目前灵敏度最高的蛋白质测定法之一。
当Bradford 染色液（考马斯亮蓝G250）和蛋白在酸性条件下结合时，溶液颜色由棕黑色转为蓝色，最大吸光值波长由456nm 转至595nm，吸光值与蛋白质的含量在一定浓度范围内有较好的线性关系，通过测定吸光值大小并对照标准蛋白的吸光值，推算出蛋白浓度，实现了蛋白浓度测定的快速，稳定和高灵敏度。
Bradford 染色液为2 倍浓缩母液，便于储存。
产品特点:●快速，10-20 个样品只需要10 分钟即可完成测定。
●稳定，加样混匀后2 分钟既可测定，1 小时内吸光度变化不超过10%。
●最小测量体积为1-20 uL，最低测量蛋白量为0.5 ug。
●有常规和微量两种检测模式。
●不受绝大部分样品中的化学物质的影响。
巯基乙醇的浓度可高达1M，二硫苏糖醇的浓度可高达5 mM。
●但受略高浓度的表面活性剂影响，各种蛋白质与染料的结合效率可能有差异。
●经济实用：在微孔板中进行测定，可大大节约样品和试剂用量。
产品组成：上海美季生物技术有限公司上海市中山南二路777号2号搂2303考马斯亮蓝(Bradford)法蛋白浓度测定试剂盒 M2031 产品说明书保存温度：Bradford染色液2-8℃保存，BSA蛋白标准-20℃保存。
有效期一年。
操作步骤：一、常规测定A．96 孔酶标板测定：1.根据需要从冰箱取出适量Bradford 2x 染色液，平衡至室温并混匀；预热酶标仪20分钟。
2.根据需要取适量标准品,加入去离子水稀释至1mg/ml(原液5mg/ml),并混匀。
注意：原则上蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。
但是为了简便起见，也可以用去离子水、0.9%NaCl或PBS稀释标准品。
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量5
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量一，原理1、考马斯亮蓝G-250染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料最大吸收峰位置由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为亮兰色.染料主要是与蛋白质中碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基结合.2、蛋白质-染料复合物在595nm下测定的吸光度与蛋白质的浓度成正比.二，Bradford法优点1)灵敏度高其最低检测蛋白质含量可达1ug/mL,这是因为蛋白质与染料相结合后产生的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有更高的吸光系数,因而光吸收值随蛋白质浓度的变化要比其它方法大得多。
2)测定快速、简洁只需要加一种试剂；完成一个样品的测定,只需要5分钟左右。
染料与蛋白质结合的过程大约只要2分钟即可完成,其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间颜色的稳定性最好。
3)干扰物质少一些阳离子如K+、Mg2+、Na+和硫酸铵等不干扰测定。
干扰物质：去污剂SDS、TritonX-100三，Bradford法缺点(1)由于各种蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸的含量不同,因此Bradford 法用于不同蛋白质时有较大的偏差.(2)仍有一些物质干扰此法的测定,主要的干扰物质有去污剂等.(3)标准曲线也有轻微的非线形,因而不能用比尔定律进行计算，只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度.四，试剂与器材1.试剂(1)标准蛋白质溶液,用牛血清蛋白配制成0.1mg/ml。
(2)考马斯亮兰G-250染料试剂:称100mg考马斯亮兰G-250,溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml85 %的磷酸,用水稀释至1L后过滤使用。
2.器材(1)可见光分光光度计(2)试管3，操作管号 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0(0.1mg/ml)未知蛋白质 0.2 0.4 0.6蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4考马斯亮蓝 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0充分混匀后，两分钟于595nm处比色。
考马斯蓝法
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程
该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。
考马斯亮蓝法
也称考马斯蓝染色法（coomassie blue staining）又称Bradford法。
考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/mL，最小可测2.5μg/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
3．将待测样本溶于100~1缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。
4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。
5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30rain。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min．
1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50m1 95%乙醇，加入100ml浓磷酸，然后，用蒸馏水补充至200ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。
考马斯亮蓝法（Bradford法）
考马斯亮蓝法（Bradford法）考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质浓度一、实验原理双缩脲法（biuret法）和folin—酚试剂法（lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由bradford建立的考马斯亮兰法（bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
bradford法的突出优点是：1. 灵敏度高，据估计比lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比lowry法要大的多。
2. 测定快速、简便，只需加一种试剂。
完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。
由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
因而完全不用像lowry法那样费时和严格地控制时间。
3. 干扰物质少。
如干扰lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、edta等均不干扰此测定法此法的缺点是：1. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
2. 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、triton x-100、十二烷基硫酸钠（sds）和0.1n的naoh。
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考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质浓度
一、实验原理
双缩脲法（biuret法）和folin—酚试剂法（lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由bradford建立的考马斯亮兰法（bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
bradford法的突出优点是：
1. 灵敏度高，据估计比lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比lowry法要大的多。
2. 测定快速、简便，只需加一种试剂。
完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。
由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
因而完全不用像lowry法那样费时和严格地控制时间。
3. 干扰物质少。
如干扰lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、edta等均不干扰此测定法
此法的缺点是：
1. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
2. 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污
剂、triton x-100、十二烷基硫酸钠（sds）和0.1n的naoh。
（如同0.1n的酸干扰lowary法一样）。
3. 标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用beer 定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
1、试剂：
（1）考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml, 滤纸过滤。
最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250, 4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。
（2）标准蛋白质溶液：
纯的牛血清血蛋白，根据其纯度配制成100 ug/ml蛋白溶液
2. 器材：
（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器
试管编号0 1 2 3 4 5 6
蒸馏水 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
4、样品中蛋白质含量的测定
另取两支干净的试管（做一重复），加入合适浓度的待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
注意事项：
1、如果要求严格，最好在试剂加入后的5~20min内测定光吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。
2、若选择在旋涡混合器上混合，注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除。
3、不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。
塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。