单细胞凝胶电泳法测定镍化物对人血细胞的DNA损伤
单细胞凝胶电泳(SCGE)检测锰损伤神经元DNA
单细胞凝胶电泳(SCGE)检测锰损伤神经元DNA1陆彩玲，郭松超，鲁力，陈维平，邝晓聪广西医科大学公共卫生学院，广西南宁（530021）E-mail：lcling78@摘要：目的建立体外染锰细胞模型，探讨锰神经毒性的作用机制。
方法：以原代培养的成熟皮层神经元为靶，据本室前期试验结果确定低中高不同浓度的锰液（分别为0.2mmol/L,0.6mmol/L,1.0mmol/L），与神经细胞共孵育。
显微镜观察各组神经细胞形态学的变化，用单细胞凝胶电泳试验（SCGE）检测神经细胞的DNA损伤，以彗星细胞尾长及彗星样细胞百分率为评价损伤的指标。
结果：光镜下可见不同浓度锰孵育后神经细胞形态学发生改变，单细胞凝胶电泳试验显示神经细胞DNA出现不同程度的损伤，彗星尾长及彗星样细胞百分率较对照组明显增加（P＜0.01）。
尤以高浓度锰组损伤组严重，显著高于中低浓度组（P＜0.01）。
结论：锰不但能引起体外培养的神经细胞外在的形态学损伤，还可导致神经细胞DNA的损伤。
关键词：锰，单细胞凝胶电泳 (SCGE)，DNA损伤目前，随着生产工艺的改进和预防措施的加强，严重的职业性锰中毒已很少发生，但长期低剂量的锰暴露依然存在，并对接触者的潜在影响仍不可低估。
慢性锰中毒是进行性的、不可逆的病变，并且锰对接触者的危害正由临床型向亚临床型转变，因而更为敏感、特异的效应指标，以早期筛检出亚临床中毒者及高危人群，是今后锰神经毒性研究中重点解决的问题。
DNA损伤是遗传毒理学的一个重要研究领域，长期不可逆转的DNA损伤累积可诱导细胞突变、畸变。
单细胞凝胶电泳(Singl cells gel eletrophoresis,SCGE)又称彗星试验（comet assay），由Ostling等（1984）首创，后经Singh等（1988）进一步完善并逐渐发展起来的一种快速检测单细胞 DNA损伤的实验方法，适用于多种细胞，广泛应用于检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、监测环境污染物对机体的遗传损害、研究毒物致癌机制等方面，具有经济、简捷、灵敏等优点，日益广泛地应用在各种诱变剂的遗传毒性检测上。
第三章 复习生态毒理学基本研究方法2 (1)
assay)是近 期较常用的DNA加合物的半定量检测方法， 它由Randerath于1981年建立。该法的基本 原理是，与外源性物质形成加合物的单核苷 酸，可抵制酸酶的降解，并被标记上32P，从 而通过放射性的定量分析检测所形成的DNA 加合物。
(二)姐妹染色单体交换试验
姐妹染色单体交换试验(sister
室外水生微宇宙的每个试验单元为6m3，除浮游植 物、浮游动物和细菌外，生物群落还包括鱼类、大 型水生植物和无脊椎动物，其设计条件列入表3.6。 室外水生微宇宙的设计具有较大的弹性，它可以是 一个小型池塘。 在室外水生微宇宙的设计中，控制试验重复组达到 统一温度的基本方法有两个：
一是把试验装置设置在地下，以土壤作为温度调控器，
(四)PCR—SSCP技术在毒理学研究中的应用
如Maino等在1992年将该项技术引入化学致
癌分子机制的研究领域，在化学制癌剂诱变 的小鼠鳞状癌细胞中检出了特异性H-ras基因 第13位密码子的点突变。 谭明家等于1997年以甲基丙烯酸环氧丙酰 (GMA)体外诱导人胚肺成纤维细胞，分离转 化细胞克隆，应用PCR扩增P53基因第5和第 8外显子的DNA片段，银染单链构型多态分 析，发现经三次GMA处理后，p53基因第8外 显子发生突变。
1)制片； 2)裂解细胞； 3)电泳； 4)染色； 5)图像分析。
3．单细胞凝胶电泳技术在生态毒理学研究中的 应用 (1)DNA损伤与修复的研究 己对多种化学物质诱导的DNA损伤作用作 过检测，如金属化合物、氧化剂、烷化剂和 交联剂等。 (2)遗传毒性评价 (3)生物监测 SCGE首先应用于放射监测，目前多以人 外周血淋巴细胞作为材料。 (4)细胞凋亡的研究
(三)PCR—SSCP分析技术的特点
dna琼脂糖凝胶电泳实验报告
dna琼脂糖凝胶电泳实验报告DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告引言：DNA琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分子生物学实验技术，用于分离和分析DNA 分子。
本实验旨在通过琼脂糖凝胶电泳技术，对DNA分子进行分离和鉴定，以便更好地了解DNA的结构和功能。
实验材料和方法：实验所需的材料包括琼脂糖凝胶、DNA标准品、DNA样品、缓冲液和电泳仪等。
首先，我们制备了琼脂糖凝胶，然后将DNA标准品和待测DNA样品与DNA加载缓冲液混合。
接下来，将混合液注入琼脂糖凝胶槽中，并进行电泳。
实验结果：经过电泳后，我们观察到琼脂糖凝胶上出现了一系列DNA条带。
根据标准品的条带迁移距离，我们可以推断出待测DNA样品的分子大小。
通过比较待测样品与标准品的条带迁移距离，我们可以进一步确定待测样品中的DNA分子的大小。
讨论：琼脂糖凝胶电泳是一种基于DNA分子大小的分离技术。
在琼脂糖凝胶中，DNA 分子会受到凝胶孔隙的阻碍，较大的DNA分子迁移速度较慢，而较小的DNA分子则迁移速度较快。
通过测量DNA分子的迁移距离，我们可以推断出其分子大小。
在实验中，我们使用了DNA标准品作为参照物，通过标准品的迁移距离，我们可以建立一个标准曲线，从而对待测样品中的DNA分子大小进行估计。
这种方法可以应用于DNA样品的定性和定量分析。
需要注意的是，琼脂糖凝胶电泳实验的结果受到多种因素的影响，如琼脂糖凝胶浓度、电场强度和电泳时间等。
因此，在进行实验时，我们需要控制这些因素，以确保实验结果的准确性和可靠性。
结论：通过DNA琼脂糖凝胶电泳实验，我们成功地分离和鉴定了DNA分子。
这项实验为我们进一步研究DNA的结构和功能提供了基础。
同时，琼脂糖凝胶电泳技术也广泛应用于生物医学研究、法医学和遗传学等领域，为科学研究和医学诊断提供了重要的工具和方法。
总结：DNA琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分离和鉴定技术。
通过电泳实验，我们可以分离不同大小的DNA分子，并通过测量其迁移距离来推断其分子大小。
【国家自然科学基金】_单细胞凝胶电泳试验_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140731
推荐指数 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2010年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
科研热词 dna损伤 造血细胞 苯并[a]芘 臭氧 脐血 皮肤变态反应 氯化消毒 染色体损伤 单细胞凝胶电泳 体外扩增 五氯酚钠 hepg2细胞 dna聚合酶β
推荐指数 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
科研热词 dna损伤 镍 重金属 细胞毒性试验,免疫 细胞增殖 细胞凋亡 氧化性dna损伤 拟南芥 彗星试验 吡咯烷二硫代氨基甲酸盐 原生质体 单细胞凝胶电泳 pm10 nf-κ b抑制剂 k562细胞 hepg2细胞 dna链断裂
2012年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
科研热词 彗星试验 氧化应激 抗氧化剂 微生物 保护 高甲基化 肝肿瘤/遗传学 细胞恶性转化 红芪/药理学 氯化镉 有机污染物 多糖类/药理学 x线/副作用 n-乙酰半胱氨酸 mgmt dna损伤/辐射效应 dna损伤
2008年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
科研热词 dna损伤 锰 细胞毒性 纳米碳 纳米氧化锌 环境污染 小鼠胚胎成纤维细胞 单细胞凝胶电泳(scge) sh-sy5y pcb153 pbde-47 dna修复基因
推荐指数 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
推荐指数 4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2011年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
2011年 科研热词 推荐指数 dna损伤 2 马粪海胆 1 马氏珠母贝 1 血淋巴细胞 1 荧光原位杂交技术 1 苯并[a]芘 1 细胞增殖 1 甲醛 1 检测 1 损伤与修复 1 彗星试验 1 彗星拖尾 1 应用 1 基因损伤 1 单细胞水平 1 单细胞凝胶电泳( scge) 1 单细胞凝胶电泳 1 0 #柴油 1
【国家自然科学基金】_单细胞凝胶电泳技术_基金支持热词逐年推荐_【万方软件创新助手】_20140803
推荐指数 4 4 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2009年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
2008年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
科研热词 单细胞凝胶电泳 dna损伤 脑细胞 液态甲醛 凋亡 运动疲劳 脾淋巴细胞 胭脂红 肿瘤坏死因子-α 纳米tio2 穿孔素 碱性单细胞凝胶电泳 电生孔技术 激光 活性氧 氧化应激 心肌细胞 彗星实验 小鼠 内在途径 免疫技术 光催化氧化 人类免疫缺陷病毒 pten mda-mb-231细胞 lovo肠癌细胞 jaspine b dna氧化损伤 3t3细胞
推荐指数 7 3 2 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
2010年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39
2012年 序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46
彗星实验
彗星实验彗星实验彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验。
实验原理：它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。
当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到电解液中，而核DNA由于分子量太大不能进入凝胶而留在原位。
在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。
由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成"彗星"状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。
DNA 受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。
通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。
该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。
同时，这种技术只需要少量细胞。
实验材料：玻片、琼脂糖、细胞裂解液、碱性解链溶液（PH>13,200mM NaOH,1Mm EDTA）、电泳槽、超纯水、DAPI、PBS、荧光显微镜。
实验步骤：1.制片：配制1%的琼脂糖凝胶，于微波炉中加热融化后，浸泡磨砂玻片，用吸水纸将玻片滑面及四周吸干，自然晾干备用；2.细胞处理：将细胞消化收集，离心后吸弃上清，用预冷的1*PBS清洗细胞一次，以1*10^5细胞/ml悬浮细胞；3.铺胶：将细胞与凝胶以一定的比例（1：10）混匀后迅速滴于玻片上，在显微镜下观察细胞的数目（注意调整比例及铺板均匀），4℃黑暗环境中固化10min；4.裂解：轻轻取出玻片，将玻片浸于预冷的细胞裂解液中，4℃避光裂解30-60min;5.解旋：从裂解液中取出载玻片，用PBS浸泡玻片3次，每次3mim,用纸巾吸去玻片上的液体，置于水平电泳槽，加入新鲜配制的碱性电泳缓冲液至高于玻片表面3mm以上，避光解旋30min;6.电泳：电压30V,电流300Ma,电泳30min。
彗星试验
单细胞凝胶电泳分析法单细胞凝胶电泳分析法(彗星分析法)治愈癌症是一个难题,长期以来科学家们一直在苦苦探索.我们目前知道,致癌的过程与许多因素有关，但如果我们能阻止其中的任何一个步骤，癌细胞便无法形成。
因此,探测致癌物质的技术与癌细胞的及时发现就显得尤其重要！然而截至目前为止，科学家们仍无法研究出一种简易基因测试法或综合的方法来检测出可能的致癌物。
因此，致癌物对ＤＮＡ的作用仍是癌症研究的一个重要课题。
遗传毒物学为一专门研究化学及各类物质对人体遗传基因影响的科学。
人体每天暴露在大量的化学物质当中，为了诊测这些物质对人体ＤＮＡ的影响，科学家们发明了多种测定方法，然而，多年来人们所使用的这些测试方法却不能准确与快速的辨识出会使人体致癌的物质。
为了解决这些问题，单细胞凝胶电泳法（Single Cell Gel Assay）应运而生，通常亦称之彗星分析法（Comet Assay）。
它之所以称为彗星分析法是因为被破坏的DNA形似彗星，此方法已被证实是最具敏感性又最具快速性的方法。
研究人员使用这种方法可在２４小时内获得初步结果，在十天之内能得到结论性的证据。
此种测定方法速度远快于其它方法，不仅可以测出某种物质是否是致癌物，而且还可测出被破坏细胞的损害程度。
彗星分析法是用来判别某种物质是否是致癌物，并衡量其对人体ＤＮＡ修补的影响程度，这一分析过程是将健康的人体白血球接触于被测试的物质后，然后再用彗星分析法来进行测试，如果被测试的物质是致癌物质，那么ＤＮＡ将被破坏，而被损坏的ＤＮＡ将开始游离细胞核，形成彗星形状。
ＤＮＡ受到致癌物质的损坏愈大，ＤＮＡ碎段就愈多，愈小的ＤＮＡ碎段游离的速度就愈快，也游离愈远，因而形成了彗星的尾部，而较大的一些碎段位置则靠近细胞核，因而形成彗星的头部。
ＤＮＡ碎段的游动的程度不同 使它呈现出彗星状，使研究人员能很容易看清细胞的损害程，彗星的长度与ＤＮＡ的损害程度有关，此长度是指从细胞核到彗星尾端的距离，也就是说，彗星尾端愈长，细胞的损害程度愈大。
SCGE法检测DNA损伤(包括DNA单链断裂和DNA交联)
SCGE法检测DNA损伤SCGE的原理（中性电泳液，高盐和变性剂检测双链断裂；碱性检测单链，双链断裂和碱不稳定性）SCGE技术是一种在单细胞水平上检测有核细胞DNA损伤和修复的方法。
该技术的原理是基于有核细胞的DNA分子量很大，DNA超螺旋结构附着在核基质中，用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜破坏，使细胞内的RNA、蛋白质及其它成分进入凝胶，继而扩散到裂解液中，唯独核DNA仍保持缠绕的环区(Loop)附着在剩余的核骨架上，并留在原位。
如果细胞未受损伤，电泳中核DNA因其分子量大停留在核基质中，经荧光染色后呈现圆形的荧光团，无拖尾现象。
若细胞受损，在中性电泳液(pH8)中，核DNA仍保持双螺旋结构，偶有单链断裂(SSBs)并不影响DNA双螺旋大分子的连续性。
只有当DNA双链断裂(DSBs)时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星。
如果在碱性电泳液(pH>13)中，先是DNA双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂的碎片分子量小即可进入凝胶中，在电泳时断链或碎片离开核DNA向阳极迁移，形成拖尾。
细胞核DNA受损愈重，产生的断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移的DNA量多，迁移的距离长，表现为尾长增加和尾部荧光强度增强。
因此，通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可定量测定单个细胞DNA损伤程度。
1. 仪器及试剂冰箱，载玻片，水平电泳槽，荧光显微镜。
不含Ca2+、Mg2+的PBS (PH=7.4)；正常溶点琼脂糖（NMA）及低溶点琼脂糖（LMA）（0.6％溶于PBS）；细胞裂解液（2.5 M NaCl, 100 mM Na2EDTA, 10 mM Tris-HCl, 1%肌氨酸钠, PH=10, 用前加1％TritonX-100, 10% 二甲亚砜（DMSO））；电泳缓冲液（0.3 M NaOH, 1 mM Na2EDTA, PH=13）；0.4 M Tris-HCl（PH=7.5）；无水乙醇；20-30μg/mL 溴化乙锭（EB）。
单细胞凝胶电泳
五 思考题
• 试分析三层胶浓度不同的原因 • 试分析影响单细胞凝胶电泳实验结
果的因素。
单细胞凝实验胶十电七泳技术
单细胞凝胶电泳技术
——丁书茂 ——丁书茂
ห้องสมุดไป่ตู้
• 单细胞凝胶电泳技术single cell gel electrophoresis, SCGE ;也称彗星试验(et assay) ，是Ostling O和Johanson KJ首次 提出，后经Singh等进一步完善的一种在单 个细胞水平上检测DNA损伤 交联和修复的方 法 因其简单、灵敏、低耗、快速等优点而 广泛应用于生物检测、遗传毒理、流行病学 调查等诸多方面。
• 第三层胶：移开盖片;滴加100μL质量 分数为0 5%的LMA于第二层胶上，加盖 片， 4℃凝固10min
4 裂解
• 将制好的凝胶放入冷的裂解液中;4℃ 下裂解2小时；
• 裂解液使用时新配铺完第二层胶后即可配制
90ml lysis solution 10ml DMSO 1ml TritonX100
3 制片
• 第一层胶：在完全磨毛的载玻片上 铺180μL质量分数为 1%的正常熔点 琼脂糖NMA;室温固化10min；
• 可将玻片用吹风机稍微加热，以延 缓琼脂糖凝固
• 第二层胶：取50μL 质量分数为0 8%的 低熔点琼脂糖LMA和30μL的细胞悬液; 混匀后滴加于第一层胶上，加该盖片使 其均匀铺开，4℃凝固10min；
5 解旋
• 从裂解液中将载玻片取出;在蒸馏 水中洗去过多盐，晾干
• 将新配制的电泳缓冲液倒入电泳 槽中，约覆过载玻片0 25cm，盖 上 盖 子 ， 在 高 pH 电 泳 缓 冲 液 中 放 置20 min以便DNA解螺旋。
彗星实验
Comet Assay 彗星分析系统软件功能:彗星试验-单细胞凝胶电泳Single cell gel electrophoresis是一种快捷、高灵敏度的检测DNA受损的方法.Comet Assay 专业彗星试验图像分析软件,提供专业快速的测量方法。
测量指标包括头半径，尾长度，积分光密度，头/尾DNA含量比例，尾矩，Olive 矩等多种参数。
具有自动或手动调节分割彗星头部和尾部功能同时提供对双染色系统的分析系统可广泛用于环境毒理学中对DNA具有损伤作用的分析：如紫外光、电离辐射、氧自由基等因素造成的DNA损伤。
以及细胞凋亡，抗癌药物的药物毒理学研究，遗传毒理研究和肿瘤治疗的跟踪监测等单细胞凝胶电泳(彗星试验):原理、应用和局限性彗星试验：原理、应用和局限性1. 前言过去十年中，彗星试验或单细胞凝胶电泳（SCGE）已成为一个评定DNA损伤的标准方法，广泛应用于遗传毒性试验、人类生物监测和分子流行病学、生态毒理学以及DNA损伤修复的基础研究，且因其简单、灵敏、多功能、快速、经济实用而赢得了广大科研工作者的青睐，和其有关的文献数目逐年上升。
在应用彗星试验时不会过多去考虑它如何运作和它提供何种信息，因为它在论证DNA损伤中的成功已足以证明它的价值。
这一点实在太可惜，因为它不仅能告诉我们细胞内存在的损伤的类型，而且能告诉我们损伤的程度。
尽管彗星试验是检测DN A断裂的基本方法，但由于对特异性核酸内切酶损伤的引入使其可以检测紫外线诱导的嘧啶二聚体，氧化碱基和烷基化损伤。
2.检测原理和检测指标2.1 背景二十世纪七十年代，Peter Cook和其同事们制定了一种用非离子去污剂使细胞溶解来研究核结构的方法。
这种处理除去胞膜、胞质和核质，并使核小体破裂（几乎所有的组蛋白均被浓盐提取），剩下的就是由核基质或RNA、蛋白质组成的支架以及DNA所构成的类核，其DNA的双螺旋以核小体的组蛋白为核心形成负超螺旋结构。
超螺旋的存在使DNA不能自由旋转，Cook 等提出一个模型，DNA间断的附加于基质，有效的形成一系列环状、而不是线性分子。
不同外部条件下DNA损伤检测方法比较
不同外部条件下DNA损伤检测方法比较DNA损伤检测方法是一项重要的实验技术，广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。
不同的外部条件会对DNA分子产生不同程度的损伤，而准确、快速地检测DNA损伤是了解细胞DNA损伤程度和维修能力的关键。
1. 光谱法（Spectrophotometric Assay）光谱法是一种常用的DNA损伤检测方法，可以测定DNA溶液中吸收峰的强度和位置。
当DNA分子发生损伤时，DNA的吸收光谱会发生变化。
光谱法可以通过测定DNA吸光度的变化，快速检测DNA的损伤程度以及不同类型的损伤，如DNA碱基的氧化、单链或双链断裂等。
2. 单细胞凝胶电泳法（Single Cell Gel Electrophoresis）单细胞凝胶电泳法，又称为碱性单细胞凝胶电泳法或“大猴面包”实验，是一种敏感而广泛应用的DNA损伤检测方法。
该方法通过将单个细胞包裹在含有凝胶的电泳缓冲液中，将DNA电泳迁移出现在凝胶上，并通过染色方法显示出尾部。
DNA损伤程度越高，尾部长度越长，与尾部长度成正比。
单细胞凝胶电泳法可以评估细胞整体的DNA损伤程度，并可用于观察不同处理条件下DNA损伤的变化趋势。
3. PCR扩增法（Polymerase Chain Reaction）PCR是一种常用的DNA扩增技术，也可以用于检测DNA损伤。
在DNA发生损伤的位置，由于DNA损伤导致DNA链的断裂，PCR扩增的效率会降低。
通过比较PCR扩增产物的数量和长度，可以评估DNA损伤的程度和类型。
PCR扩增法可以快速检测大量样本中DNA的损伤情况，适用于高通量实验，并且可以探索DNA损伤的具体位置和频率。
4. 荧光染色法（Fluorescent Staining）荧光染色法是一种基于荧光分子和DNA结合之间的相互作用而设计的DNA损伤检测方法。
通过染料与DNA结合后的发射荧光强度的变化，可以评估DNA的损伤程度。
不同的荧光染料对不同类型的DNA损伤有特异性，可以选择合适的荧光染料来检测特定的DNA损伤类型。
DNA损伤检测方法及DNA修复机制概述
DNA损伤检测方法及DNA修复机制概述DNA是生物体内重要的遗传物质，它携带了生物体遗传信息的编码。
然而，由于各种外界和内源性因素的影响，DNA分子可能会受到损伤，这可能导致细胞功能异常甚至引发严重的疾病，如癌症。
因此，准确检测DNA损伤并了解DNA修复机制对于维持细胞的稳态至关重要。
DNA损伤检测方法是一种评估DNA损伤程度和类型的基因学工具。
下面将介绍常见的DNA损伤检测方法和DNA修复机制的概述。
一、DNA损伤检测方法1. 单细胞凝胶电泳（SCGE）：SCGE是一种常用的DNA损伤检测方法。
它通过将细胞固定在凝胶上，通过电场作用将损伤的DNA片段移动到凝胶上。
损伤的DNA片段在凝胶上呈现出“尾巴”状，以此来评估DNA损伤的程度。
2. 酶联免疫吸附分析（ELISA）：ELISA是一种免疫学方法，可以用于检测DNA损伤的体内和体外标志物。
通过特异性抗体与已修复的DNA损伤标志物结合，ELISA可以定量评估DNA损伤的程度。
3. 荧光染料：通过与DNA结合的荧光染料，可以直接观察和评估DNA损伤。
常见的荧光染料有乙酰丙酮、DAPI、SYBR Green等。
这些染料与损伤DNA结合后会发出荧光信号，通过荧光显微镜观察和图像分析，可以评估DNA损伤的程度和位置。
二、DNA修复机制概述DNA修复是细胞对于DNA损伤的主要生理响应机制，细胞通过多种方式修复DNA损伤，以维持基因组的完整性。
1. 直接修复：直接修复是最简单的DNA修复机制之一，通过修复DNA中的化学修饰来恢复DNA的完整性。
常见的直接修复机制包括光反应修复、DNA甲基化修复和脱氨酶修复等。
2. 错配修复：错配修复主要用于修复DNA中的碱基配对错误。
细胞通过识别和修复DNA链上的错配配对，保证了DNA双链的稳定性和准确性。
错配修复机制包括互补链修复（MMR）和核酸切除修复（NER）等。
3. 核苷酸切除修复：核苷酸切除修复是修复DNA中严重损伤的一种重要机制。
单细胞凝胶电泳(SCGE)技术
单细胞凝胶电泳（Single Cell Gel Electrophoresis，SCGE）技术单细胞凝胶电泳（SCGE），因其细胞电泳形状颇似彗星，又称彗星试验（Comet Assay）。
它用于检测单个哺乳动物细胞DNA的损伤，与传统方法相比，因其快捷，灵敏，样品消耗少，费用较低，时至今日已广泛应用于各种有核细胞经受试因子作用后诱导出现的DNA损伤和修复的实验，成为遗传毒理学、氧化损伤、DNA交联损伤、放射生物学等领域中一项重要的研究工具。
【1，2】近年来，国内关于这一方法的应用的报道日益增多【3～5】，可以预见，SCGE技术随着其方法的逐渐标准化，定将在今后得到更加广泛的应用。
因此，本文拟就有关SCGE方法的产生、操作程序、影响因素等作一综述。
1.SCGE的诞生（DNA损伤检测方法的研究）DNA损伤与修复是遗传毒理学及分子流行病学研究的一个重要目标，很久以前人们就在寻求一种合适的检测这一效应的方法。
从使用DNA材料上分可将各种方法归为两类：（1）以裸DNA为材料检测，即通过去污剂、蛋白水解等方法去除附着于DNA上的其他细胞组分，分离出DNA；（2）以拟核为材料，即DNA构型（环区）保留于核骨架上，超螺旋结构不变。
SCGE技术属于第二种方法，显然，拟核成分的检测较裸DNA要方便得多【6】。
在此基础之上，早期的同位素示踪法因需提供同位素标记的样品，并预先确定合适的标记部位。
为解决此不便，目前多采用直接检出DNA损伤后直接生成的单链断裂【7】。
最初，Lett等应用碱性蔗糖梯度离心法测定DNA单链分子量，用于研究哺乳动物细胞的DNA损伤【8】。
不久Kohn等又将其改进为更为灵敏的碱性洗脱法，成为一种较稳定的检测方法【9】。
但是这些技术的灵敏度仍不能满足现在研究的要求，干扰因素多，同时要有放射性同位素示踪。
1984年由Ostling和Johanson首先介绍的SCGE技术在这些方面得到了显著改善，特别在1988年经Singh等完善的单细胞碱性微板电泳技术后，本方法已成为检测单个细胞DNA单链断裂的首选方法【2】。
检测细胞DNA断裂损伤效应的彗星实验法的改良
检测细胞DNA断裂损伤效应的彗星实验法的改良赖金龙;付倩;任莎;吴国;陶宗娅;张红;罗学刚【摘要】为了解决彗星实验过程中常出现的脱胶、细胞核分离操作繁琐、重复性低等问题,对彗星实验方法进行了改良,初步建立了彗星实验的快速操作流程.结果显示,通过对载玻片进行预处理,可确保凝胶悬挂均匀;采用改良机械法分离的细胞核浓度适中;以0.5％ (w/v)涂层琼脂糖作为基层、以1.5％ (w/v)低熔点包埋琼脂糖作为叠加层的“双层凝胶法”,辅以“推片法”铺胶,操作便捷且不发生脱胶现象;细胞核膜经裂解处理后再进行电泳和荧光观察,彗星图像清晰,杂质少.应用改良后的彗星实验方法,操作简便,耗时更短,实验效果良好,可快速检测出细胞DNA损伤效应.【期刊名称】《生态毒理学报》【年(卷),期】2015(010)004【总页数】8页(P195-202)【关键词】铯;蚕豆根尖细胞;遗传毒性;DNA损伤;彗星实验;改良【作者】赖金龙;付倩;任莎;吴国;陶宗娅;张红;罗学刚【作者单位】四川师范大学生命科学学院,成都610101;四川师范大学生命科学学院,成都610101;四川师范大学生命科学学院,成都610101;四川师范大学生命科学学院,成都610101;四川师范大学生命科学学院,成都610101;四川师范大学生命科学学院,成都610101;西南科技大学教育部生物质材料教育部工程研究中心,绵阳621010【正文语种】中文【中图分类】Q331彗星实验(comet assay)也称单细胞凝胶电泳实验(single cell gel electrophoresis,SCGE)，是一种操作简单、有效评估细胞DNA损伤的方法[1]。
其原理是器官或组织细胞受外源因素(如辐射、重金属等)影响，细胞中的DNA发生单链或双链断裂，经裂解后，DNA解旋，在电场作用下，DNA断片迁移出细胞核，形成彗星状的电泳图谱；而正常细胞的大分子量DNA在电场作用下迁移距离较短，DNA仍保留在细胞核的范围，形成圆形或轻微拖尾的图谱[2]。
单细胞凝胶电泳试验
（一）原理单细胞凝胶电泳试验（，）是近年来经过不断完善逐步发展起来地一种快速检测单细胞水平损伤地新技术.文档来自于网络搜索有核细胞地分子量很大，超螺旋结构附着在核基质中，分析技术是先用琼脂糖凝胶将细胞包埋在载玻片上，在细胞裂解液地作用下，细胞膜、核膜及其它生物膜遭到破坏，使细胞内地、蛋白质及其它成分外泄到凝胶中，随后扩散到细胞裂解液中，但核仍保持缠绕地环区附着在剩余地核骨架上，并留在原位.如果细胞未受损伤，电泳时，核因其分子量大停留在核基质中，荧光染色后呈现圆形地荧光团，无拖尾现象.若细胞受损，在中性电泳液（）中，核仍保持双螺旋结构，虽偶有单链断裂，但并不影响双螺旋大分子地连续性.只有当双链断裂时，其断片进入凝胶中，电泳时断片向阳极迁移，形成荧光拖尾现象，形似彗星.如果在碱性电泳液（>）中，先是双链解螺旋且碱变性为单链，单链断裂地碎片分子量小可进入凝胶中，电泳时断链或碎片离开核向阳性迁移，形成拖尾.细胞受损愈重，产生地断链或碱易变性断片就愈多，其断链或断片也就愈小，在电场作用下迁移地量也就越多，迁移地距离越长，表现为尾长地增加和尾部荧光强度地增强.因此，通过测定迁移部分地光密度或迁移长度可定量地测定单个细胞地损伤程度.文档来自于网络搜索（二）仪器．全磨砂载玻片．号盖玻片．微量吸管和吸头．冰盒．电泳仪．荧光显微镜（三）试剂．正常熔点及低熔点琼脂糖.．细胞裂解液：，，，％肌氨酸钠，用调值到.用前加％和％.文档来自于网络搜索．碱性电泳液：，调到.．缓冲液（）.．荧光染料：µ地溴乙锭，也可用µ地吖啶橙或µ地碘丙锭等.（四）方法.制备细胞悬液单细胞来自人、动物(小鼠、大鼠、狗、鱼、鸡等)和植物地组织或培养地细胞系，或从活体组织分离出地原代细胞等.动物体内测试可以根据靶器官适当选择有针对性地原代细胞进行测试.选择合适地培养基和缓冲液，分离纯化制成单细胞悬液，用台盼蓝法测定细胞存活率>，细胞密度为(～)×备用.文档来自于网络搜索. 凝胶制片为了加强凝胶对玻片地附着力，在载玻片上先铺一基底层：在磨砂面上滴加℃水浴后地％～％正常熔点琼脂糖µ.然后再铺胶层.第层：取密度为×地细胞悬液，以体积比为：地比例与预热到℃地％低熔点琼脂糖混匀，取µ加到第层胶上，铺匀凝固；第层：以％低熔点琼脂糖覆盖中层细胞，这样制成细胞“三明治”. 文档来自于网络搜索.细胞裂解将细胞“三明治”载玻片浸入新配制地预冷℃地裂解液中，保持℃ .解旋细胞裂解后，将载玻片置于水平电泳槽内，用新配制地碱性电泳液盖过胶面约～，加盖避光，置于℃～.使充分解旋.碱性条件下（>）可使展开、解旋为单链，碱性易变性区段() 变为单链断片( ) .文档来自于网络搜索.电泳解旋结束后，通电电泳.电泳条件为和，电泳～.或按～确定电压.最适条件实验者可自行选择.最好能使阴性对照有部分细胞出现短拖尾，以保证试验有足够地敏感性并减少实验室间差异.文档来自于网络搜索.中和与染色电泳后取出载玻片，在缓冲液（）中浸没或漂洗次，每次.每张胶板上滴加～µ荧光染色剂，后用蒸馏水洗涤.以上各步骤应在黄或红光下操作.中和后地凝胶片应在内染色，以免过多扩散.否则应将之浸入无水乙醇或无水甲醇中脱水左右，或在室温中晾干.对于干燥地凝胶片，使用中性缓冲地甲醛处理数分钟，将有利于长期保存.文档来自于网络搜索.结果观察结果观察有肉眼观察测量和图像分析两种方式.在荧光显微镜下，观察单细胞电泳图像(放大～倍)，每片记数～个细胞，每个剂量组检查个细胞.无损伤地细胞表现为一圆形荧光细胞核.受损地细胞所产生地断片游动移出细胞核之外，向阳极伸延而形成“慧头”带“慧尾”地慧星现象.文档来自于网络搜索镜下观察时，首先应记录出现拖尾地细胞数，计算拖尾细胞率.同时用目镜测量拖尾细胞地尾长，统计各试验（剂量）组地平均尾长.尾长是指断片从其主核向电泳正极迁移地距离，而不同地实验室尾长测定方法有所不同.但并不妨碍将各剂量组平均尾长与阴性对照组进行比较.文档来自于网络搜索图象分析需有相应地设备和专门地分析软件.使用电脑逐个对细胞进行图像分析.应用图像分析系统可得到更多地分析参数.目前主要观察指标有尾长（）、慧尾地百分含量、尾距（）、尾块( )和尾惯量（）等.尾长( )即迁移地长度，在低损伤剂量范围内与损伤呈线性关系；尾矩是尾长与慧尾百分含量之乘积，在高损伤剂量下与损伤程度呈线性关系；尾块( )即彗星尾部分散地大小不一地断片组成，与损伤程度有关；尾惯量是与每个尾块地面积、平均荧光强度、在轴上与彗核中心距离有关地综合性指标.目前通常选用迁移细胞率、尾长、尾矩作为检测指标.文档来自于网络搜索目前，国外彗星电脑分析软件主要有英国公司地、美国公司地()、德国公司地分析系统、捷克公司地彗星图像分析系统等，这些软件能定量测定尾部长度、尾部面积、尾部力矩、尾部力矩臂、尾部力矩惯性、细胞密集程度、尾部地百分比、碎片等.但这些软件均需与其相应地仪器设备配套使用，价格十分昂贵.国内也正在开发一些分析系统.文档来自于网络搜索除了昂贵地商业软件外，也有一些免费地彗星分析软件.如等所设计地分析软件( ) 能测量彗星强度、尾长、头面积、尾面积、尾部含量、尾矩等多项参数. 等在地基础上研制了另一软件()，该软件可在多种硬件及软件平台上运行，所测量地彗星参数中增加了尾矩，而且用户界面更友好.这个免费软件地一个特点是，它们地源代码是公开地，人们可以看到每一个彗星参数地运算方法和编写程序.因此，软件使用者可以根据实验目地地不同来改变这些参数地运算方法和计算程序，从而建立一个新地测量遗传损伤地参数.这些源代码文件很简单，可以自行改写，以便使之适用于分析要求，如计算试验菌落数以及电泳凝胶地分析等.年建立了免费下载系统，其网址为：和.近年来使用较多地国外免费分析软件见以下网址：；文档来自于网络搜索.随着彗星试验地发展，在资源共享地网络空间里，会有更完善更方便地彗星分析软件出现.文档来自于网络搜索（五）注意事项虽然具有简便、快速等特点，但在整个实验过程中可能会受到诸多因素地影响而难以得到理想地实验结果.下面是几点注意事项..单细胞悬浮液地制备：最好将细胞数目调至约×个.如果细胞数目过高，位于凝胶不同层面地细胞可能会发生相互重叠，难以对其结果进行分析；如果细胞数目过低，则很难对实验结果进行统计学分析.文档来自于网络搜索.制片：目前制片地方法主要有三种:“三明治”凝胶、双层凝胶和单层凝胶.制片总地原则是: 获得牢固稳定凝胶地同时，避免额外地损伤与修复.文档来自于网络搜索.电泳条件：一般选用低电压和短时间.电压过高、电泳时间过长虽然能够提高检测地灵敏度，但也会使正常地细胞形成拖尾而出现假阳性结果；反之，电压过低、电泳时间过短，受损细胞不会形成拖尾而出现假阴性结果.文档来自于网络搜索.实验条件：整个实验过程需在低温(约℃) 和暗光下进行，避免额外地损伤和修复，防止假阳性和假阴性结果地产生.文档来自于网络搜索.与凋亡细胞断片地区分：由于试验剂量过大或细胞保存不当及某些不适地试验条件地影响，会出现细胞坏死和凋亡，坏死和凋亡细胞会产生大量断片，也会在电泳以后出现拖尾.由于它们与常见断裂剂诱导地损伤在形成机制、生物学和毒理学上地意义迥然不同，应对它们进行区分，排除对实验结果地干扰.在碱性彗星试验中，凋亡细胞与普通链断裂损伤细胞地差异主要是：①在彗星形态上，凋亡细胞地断片彗星头很小，头长不超过µ，仅由核内不能裂解地与蛋白质框架相连地片段组成，亮度高，慧尾近似椭圆形，纵径与横径地比值小，彗星头与慧尾之间往往有一分离带.而普通链断裂，彗星头直径一般都大于µ，尾纵径明显大于横径，同时彗星头与慧尾之间没有明显界限，因为一部分慧尾是由单个链断端地延伸形成，它地另一端仍与主核相连.②无论在低剂量组还是在高剂量组，凋亡细胞地断片形态基本一致，尾长也基本相同，其剂量反应关系表现为凋亡指数增加，而不是尾长增加.而链断裂损伤地剂量反应关系表现为彗星尾长地增加.文档来自于网络搜索（沈孝兵，浦跃朴）。
晶状体上皮细胞DNA损伤的SCGE测定法
正 常熔 点琼 脂糖 和低 熔 点 琼 脂 糖 （ 海 华 舜 生 物 工 上 程 有 限公 司）溴 化 乙锭 （ｉ ａ 司 ）荧光 显微 镜 为 ； Ｓｍ 公 ｇ ； Ｏｙ ｐｓ ａｏ ； ｌ ｕ ｎ ｘ型 电泳仪 为 Ｄ Ｙ３ ｍ Ｖ Ｙ 一２型 （ 京六 一 仪 北
器 厂 ） 。
１２ 试 剂 的 配 制 ．
射线等）氧化损伤、 白质糖基化、 、 蛋 外伤、 生长因子受 损害 、 免疫反应 、 饮食 和药 物等 。白内障是 世界上首位 致盲 因素［ ， ２ 同时也 是我 国第 一 位 的致盲 眼病。近 年 ］
ａ ｅ Ｃ ｌ ｆ ａ ｇ ｒｕ ｓｗ ｒ ｐ ｅ ｒｄ ｔ ｉａ ｃ ｍｅａ ｇ ｓ ｆ ａ ｉｕ ｖ ｌ ， ａ ｅ ｄ ｄ ｔｉ ｃ ｎ ｂ ｇ ． ｅｌ ｏ ｍａ ｅ ｇ ｏ ｐ ｅｅａ ｐ ａｅ ｐ ｃ ｏ ｔｌｍａ ｅ ｒ ｓｌ ｅｓ ｔ ｔ ａ ｓａ — ａ ｅ ｓ ｄ ｄ ｙ ｌ ｉ ｏ ｖ ｏ ｅ ｈ ｈ ｎ —１ ａ． ￣
崔 ● ， 高维奇 ，刘 平 ，关立 南 ，于 莉 琳
单细胞凝胶电泳(SCGE)技术
单细胞凝胶电泳（Single Cell Gel Electrophoresis，SCGE）技术单细胞凝胶电泳（SCGE），因其细胞电泳形状颇似彗星，又称彗星试验（Comet Assay）。
它用于检测单个哺乳动物细胞DNA的损伤，与传统方法相比，因其快捷，灵敏，样品消耗少，费用较低，时至今日已广泛应用于各种有核细胞经受试因子作用后诱导出现的DNA损伤和修复的实验，成为遗传毒理学、氧化损伤、DNA交联损伤、放射生物学等领域中一项重要的研究工具。
【1，2】近年来，国内关于这一方法的应用的报道日益增多【3～5】，可以预见，SCGE技术随着其方法的逐渐标准化，定将在今后得到更加广泛的应用。
因此，本文拟就有关SCGE方法的产生、操作程序、影响因素等作一综述。
1.SCGE的诞生（DNA损伤检测方法的研究）DNA损伤与修复是遗传毒理学及分子流行病学研究的一个重要目标，很久以前人们就在寻求一种合适的检测这一效应的方法。
从使用DNA材料上分可将各种方法归为两类：（1）以裸DNA为材料检测，即通过去污剂、蛋白水解等方法去除附着于DNA上的其他细胞组分，分离出DNA；（2）以拟核为材料，即DNA构型（环区）保留于核骨架上，超螺旋结构不变。
SCGE技术属于第二种方法，显然，拟核成分的检测较裸DNA要方便得多【6】。
在此基础之上，早期的同位素示踪法因需提供同位素标记的样品，并预先确定合适的标记部位。
为解决此不便，目前多采用直接检出DNA损伤后直接生成的单链断裂【7】。
最初，Lett等应用碱性蔗糖梯度离心法测定DNA单链分子量，用于研究哺乳动物细胞的DNA损伤【8】。
不久Kohn等又将其改进为更为灵敏的碱性洗脱法，成为一种较稳定的检测方法【9】。
但是这些技术的灵敏度仍不能满足现在研究的要求，干扰因素多，同时要有放射性同位素示踪。
1984年由Ostling和Johanson首先介绍的SCGE技术在这些方面得到了显著改善，特别在1988年经Singh等完善的单细胞碱性微板电泳技术后，本方法已成为检测单个细胞DNA单链断裂的首选方法【2】。
彗星实验
彗星实验————————————————————————————————作者: ————————————————————————————————日期：ﻩ彗星实验(Cｏｍet ａsｓay)，又称单细胞凝胶电泳(Ｓiｎglｅ celｌ geｌeleｃtrophｏreｓｉs,SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[１～3],并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4］。
本实验对Ｓｉnｇh等[５]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。
用超净工作台上的紫外消毒灯［可发射波长为254 nm的紫外线(Ulｔraviｏlet,UV），属于UＶC波段范围]作为DＮA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞ＤNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度,验证改良的实验系统是否可靠,同时筛选并评价ＤNＡ损伤的分析指标。
１材料与方法1.1 细胞K５６2细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5% ＣＯ2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。
1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSＺ-20型,２0 W，天津市紫晶特种光源有限公司）。
1．３主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司）,９0% RPMI-1640培养液(Hyclonｅ公司）;双抗(青、链霉素，1０0 ＵＩ/mｌ);Trito ｎＸ-10０(Ｇenｖiew分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠（Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMＣ分装)；常熔点琼脂糖（Spaｎish分装)。
其余生化试剂均为分析纯。
电泳仪：由西北大学物理系提供;电泳槽:DYＣ33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜:Ｌeｉｃａ DM LB 2 (Ｌeｉｃａ公司)；彗星图象分析软件:CAＳP软件(cａsp-1．2.２,下载);CＯ２培养箱：BB16HＦ型(上海力申科学仪器有限公司);环地牌紫外辐照计（北京师范大学光电仪器厂）。
1.４实验分组及UV处理收集对数生长的K5６2细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于９5％，用Han ｋ's(ｐH7.４)调整细胞密度至1×１05/mｌ,接种于塑料培养皿中（ф=３5 mm,2 mｌ/plate)，然后进行紫外线照射（0.3 mW/cｍ２)。
单细胞凝胶电泳检测DNA损伤的方法及应用
六、未来展望
预计在未来，DNA凝胶电泳分析系统将会与更多前沿的生物技术相结合，如纳 米技术、微流体技术等，实现更高效的分离和检测。同时，随着精准医疗和基 因组学的发展，凝胶电泳将在疾病诊断和治疗、个性化医疗等方面发挥重要作 用。此外，随着环境科学和生态学的发展，凝胶电泳也将被广泛应用于环境 DNA样品的分析和研究。
五、结论
单细胞凝胶电泳技术是一种灵敏且实用的工具，可用于检测单个细胞的DNA损 伤。它已经广泛应用于环境科学、放射医学和遗传学等领域，为研究DNA损伤 和修复提供了重要的手段。尽管存在一些挑战和问题，但随着技术的不断发展 和完善，相信单细胞凝胶电泳技术在未来的研究中将发挥更大的作用。
参考内容二
方法
单细胞凝胶电泳的主要步骤包括收集单个细胞、细胞裂解、凝胶电泳和染色。 该技术的原理是基于DNA在凝胶中的迁移速率与DNA分子的大小和构象有关。 当DNA分子受到损伤时，其迁移速率会受到影响，从而可以通过电泳图像进行 观察和定量分析。
1、收集单个细胞：采用显微操作、流式细胞术或其他细胞分离技术收集单个 细胞。
单细胞凝胶电泳检测DNA损 伤的方法及应用
单细胞凝胶电泳（Single Cell Gel Electrophoresis，SCGE）是一种用于 检测单个细胞内DNA损伤的方法。该技术通过将单个细胞裂解后在凝胶上进行 电泳，可以检测到DNA的片段化程度和总DNA量的变化，从而评估细胞内DNA的 损伤程度。本次演示将介绍单细胞凝胶电泳检测DNA损伤的方法及其在各个领 域的应用，并通过具体案例进行分析和说明。
2、实验过程：收集单个白细胞或睾丸细胞，裂解后将DNA样本在凝胶上进行电 泳。通过观察电泳图像，发现经过辐射处理的样品中出现了明显的DNA片段化 现象，而对照样品则没有。同时，通过定量分析软件对电泳图像进行半定量分 析，比较不同样本中DNA片段化和总DNA量的变化情况。
抗肿瘤药物对护士职业损害的现状及对策
抗肿瘤药物对护士职业损害的现状及对策抗肿瘤药物对人体的肿瘤组织及正常组织均有抑制和杀伤作用，随着抗肿瘤药物的广泛开发及临床应用，职业接触抗肿瘤药物的危害日渐加重，职业损伤已成为不容忽视的问题。
对国内外近年来护士职业性接触抗肿瘤药物的危害、预防对策文献进行综述。
旨在进一步认识抗肿瘤药物对护士职业的危害，加强对接触抗肿瘤药物防护的重要性认知，促进相关防护措施落实，提高护理管理效能，保障群体健康安全，为制订及时、有效的接触抗肿瘤药物防护干预对策提供规范性的参考依据。
[Abstract] Anti-tumor drugs can exert suppressive and cytotoxic effect on both human tumor and normal tissues. With the rapid development and wide clinical application of anti-tumor drugs，the risk of the occupational contact with the drugs increases dramatically and the issues about drug-associated occupational hazard require more attention. Heretofore，we reviewed recent documents about the hazard and preventive strategies of the nurse occupational contact with the anti-tumor drug in order to better understand the risk of the drug contact and the necessity of the occupational protection. It would also help to establish and administrate a more timely and effective protective policies and strategies against anti-tumor drug contact in hopes of ensuring the group safety and health of the nurse population.[Key words] Anti-tumor drugs；Nurse；Occupational damage；Tissue environment；Nursing management从1940年后期抗肿瘤药物问世以来，已有50多种抗肿瘤药物用于癌症治疗，细胞毒性剂具有致突变、致癌及致畸作用[1]。
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单细胞凝胶电泳法测定镍化物对人血细胞的DNA损伤孟建峰 庄志雄 倪祖尧 摘要 为研究镍化物对人血细胞D NA的损伤情况,用单细胞凝胶电泳法测定了不同剂量的N i3S2、N iCl2在2、4、24小时诱导人全血细胞DN A单链断裂的作用。
结果表明:当N i3S2染毒剂量为2.5、5.0、10.0 g/cm2、37℃作用2小时,即可引起血细胞“慧星”尾长、D NA断裂分级较对照有显著改变(P<0.01)。
血细胞分别与500～2000 mo l/L的N iCl2、40～80 mol/L的H2O2一起孵育24小时,除了DN A断裂分级有显著改变外,慧星尾长与对照差异无显著性。
提示:在实验条件下,N iCl2致DN A单链断裂作用较N i3S2弱。
血液中的某些抗氧化物质可能减弱了镍化物的DN A氧化损伤。
关键词 单细胞凝胶电泳法 镍化物 人血细胞 D NA损伤Detection of DNA damage in human blood cells exposed to nickel compounds with single cell gel elec-trophoresis M eng J ianf eng*,Zhuang Zhix iong,N i Zuy ao.*Dep ar tment of P r ev entiv e M edicine,Bei-j ing M edical U nivers ity,Beij ing100083Abstract T he DN A sing le stra nd br eaks in human bloo d cells induced by N i3S2,N iCl2and H2O2 in vitr o,w hich w ere measured by using t he alkaline comet assay(single cell g el electro pho resis),ar e re-por ted in this ar ticle.T he result sho w ed that the tail leng th and gr ade of D NA br eakage incr eased sig-nifica ntly when the w ho le human bloo d cells wer e treat ed w ith2.5,5.0,10.0 g/cm2o f Ni3S2for2h at 37℃(P<0.01).Ex cept sig nificant changes in g rade of DN A br eakage,no difference in tail lengt h co uld be fo und in24h w hen ex po sed to500～2000 mo l/L o f NiCl2and40～80 mo l/L o f H2O2.T hese sug-g est that N i3S2is mor e effective in inducing DN A single st rand br eaks than NiCl2and som e antiox idants in bloo d ma y r educe the nickel induced DN A ox idativ e dama ge.Key words Comet a ssay Nickel compounds Human blo od cells D N A damag e 镍化物已被证实为重要致癌物[1,2],但有关其致癌的分子机制还不很清楚[3],外界环境中的镍化物主要以气溶胶方式存在,经呼吸道吸收入血,血细胞往往是其首先攻击的靶子,但尚未见镍化物在人全血细胞中的DNA损伤结果报道。
我们以致癌性较强的Ni3S2作为不溶性镍化物的代表、以研究较多的NiCl2作为水溶性镍化物的代表,用单细胞凝胶电泳法[4,5]测定它们对人血细胞的DNA损伤作用。
本课题受中山医科大学环境与职业医学C M B高级奖学金资助作者单位:100083北京医科大学预防医学教研室(孟建峰);中山医科大学劳动卫生教研室(庄志雄);华西医科大学卫生毒理教研室(倪祖尧)材料与方法一、材料DY Y-Ⅲ7型转移电泳仪(北京六一仪器厂);N ikon 荧光显微镜;N iCl2(Sigma);ZnSO4(分析纯,珠州市化工原料厂);N i3S2(IN CO,Canada,纯度99.9%);H2O2 (30%过氧化氢,天津市东方化工厂),T riton X-100(北京中预卫科生物工程部);DM SO(M er ck Schuchar dt, G er many);L M P A(低熔点琼脂);N M PA(正常熔点琼脂);溴化乙锭溶液(1%)购自中山医科大学遗传学教研室。
其它实验试剂均为分析纯。
二、方法1.试验使用广州市中心血站提供枸橼酸盐抗凝的健康青年女性静脉血细胞。
测定N iCl2或H2O2毒性时, 1m l血与10～40 l不同浓度受试物混合,使终末浓度分别达到500～2000 mo l/L或40～80 mol/L,37℃水浴恒温振荡箱中孵育。
测定N i 3S 2毒性时,在直径60mm 的培养皿中加入3m l 血样和N i 3S 2混悬液(新鲜配制),轻轻摇动,使其均匀覆盖于皿底,染毒剂量分别为2.5～10.0 g /cm 2,37℃细胞培养箱中孵育。
2.单细胞凝胶电泳法操作程序:对Singh 等[4]的方法做适当调整,NM PA 和L M P A 浓度均为0.6%。
3.DN A 单链断裂的影象分析:在荧光显微镜下,损伤的细胞DN A 呈现由圆形、致密红色核心(慧头)和朝向阳极的尾端DN A 碎片(慧尾)构成的“慧星”。
本实验选用DN A 断裂分级和D NA 慧星尾长两种观察指标。
DN A 断裂分级按慧星尾部占全部DN A 量的比例判断(图1～3):0级:<5%;Ⅰ级:<20%;Ⅱ级:20%～40%;Ⅲ级:40%～95%;Ⅳ级:>95%。
每片随机计数100个“慧星”,计算各级所占比例。
DN A 慧星尾长是在高倍镜下直接测量出“慧头”中心到“慧尾”的长度(格数)。
每片随机测量25个“慧星”尾长,计算均数。
4.统计分析方法:慧星尾长的比较采用单因素方差分析(A N OV A );断裂分级的比较采用 2检验,用SPSS /PC 统计软件包处理。
图1 人有核血细胞未发生DNA 单链断裂的细胞核经电泳后在400×荧光显微镜下的DNA 图像Fig 1 DNA image of h uman nucleated blood cells under fluorescence m icroscope(×400magnificance)after com et as-say.No breaks occurred图2 人有核血细胞发生Ⅰ、Ⅱ级DNA 单链断裂的细胞核经电泳后在400×荧光显微镜下的DNA 图像Fig 2 DNA image of h uman nucleated blood cells underfluorescence m icroscope (×400magnificance )after com et as-say .Grade Ⅰ、ⅡDNA break s occur red 图3 人有核血细胞发生Ⅲ级DNA 单链断裂的细胞核经电泳后在400×荧光显微镜下的DNA 图像Fig 3 DNA image of human nucleated blood cells under fluorescence m icroscope(×400magnificance)after com et as-say.Gr ade ⅢDNA break s occu rred结 果1.Ni 3S 2对人血细胞DNA 单链断裂的影响:各Ni 3S 2剂量组在孵育2小时后慧星尾长已显著高于对照组(表1),提示已有DNA 单链断裂发生,但未呈剂量-效应关系。
孵育时间影响慧星尾长,相对于同时的对照组,DNA 断裂程度至4小时达到高峰;孵育时间延长至24小时,慧星尾长改变程度明显减弱,除5.0和10.0g /cm 2组尾长较对照明显高外,2.5 g /cm 2组未见明显差异。
各剂量组在2小时的DNA 断裂分级也均表现出损伤明显加重(表2)。
表1 N i 3S 2孵育不同时间的人血细胞DN A 慧星尾长(格数,x -±s )Table 1 T ail leng th of DN A co met in human blo od cell a fter incubat ed with v ar ious do ses of N i 3S 2at different t ime (N o .o f squares ,x -±s )Ni 3S 2剂量Dos e of Ni 3S 2( g/cm 2)DNA 慧星尾长Tail length of DNA com et 2h 4h 24h 02.19±1.09 2.34±1.06 2.93±2.022.53.56±1.54*9.68±5.06*4.13±2.125.0 4.23±2.32*9.20±3.47*5.02±2.48*10.03.84±2.06*11.42±4.37*5.86±2.96* 与对照比较,*P <0.05*P <0.05comp ared w ith control 2.NiCl 2或H 2O 2对人血细胞的DNA 单链断裂作用:N iCl 2与H 2O 2均未见明显影响慧星的尾长(表3);至孵育24小时时,NiCl 2或H 2O 2各剂量组的DNA 断裂分级与对照比,差异均有显著性,高级别断裂比例高于对照(表4)。
表2 Ni3S2孵育2小时的人血细胞DN A断裂分级(%) Table2 Gr ade o f DN A br eakage in human blo od cells aft er incubated w it h differ ent do ses o f N i3S2fo r2h(%)Ni3S2浓度Dose of Ni3S2 ( g/cm2)不同分级百分数Percentage of different grade01234 0 22 72 0 3 32.5△4864515.0△18932510.0△290035 △:与对照比较,P<0.01( 2检验)△:P<0.01compared w ith control( 2test)表3 N iCl2或H2O2孵育不同时间的人血细胞DN A慧星尾长(格数,x-±s)Table3 T ail leng th of DN A co met in human blo od cells after incubated w it h differ ent doses o f N iCl2 or H2O2for4h and24h(No.o f squar es,x-±s)组别 Group s DNA慧星尾长Tail length of DNA comet 4h24hNiCl2( mol/L)500 2.27±1.18 2.89±2.48 1000 2.24±1.74 2.76±2.21 2000 2.30±1.68 2.75±2.43H2O2( mol/L)40 1.94±1.19 3.36±2.1980 2.88±1.88 1.93±0.78对照组C on tr ol1.80±2.12 2.04±1.46表4 N iCl2或H2O2孵育24小时的人血细胞D NA断裂分级(%)Table4 G r ade o f DN A br eakage in human blo od cells after incubated with differ ent doses of N iCl2or H2O2for24h(%)组别 Grou ps 不同分级百分数Percentage of different grade01234NiCl2( mol/L)500△ 16 81 1 0 2 1000△392212 2000△2372023 H2O2( mol/L)40△19231380△391411对照组C on tr ol5742100 △:与对照组比较,P<0.01( 2检验)△:P<0.01compared w ith control( 2test)讨 论近几年来。