彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验
单细胞电泳凝胶片的保存方法
４ ） 读片 ： 低温 保存 的凝 胶 片 分 别 于第 １ ， ２ ， ３ ， ４和 片 随机 选取 ５ Ｏ个 细胞 ， 使 用 国 产 单 细 胞 凝 胶 电泳 分
析软件 Ｉ ＭＩ １ ４ １ １ ＿ ３ Ｊ ， 把尾长、 Ｏ ｌ ｉ ｖ ｅ尾 矩 、 尾 Ｄ Ｎ Ａ、 尾／
１ ． ２ 实 验 方 法
静脉 血 ５ ｍＬ ， 取 自健康 ４ ｏ岁女性 ， 肝 素抗 凝 。正
１ ） Ｈ Ｏ 处理 ： 常规 提取 淋 巴细胞 于 ３ ｍ Ｌ Ｐ Ｂ Ｓ中 后 均分 到 ３个试 管 中 ， 每管分别加入 Ｈ Ｏ 至终 浓 度
２ 结果和 讨论
光２ ０ ｍ ｉ ｎ 。在 电压 １ ． ２ ５ Ｖ ／ ｃ ｍ、 电流 ３ ０ ０ ｍＡ、 ４℃ 电泳
不 同时 间同组 平行 样本 的图像 没 有 明显 变 化 （ 图
） 。表 １为经 Ｈ Ｏ 处理 后 ３个剂 量组 的彗 星 损伤 测 为０ （ 阴性对 照） 、 ２ ５ Ｉ ． Ｌ ｍｏ ｌ ／ Ｌ和 ５ ０ Ｉ ． Ｌ ｍｏ ｌ ／ Ｌ ， ３ ７℃ 水 １ ｄ后 对 照组 的损 伤指 标 与 ２ ５ Ｉ ． Ｌ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ 、 浴， ３ ０ ｍ ｉ ｎ ， 离 心弃 上清 ， 洗 涤 ２次 ， 调 细 胞 浓度 为 １× 定 结 果 。保存 ５
维普资讯
２ ０ ０ ７正
１ ２月
首 都 医 科 大 学 学 报
Ｊ ｏ ｕ ｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｃ ａ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｌ ａ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ２ ８ Ｎｏ ． ６
第２ ８卷 第 ６期
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技 术 方 法
・
单 细胞 电泳凝 胶 片 的保 存 方法
单细胞凝胶电泳(SCGE)检测锰损伤神经元DNA
单细胞凝胶电泳(SCGE)检测锰损伤神经元DNA1陆彩玲，郭松超，鲁力，陈维平，邝晓聪广西医科大学公共卫生学院，广西南宁（530021）E-mail：lcling78@摘要：目的建立体外染锰细胞模型，探讨锰神经毒性的作用机制。
方法：以原代培养的成熟皮层神经元为靶，据本室前期试验结果确定低中高不同浓度的锰液（分别为0.2mmol/L,0.6mmol/L,1.0mmol/L），与神经细胞共孵育。
显微镜观察各组神经细胞形态学的变化，用单细胞凝胶电泳试验（SCGE）检测神经细胞的DNA损伤，以彗星细胞尾长及彗星样细胞百分率为评价损伤的指标。
结果：光镜下可见不同浓度锰孵育后神经细胞形态学发生改变，单细胞凝胶电泳试验显示神经细胞DNA出现不同程度的损伤，彗星尾长及彗星样细胞百分率较对照组明显增加（P＜0.01）。
尤以高浓度锰组损伤组严重，显著高于中低浓度组（P＜0.01）。
结论：锰不但能引起体外培养的神经细胞外在的形态学损伤，还可导致神经细胞DNA的损伤。
关键词：锰，单细胞凝胶电泳 (SCGE)，DNA损伤目前，随着生产工艺的改进和预防措施的加强，严重的职业性锰中毒已很少发生，但长期低剂量的锰暴露依然存在，并对接触者的潜在影响仍不可低估。
慢性锰中毒是进行性的、不可逆的病变，并且锰对接触者的危害正由临床型向亚临床型转变，因而更为敏感、特异的效应指标，以早期筛检出亚临床中毒者及高危人群，是今后锰神经毒性研究中重点解决的问题。
DNA损伤是遗传毒理学的一个重要研究领域，长期不可逆转的DNA损伤累积可诱导细胞突变、畸变。
单细胞凝胶电泳(Singl cells gel eletrophoresis,SCGE)又称彗星试验（comet assay），由Ostling等（1984）首创，后经Singh等（1988）进一步完善并逐渐发展起来的一种快速检测单细胞 DNA损伤的实验方法，适用于多种细胞，广泛应用于检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、监测环境污染物对机体的遗传损害、研究毒物致癌机制等方面，具有经济、简捷、灵敏等优点，日益广泛地应用在各种诱变剂的遗传毒性检测上。
单细胞凝胶电泳技术应用进展
又被称为“ 彗星电泳” ］ 细胞的生物膜在细胞裂解液的作用下被破坏， ［． ７ 使细胞内的 Ｄ Ａ 蛋白质及其 Ｎ 、 他成分进入凝胶， 继而扩散到裂解液中， 惟有核 Ｄ Ａ仍 附着在剩余的核骨架上而 留在原位 ． Ｎ 如果细胞 未受损伤， 电泳中核 Ｄ Ａ停留在核基质中， Ｎ 经荧光染色后呈现 圆形 的荧光团， 无拖尾现象 ． 若细胞受
到损伤， 在碱性电泳液（Ｈ＞１） Ｄ Ａ双链解螺旋且碱变性为单链， ｐ ３ 中， Ｎ 单链断裂的碎片离开核 Ｄ Ａ向 Ｎ 阳极迁移， 形成拖尾 ． 细胞核 Ｄ Ａ受损伤越严重， Ｎ 产生的断链或碱变性碎片就越多， 片断也越小， 电泳 表现为彗星尾越长和彗尾越亮［ ． ８ 通过荧光显微镜观察有无彗星及彗尾的长度、 】 亮度、 出尾率等， 判断
以研究活细胞 Ｄ Ａ的损伤， Ｎ 还可以研究死细胞的 Ｄ Ａ损伤， Ｎ 从而避免了只能用活细胞 （ 如染色体畸 变、 微核、 姐妹染色单体互换等） 的限制， 因而其对于建立动物模型深入探讨运动性氧应激与 Ｄ Ａ损伤 Ｎ 的分子生物学机制仍不失为一种优越的研究方法 ． 同时，Ｃ Ｅ技术也将为运动性疾病和运动性疲劳的早期诊断提供更有效 的实验方法和手段 ． ＳＧ 在 使用单细胞凝胶电泳技术在运动医学中的应用得 出结论 ：Ｃ Ｅ技术 由于需样品量少， Ｄ Ａ损伤检 ＳＧ 对 Ｎ 出的灵敏性高， 无需同位素标记， 技术简单、 费用低， 能够快速、 准确检测有害物质存在场所中各类人群 的 Ｄ Ａ损伤及筛检对 Ｄ Ａ损伤因素敏感的高危人群 ． Ｎ Ｎ
速、 低耗 等优 点 ， 因此被 广泛应 用在 Ｄ ＮＡ的损 伤与 修复 、 传 毒理 、 境监 测 以及氧 化 应 激和 细胞 凋亡 遗 环
等研 究中［１ ６．
１ 单细胞凝胶电泳技术原理
单细胞凝胶电泳试剂盒（彗星实验）说明书
单细胞凝胶电泳试剂盒（彗星实验）使用说明书一 单细胞凝胶电泳实验介绍单细胞凝胶电泳( Single Cell Gel Electrophoresis, SCGE) 又名彗星试验(comet assay)， 1984 年起用于检测的真核细胞的DNA 断裂和修复，具有方法灵敏、快速优点，同时既可以定性又可以定量，目前DNA 损伤检测的其他方法（Giemsa 染色法,TUNUL 法、DNA 电泳梯度法、流式细胞检测法）是无法比拟的。
彗星实验是检测DNA 微损伤和修复的新方法，得到国际遗传毒性检测程序工作会议认可。
彗星实验是简单、快捷检测DNA 微损伤的方法，被广泛应用于遗传毒理、放射生物学、生物监测、癌症化疗和细胞凋亡、衰老等领域。
是一个十分成熟的技术，逐渐成为快速检测DNA损伤的一种方法，尤其应用于新药开发、保健品开发、化妆品开发、环境监测和毒理学研究等领域。
彗星实验具有以下优点：1 适用范围广，不仅适用于静止状态的细胞，且对T 和B 淋巴细胞敏感；2 所需实验器材较少，一台荧光显微镜和一套电泳装置即可完成彗星实验；3 实验流程短，一天可完成一个实验流程，且图像获取和数据分析可隔日完成；4 安全性好，避免了同位素的使用；5 在单细胞水平上对DNA 损伤进行可视性检测；6 准确性好、灵敏度高；7 属于新技术，客观实际，国际遗传毒性学术委员会认可。
二、试剂盒组成（见试剂盒内）三、试剂使用说明（见试剂盒内）四、操作步骤1.各种细胞用冰冷的PBS 洗一次，离心收集，用PBS 重悬，密度为1×104-5个/ml。
2.铺胶：下述各浓度琼脂糖凝胶均用PBS 配制。
3.第1 层凝胶的制备：将加热熔解的正常熔点琼脂糖(NMA)，冷至45-60℃，取适量铺于载玻片CometSlide上，再置4℃下10min 使NMA 凝固。
也可以先铺胶，晾干后无尘存放，1周内使用（据经验，此法较优）。
4.第2 层凝胶的制备：低熔点琼脂糖LMA在60-70℃水浴加热至少20min 使之完全溶化，冷至37℃（可以放置于细胞培养箱中或水浴箱冷却至37℃，低熔点琼脂糖LMA在37℃可维持3小时）。
彗星实验
彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。
本实验对Singh 等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。
用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。
1 材料与方法1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％ CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。
1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。
1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；TritonX-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC 分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。
其余生化试剂均为分析纯。
电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.21.4 实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。
实验分为对照组和8个照射组，各照射组分别照射3、5、10、40，60、120、180、240 s，对照组不进行紫外线照射，之后进行彗星实验。
彗星试验
单细胞凝胶电泳分析法单细胞凝胶电泳分析法(彗星分析法)治愈癌症是一个难题,长期以来科学家们一直在苦苦探索.我们目前知道,致癌的过程与许多因素有关，但如果我们能阻止其中的任何一个步骤，癌细胞便无法形成。
因此,探测致癌物质的技术与癌细胞的及时发现就显得尤其重要！然而截至目前为止，科学家们仍无法研究出一种简易基因测试法或综合的方法来检测出可能的致癌物。
因此，致癌物对ＤＮＡ的作用仍是癌症研究的一个重要课题。
遗传毒物学为一专门研究化学及各类物质对人体遗传基因影响的科学。
人体每天暴露在大量的化学物质当中，为了诊测这些物质对人体ＤＮＡ的影响，科学家们发明了多种测定方法，然而，多年来人们所使用的这些测试方法却不能准确与快速的辨识出会使人体致癌的物质。
为了解决这些问题，单细胞凝胶电泳法（Single Cell Gel Assay）应运而生，通常亦称之彗星分析法（Comet Assay）。
它之所以称为彗星分析法是因为被破坏的DNA形似彗星，此方法已被证实是最具敏感性又最具快速性的方法。
研究人员使用这种方法可在２４小时内获得初步结果，在十天之内能得到结论性的证据。
此种测定方法速度远快于其它方法，不仅可以测出某种物质是否是致癌物，而且还可测出被破坏细胞的损害程度。
彗星分析法是用来判别某种物质是否是致癌物，并衡量其对人体ＤＮＡ修补的影响程度，这一分析过程是将健康的人体白血球接触于被测试的物质后，然后再用彗星分析法来进行测试，如果被测试的物质是致癌物质，那么ＤＮＡ将被破坏，而被损坏的ＤＮＡ将开始游离细胞核，形成彗星形状。
ＤＮＡ受到致癌物质的损坏愈大，ＤＮＡ碎段就愈多，愈小的ＤＮＡ碎段游离的速度就愈快，也游离愈远，因而形成了彗星的尾部，而较大的一些碎段位置则靠近细胞核，因而形成彗星的头部。
ＤＮＡ碎段的游动的程度不同 使它呈现出彗星状，使研究人员能很容易看清细胞的损害程，彗星的长度与ＤＮＡ的损害程度有关，此长度是指从细胞核到彗星尾端的距离，也就是说，彗星尾端愈长，细胞的损害程度愈大。
彗星实验
彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。
本实验对Singh 等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。
用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。
1 材料与方法1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％ CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。
1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。
1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；TritonX-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC 分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。
其余生化试剂均为分析纯。
电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.2，/index.php下载)；CO2培养箱：BB16HF型(上海力申科学仪器有限公司)；环地牌紫外辐照计(北京师范大学光电仪器厂)。
1.4 实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。
大鼠体内碱性彗星试验中阳性药环磷酰胺和甲基磺酸乙酯给药周期的筛选研究
大鼠体内碱性彗星试验中阳性药环磷酰胺和甲基磺酸乙酯给药周期的筛选研究目的：筛选大鼠体内碱性彗星试验中阳性药环磷酰胺（CP）和甲基磺酸乙酯（EMS）的给药周期。
方法：将SD大鼠随机分为空白对照组、CP组（40 mg/kg，腹腔注射）和EMS组（100 mg/kg，灌胃），每组9只，每24 h给药1次，连续给药4次。
分别于第2、3、4次给药后3 h（即首次给药后27、51、75 h）各组随机选取3只大鼠，处死并收集肝和胃样本，经过制备单细胞悬液、制片、裂解、解链、电泳及染色后，使用Comet Assay Ⅳ彗星试验数据分析系统进行分析，以彗星尾部DNA百分比（Tail DNA%）、尾长（TL）和尾矩（TM）为评价指标，筛选最佳给药周期。
结果：空白对照组大鼠3个检测时间点肝和胃的Tail DNA%、TL、TM差异均无统计学意义（P>0.05），表明彗星试验体系比较稳定。
与空白对照组比较，CP组和EMS组大鼠3个检测时间点肝和胃的Tail DNA%、TL（27 h的胃除外）、TM均明显升高（P＜0.05）。
其中，CP组大鼠3个检测时间点间肝的Tail DNA%、TL、TM差异均无统计学意义（P>0.05），胃的Tail DNA%、TL均在给药51 h时最大，TM随给药时间的延长而升高；EMS组大鼠肝的Tail DNA%、胃和肝的TM均随给药时间的延长而升高。
EMS组大鼠胃的Tail DNA%、肝和胃的TL均在给药51 h时最大。
结论：在进行体内碱性彗星试验时，建议CP和EMS的给药周期是每24 h给药1次，连续给药3次。
ABSTRACT OBJECTIVE：To screen the dosing period of positive drug cyclophosphamide （CP）and ethyl methanesulfonate （EMS）in alkaline comet assay of rats in vivo. METHODS：SD rats were randomly divided into blank control group，CP group （40 mg/kg，i.p.）and EMS group （100 mg/kg，i.g.），9 rats in each group，every 24 h，for consecutive 4 times. 3 h after secondary，third and forth medication （27，51，75 h after first medication），3 rats were randomly selected and sacrificed in each group. Liver and stomach samples were collected. After single cell suspension preparation，production，lysis，chain breaking，electrophoresis and dyeing，the evaluation indicators，including tail DNA%，tail length （TL）and tail moment （TM），Comet Assay Ⅳcomet assay data analysis system was used to screen the optimal dosing period. RESULTS：There was no statistical significance in Tail DNA%，TL and TM of liver and stomach in blank control group at 3 test time points （P>0.05），indicating that the comet assay system was stable. Tail DNA%，TL （except for stomach at 27 h）and TM of liver and stomach in CP and EMS groups were increased significantly，compared with blank control group （P＜0.05）. There was no statistical significance in Tail DNA%，TL and TM of liver in CP group at the three test time points （P>0.05），tail DNA% and TL of stomach in CP group were maximal at 51 h. TM was increased with dosing period. Tail DNA% of liver in EMS group，TM of stomach and liver were increased with dosing period. Tail DNA% of the stomach，TL of liver and stomach were the highest at 51 h in EMS group. CONCLUSIONS：During in vivo alkaline comet assay，it is recommended that CP and EMS be administered once every 24 h andthree times continuously.KEYWORDS Alkaline comet assay in vivo；Cyclophosphamide；Ethyl methanesulfonate；Dosing period；Rats彗星试验（Comet assay），又称单细胞凝胶电泳试验（Single cell gel electrophoresis assay），是一种快速、简单、可视化、灵敏的试验技术，可以直接测量和分析体内外细胞的核DNA损伤[1-2]。
彗星电泳
每片滴加60ulPI( 5ug/ml) 染色20min.用蒸馏水 洗一下即可观察。
取出玻片放于无Ca2+、Mg2+的PBS中洗1-2次，吸
水纸吸干； 每片载玻片上加60μl 2μg/ml PI染色15min， 蒸馏水冲洗盖玻片观察并拍照（Olympus荧光显 微镜绿色激发光下观察）；
用casp. exe软件分析细胞拖尾变化
思考题
彗星实验的原理？ 彗星实验的评价方法？
步骤
γ射线照射细胞后，分别于照射后0h，30’， 1h，2h，4h收集细胞并做细胞计数，以 适量PBS重悬细胞；
胶片制备
取100 ul 用微波炉熔解的 1%正常熔点琼脂糖(NMA)滴 在预热的(45℃~70℃)磨砂载玻片上，迅速盖上干净的 盖玻片，4℃ 15分钟，(第一层) 将琼脂糖凝固后，取下盖玻片。将细胞悬液（约3000 个cell/片）与180ul0.65%低熔点琼脂糖溶液在37℃混 匀后，取一半液体滴在第一层的琼脂糖上（2个/载）， 盖上盖玻片，4℃，15min.( 第二层越薄越好，使细胞 尽量在一个平面上) 取下盖玻片，在第二层上滴加60ul0.65%低熔点琼脂糖， 4℃，15min。（第三层）
彗星电泳检测辐射诱发DNA损伤
目的
掌握彗星电泳的原理 熟悉彗星电泳的操作方法 掌握彗星电泳的评价方法
原理
单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis， SCGE)是由Ryberg B和Jonhanson K J首先提出后又经 Singh N P和Olive P I进一步完善的一种在单细胞水 平上检测DNA损伤与修复的方法。因其细胞电泳形状 颇似彗星，又称彗星试验(comet assay)。它是一种 测定和研究单个细胞DNA链断裂的新电泳技术，与传 统方法相比，其简便、快速、灵敏、样品量少、无需 放射性标记，具有极高的实用价值。目前该技术已广 泛地应用于体内、体外各种有核细胞经受试物诱导的 DNA损伤和修复的研究 。
单细胞凝胶电泳
五 思考题
• 试分析三层胶浓度不同的原因 • 试分析影响单细胞凝胶电泳实验结
果的因素。
单细胞凝实验胶十电七泳技术
单细胞凝胶电泳技术
——丁书茂 ——丁书茂
ห้องสมุดไป่ตู้
• 单细胞凝胶电泳技术single cell gel electrophoresis, SCGE ;也称彗星试验(et assay) ，是Ostling O和Johanson KJ首次 提出，后经Singh等进一步完善的一种在单 个细胞水平上检测DNA损伤 交联和修复的方 法 因其简单、灵敏、低耗、快速等优点而 广泛应用于生物检测、遗传毒理、流行病学 调查等诸多方面。
• 第三层胶：移开盖片;滴加100μL质量 分数为0 5%的LMA于第二层胶上，加盖 片， 4℃凝固10min
4 裂解
• 将制好的凝胶放入冷的裂解液中;4℃ 下裂解2小时；
• 裂解液使用时新配铺完第二层胶后即可配制
90ml lysis solution 10ml DMSO 1ml TritonX100
3 制片
• 第一层胶：在完全磨毛的载玻片上 铺180μL质量分数为 1%的正常熔点 琼脂糖NMA;室温固化10min；
• 可将玻片用吹风机稍微加热，以延 缓琼脂糖凝固
• 第二层胶：取50μL 质量分数为0 8%的 低熔点琼脂糖LMA和30μL的细胞悬液; 混匀后滴加于第一层胶上，加该盖片使 其均匀铺开，4℃凝固10min；
5 解旋
• 从裂解液中将载玻片取出;在蒸馏 水中洗去过多盐，晾干
• 将新配制的电泳缓冲液倒入电泳 槽中，约覆过载玻片0 25cm，盖 上 盖 子 ， 在 高 pH 电 泳 缓 冲 液 中 放 置20 min以便DNA解螺旋。
彗星实验
Comet Assay 彗星分析系统软件功能:彗星试验-单细胞凝胶电泳Single cell gel electrophoresis是一种快捷、高灵敏度的检测DNA受损的方法.Comet Assay 专业彗星试验图像分析软件,提供专业快速的测量方法。
测量指标包括头半径，尾长度，积分光密度，头/尾DNA含量比例，尾矩，Olive 矩等多种参数。
具有自动或手动调节分割彗星头部和尾部功能同时提供对双染色系统的分析系统可广泛用于环境毒理学中对DNA具有损伤作用的分析：如紫外光、电离辐射、氧自由基等因素造成的DNA损伤。
以及细胞凋亡，抗癌药物的药物毒理学研究，遗传毒理研究和肿瘤治疗的跟踪监测等单细胞凝胶电泳(彗星试验):原理、应用和局限性彗星试验：原理、应用和局限性1. 前言过去十年中，彗星试验或单细胞凝胶电泳（SCGE）已成为一个评定DNA损伤的标准方法，广泛应用于遗传毒性试验、人类生物监测和分子流行病学、生态毒理学以及DNA损伤修复的基础研究，且因其简单、灵敏、多功能、快速、经济实用而赢得了广大科研工作者的青睐，和其有关的文献数目逐年上升。
在应用彗星试验时不会过多去考虑它如何运作和它提供何种信息，因为它在论证DNA损伤中的成功已足以证明它的价值。
这一点实在太可惜，因为它不仅能告诉我们细胞内存在的损伤的类型，而且能告诉我们损伤的程度。
尽管彗星试验是检测DN A断裂的基本方法，但由于对特异性核酸内切酶损伤的引入使其可以检测紫外线诱导的嘧啶二聚体，氧化碱基和烷基化损伤。
2.检测原理和检测指标2.1 背景二十世纪七十年代，Peter Cook和其同事们制定了一种用非离子去污剂使细胞溶解来研究核结构的方法。
这种处理除去胞膜、胞质和核质，并使核小体破裂（几乎所有的组蛋白均被浓盐提取），剩下的就是由核基质或RNA、蛋白质组成的支架以及DNA所构成的类核，其DNA的双螺旋以核小体的组蛋白为核心形成负超螺旋结构。
超螺旋的存在使DNA不能自由旋转，Cook 等提出一个模型，DNA间断的附加于基质，有效的形成一系列环状、而不是线性分子。
预防医学与公共卫生学：毒理学题库考点(题库版)
预防医学与公共卫生学：毒理学题库考点（题库版）1、名词解释最大无作用剂量正确答案：是指一种外源化学物在一定时间内，按一定方式或途径与机体接触，用现代的检测方法和用最灵敏的观察指标，未能观察到任何对机体的损害作用的最高剂（江南博哥）量。
2、单选一般对致癌物制定实际安全剂量在人群中引起的肿瘤超额发生率不超过A．10-2B．10-3C．10-4D．10-5E．10-6正确答案：E3、问答题简述毒作用的分类？正确答案：（1）速发性或迟发性作用（2）局部或全部作用（3）可逆或不可逆作用（4）超敏反应（5）特异质反应4、名词解释半数致死量或浓度正确答案：指引起一组受试实验动物半数死亡的剂量或浓度。
它是一个经过统计处理计算得到的数值。
5、问答题简述Ames试验的优点？正确答案：检出率高；灵敏度较高；经济适用；由于在测试系统加入了S9，弥补了一般试管内试验的缺点。
6、名词解释剂量-反应关系正确答案：表示化学物的剂量变化与某一群体中质反应发生率高低之间的关系。
7、填空题排泄外源化学物最主要器官是（）。
正确答案：肾脏8、名词解释曲线下面积正确答案：指外源化学物从血浆中出现开始到完全消除为止这一时间过程内时-量曲线下覆盖的总面积。
9、问答题认为引起物种、品系、个体差异以及选择毒性的比较重要的因素是遗传因素，包括什么？正确答案：解剖、生理和生化的不同；代谢酶的遗传多态性；修复能力差异；宿主的其他因素。
10、问答题终毒物主要分类有哪些？正确答案：亲电子剂；自由基；亲核物；氧化还原性反应物。
11、问答题化学物毒性作用的影响因素？正确答案：（1）化学物因素：化学结构，物化性质，不纯物和化学物的稳定性等。
（2）机体因素：物种间遗传学的差异，个体间遗传学的差异、其他因素对毒性作用易感性的影响。
（3）环境因素：气象条件、季节和昼夜规律。
（4）化学物的联合作用。
12、单选关于生物学标志的叙述，错误的是（）A、又称为生物学标记或生物标志物B、检测样品可为血、尿、大气、水、土壤等C、检测指标为化学物质及其代谢产物和它们所引起的生物学效应D、分为接触生物学标志、效应生物学标志和易感性生物学标志三类E、生物学标志研究有助于危险性评价正确答案：B13、名词解释遗传负荷正确答案：指一种物种的群体中每一个携带的可遗传给下一代的有害基因的平均水平。
检测细胞DNA断裂损伤效应的彗星实验法的改良
检测细胞DNA断裂损伤效应的彗星实验法的改良赖金龙;付倩;任莎;吴国;陶宗娅;张红;罗学刚【摘要】为了解决彗星实验过程中常出现的脱胶、细胞核分离操作繁琐、重复性低等问题,对彗星实验方法进行了改良,初步建立了彗星实验的快速操作流程.结果显示,通过对载玻片进行预处理,可确保凝胶悬挂均匀;采用改良机械法分离的细胞核浓度适中;以0.5％ (w/v)涂层琼脂糖作为基层、以1.5％ (w/v)低熔点包埋琼脂糖作为叠加层的“双层凝胶法”,辅以“推片法”铺胶,操作便捷且不发生脱胶现象;细胞核膜经裂解处理后再进行电泳和荧光观察,彗星图像清晰,杂质少.应用改良后的彗星实验方法,操作简便,耗时更短,实验效果良好,可快速检测出细胞DNA损伤效应.【期刊名称】《生态毒理学报》【年(卷),期】2015(010)004【总页数】8页(P195-202)【关键词】铯;蚕豆根尖细胞;遗传毒性;DNA损伤;彗星实验;改良【作者】赖金龙;付倩;任莎;吴国;陶宗娅;张红;罗学刚【作者单位】四川师范大学生命科学学院,成都610101;四川师范大学生命科学学院,成都610101;四川师范大学生命科学学院,成都610101;四川师范大学生命科学学院,成都610101;四川师范大学生命科学学院,成都610101;四川师范大学生命科学学院,成都610101;西南科技大学教育部生物质材料教育部工程研究中心,绵阳621010【正文语种】中文【中图分类】Q331彗星实验(comet assay)也称单细胞凝胶电泳实验(single cell gel electrophoresis,SCGE)，是一种操作简单、有效评估细胞DNA损伤的方法[1]。
其原理是器官或组织细胞受外源因素(如辐射、重金属等)影响，细胞中的DNA发生单链或双链断裂，经裂解后，DNA解旋，在电场作用下，DNA断片迁移出细胞核，形成彗星状的电泳图谱；而正常细胞的大分子量DNA在电场作用下迁移距离较短，DNA仍保留在细胞核的范围，形成圆形或轻微拖尾的图谱[2]。
厦门大学-操作讲义-实验八.彗星试验单细胞凝胶电泳(SCGE)
用浓度为2μg/ml的PI染色液4℃染色5min。染色结束，用 预冷的PBS漂洗2min，弃PBS，50%甘油保湿。3h内阅完 玻片。
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操作步骤
(10)镜检
使用荧光正置显微镜观察玻片，仪器参数设置为490nm激 发光(蓝绿色，看见红色荧光)、200倍观察、TIFF格式保存 文件。阅片时要保持玻片湿润，先低倍大体观察，再选择 有代表性区域阅片。
应用：是检测DNA微损伤的新方法， 在国际遗传毒性检测程序工作会议上已得到认可。 检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、 监测环境污染物对机体的遗传损害、 研究毒物致癌机制，等
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单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis, SCGE)
特点： ①实验流程短(一天可完成实验); 图像获取和数据分析可隔日 完成； ②在单细胞水平上对DNA损伤进行可视性检测； ③准确性好、灵敏度高。
铺好的玻片完全浸入临用配制的预冷细胞裂解液中，4℃ 水 平放置，裂解2 h。
(5) 解链
将载玻片小心浸入预冷的解链电泳液中，4℃水平放置， 解 链0.5h。
(6) 电泳
接通电源，在300mA和25V条件下电泳20min。(调节液面)
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操作步骤
(7) 中和
电泳结束，将载玻片小心转移到托盘，浸入中和液中和 20min。中和后用冰水洗2次，2min/次。
(11)单细胞凝胶电泳结果分析
每片随机观察100个细胞，计数彗星细胞百分率，用目镜 测 微尺测量彗星细胞尾矩，进行统计学分析。 统计学分析：采用SPSS软件进行单因素方差分析，各组 间 两两比较采用q检验。
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实验记录
表1 不同剂量镉处理LO2细胞中彗星细胞百分率和尾长比较
单细胞凝胶电泳(SCGE)技术
单细胞凝胶电泳（Single Cell Gel Electrophoresis，SCGE）技术单细胞凝胶电泳（SCGE），因其细胞电泳形状颇似彗星，又称彗星试验（Comet Assay）。
它用于检测单个哺乳动物细胞DNA的损伤，与传统方法相比，因其快捷，灵敏，样品消耗少，费用较低，时至今日已广泛应用于各种有核细胞经受试因子作用后诱导出现的DNA损伤和修复的实验，成为遗传毒理学、氧化损伤、DNA交联损伤、放射生物学等领域中一项重要的研究工具。
【1，2】近年来，国内关于这一方法的应用的报道日益增多【3～5】，可以预见，SCGE技术随着其方法的逐渐标准化，定将在今后得到更加广泛的应用。
因此，本文拟就有关SCGE方法的产生、操作程序、影响因素等作一综述。
1.SCGE的诞生（DNA损伤检测方法的研究）DNA损伤与修复是遗传毒理学及分子流行病学研究的一个重要目标，很久以前人们就在寻求一种合适的检测这一效应的方法。
从使用DNA材料上分可将各种方法归为两类：（1）以裸DNA为材料检测，即通过去污剂、蛋白水解等方法去除附着于DNA上的其他细胞组分，分离出DNA；（2）以拟核为材料，即DNA构型（环区）保留于核骨架上，超螺旋结构不变。
SCGE技术属于第二种方法，显然，拟核成分的检测较裸DNA要方便得多【6】。
在此基础之上，早期的同位素示踪法因需提供同位素标记的样品，并预先确定合适的标记部位。
为解决此不便，目前多采用直接检出DNA损伤后直接生成的单链断裂【7】。
最初，Lett等应用碱性蔗糖梯度离心法测定DNA单链分子量，用于研究哺乳动物细胞的DNA损伤【8】。
不久Kohn等又将其改进为更为灵敏的碱性洗脱法，成为一种较稳定的检测方法【9】。
但是这些技术的灵敏度仍不能满足现在研究的要求，干扰因素多，同时要有放射性同位素示踪。
1984年由Ostling和Johanson首先介绍的SCGE技术在这些方面得到了显著改善，特别在1988年经Singh等完善的单细胞碱性微板电泳技术后，本方法已成为检测单个细胞DNA单链断裂的首选方法【2】。
彗星实验
彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。
本实验对Singh等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。
用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC 波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价D N A损伤的分析指标。
1 材料与方法1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。
1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。
1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％ RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；Triton X-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。
其余生化试剂均为分析纯。
电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP 软件(casp-1.2.21.4 实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。
实验分为对照组和8个照射组，各照射组分别照射3、5、10、40，60、120、180、240 s，对照组不进行紫外线照射，之后进行彗星实验。
彗星电泳法
彗星电泳法引言彗星电泳法（Comet assay），又称为碱性单细胞凝胶电泳（alkaline single-cell gel electrophoresis），是一种常用于评估DNA单链断裂程度及修复能力的实验技术。
该方法采用凝胶电泳原理，可以通过观察DNA在电泳中的迁移情况，定量分析DNA的双链断裂、单链断裂及碱解位点等信息，从而评估DNA的损伤程度。
彗星电泳法的原理彗星电泳法的原理是基于以下核心步骤：首先，细胞样品被混悬于低熔点琼脂糖凝胶中，并在裂解液中经过裂解，使DNA在凝胶中解旋并生成碱性单链凝胶。
然后，电泳运行期间，电场引起DNA向阳极移动，而碱解位点产生的碱性断裂会导致DNA 片段扩散，形成类似彗星尾巴的凝胶结构。
最后，经过染色和显微镜观察，可以评估DNA的尾巴长度和形态，进而对DNA的损伤程度进行定量分析。
彗星电泳法的步骤1.细胞样品准备：从感兴趣的组织或细胞中获取细胞样品，确保准备成单细胞悬液。
2.碱性裂解：将细胞样品与裂解液混合，并孵育一段时间，使DNA完全解旋并生成碱性单链凝胶。
3.电泳运行：将样品嵌入琼脂糖凝胶中的水平电泳槽中，通过施加电压使DNA向阳极运动，进行电泳分离。
4.染色和显微镜观察：完成电泳后，对凝胶进行染色处理，然后在显微镜下观察和拍照记录。
5.图像分析和结果计算：通过图像处理软件对拍摄的彗星图像进行分析，计算出DNA尾巴长度、形态等参数，从而评估DNA的损伤程度。
彗星电泳法的应用彗星电泳法在生物医学研究领域具有广泛的应用，主要用于以下几个方面：1. 检测环境致突变物质彗星电泳法可以用于评估环境中存在的致突变物质对细胞DNA的损伤程度，如化学物质、辐射等。
通过比较不同处理组织样品的彗星图像特征，可以评估不同处理条件下DNA的损伤程度，进而评估致突变物质的毒性和致突变性。
2. 评估细胞DNA修复能力彗星电泳法可以用于评估细胞对DNA损伤的修复能力。
研究人员可以在不同时间点收集细胞样品，然后通过彗星电泳法评估不同时间点DNA损伤的程度，从而了解细胞DNA修复过程中的动态变化。
彗星电泳方法整理
Comet assay简介单细胞凝胶电泳技术（Single cell gel electrophoresis, SCGE），又称彗星试验（Comet assay），是在核酸沉淀法（Nucleoid sedimentation）和晕圈分析（Holo assay）等检测技术基础上逐步发展起来的一种在单细胞水平检测有核细胞DNA断裂的新技术。
它主要包括Olive等建立的测定DNA双链断裂的中性单细胞凝胶电泳技术和Singh等建立的测定DNA单链断裂的碱性单细胞凝胶电泳技术。
此技术已经被广泛应用于放射生物学、DNA断裂与修复、毒理学、肿瘤治疗评价、细胞凋亡等领域的研究。
是碱性单细胞凝胶电泳可以检测DNA链的断裂和碱不稳定点，请问碱不稳定点是不是DNA上的脱嘌呤/嘧啶位点呀？还有个问题就是彗星试验检测到的DNA断裂其实是DNA损伤与修复的共同作用的结果，而且DNA修复的一个重要方式就是核苷酸切除修复，因此DNA修复过程也会造成DNA链的断裂，所以彗星试验所反映的时间－效应关系，可能并非与真实的DNA损伤有偏差，因为它无法鉴别修复过程中的DNA断裂。
SCGE技术的原理：细胞核中的DNA为负超螺旋结构，而且很致密，通常DNA双链以组蛋白为核心，盘旋而形成核小体。
一般情况下，偶然的DNA单链断裂对核酸分子双股结构的连续性影响不大，而且不易释放出来，但是，如果用去污剂破坏细胞膜和核膜，用高浓度盐提取组蛋白，DNA 残留而形成类核。
如果类核中的DNA有断裂，断裂点将引起DNA致密的超螺旋结构松散，在类核外形成一个DNA晕圈。
将类核置于电场中电泳，DNA断片可从类核部位向阳极迁移，经荧光染色后，在阳极方向可见形似彗星的特征性图像，故称“彗星试验”。
彗星尾部即为迁移出类核的DNA片段。
此时彗星尾部有可能还与头部以单链或双链的形式相连。
DNA损伤越严重，导致DNA超螺旋结构越松散，产生的断裂点越多，DNA片段越小，从而在彗星尾部出现的DNA断片越多，则慧尾的长度、面积和荧光强度越大。
叠氮钠对小麦叶片DNA损伤的彗星实验
叠氮钠对小麦叶片DNA损伤的彗星实验摘要：以小麦（Triticum aestivum Linn.）为材料，以不同浓度梯度的叠氮钠溶液处理小麦叶片后，采用彗星实验研究叠氮钠对小麦的遗传损伤。
结果表明，叠氮钠能引起小麦基因的损伤，并随浓度的增加伤害程度加大，表明叠氮钠有明显的遗传损伤毒性，彗星实验可以利用植物细胞快速检测环境中对遗传物质有毒性的物质，是一种快速、简单、直接检测DNA损伤的手段。
关键词：彗星实验；叠氮钠；小麦（Triticum aestivum Linn.）；遗传损伤目前，致突变物的检测是环境监测的重要内容之一。
过去大量采用微核试验、染色体断裂和Ames实验，但是这些方法都是在大量烦琐试验的基础上建立起来的，且花费高，不利于广泛采用[1]。
彗星实验（Comet assay）又称为单细胞凝胶电泳（Single cellgel elelectrophoresis，SCGE），最早由Ostling等[2]提出。
彗星实验可以定量检测真核细胞中的多种DNA损伤，如单、双链断裂，碱性不稳定位点，不完全切除修复位点和DNA交联等[3]。
在之前的研究中，彗星实验多是利用动物细胞DNA的损伤检测环境污染物质的致突变性和基因毒性，直到1996年Koppen等[4]第一次报道了利用植物为材料进行彗星实验检测环境污染物质对基因的损伤。
此后不断有人利用植物彗星实验进行环境致突变物的检测[5]，表明植物彗星实验和动物细胞彗星实验一样可靠，提供了环境污染检测的一种手段，但是对叠氮钠遗传损伤研究以微核居多，尚未有文献应用叠氮钠进行彗星实验研究其毒性。
本研究以小麦（Triticum aestivum Linn.）为材料，应用植物彗星实验技术初步研究了叠氮钠对小麦叶片细胞DNA的损伤，以期为慧星实验进一步应用于植物基因毒性检测提供依据。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 材料小麦品种由南阳师范学院生命科学与技术学院遗传学实验室提供。
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彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验，是由Ostling等于1984年首次提出的一种通过检测DNA链损伤来判别遗传毒性的技术。
它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。
当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。
在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。
由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。
DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。
通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。
该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。
同时，这种技术只需要少量细胞。
彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验，是由Ostling等于1984年首次提出的一种通过检测DNA链损伤来判别遗传毒性的技术。
它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。
当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到细胞裂解液中，而核DNA由于分子量太大只能留在原位。
在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。
由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成“彗星”状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。
DNA受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。
通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。
该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。
同时，这种技术只需要少量细胞。
我最近做彗星实验，总是解决不了脱胶问题，要么是铺第二三层胶的时候第一层胶就松动，要么侥幸没动，在裂解、解旋、电泳、中和过程中都会出现胶脱落的现象，我愁死了，不知道是什么原因？我的步骤这样，请帮我分析分析好吗？
1.5%正常熔点琼脂糖120微升乘热滴于磨砂载玻片上，盖玻片，4度20分钟，0.8%低熔点琼脂糖和
细胞混合液80微升，0.8%低熔点琼脂糖80微升铺第二、三层胶，裂解液和电泳液中和液都按配方来
的，我怕脱胶，是把玻片放在搪瓷盘中水平裂解、中和的。
听说有人是放在染色缸里垂直的都不会脱胶，我真愁死了，请教大侠载玻片规格磨砂程度，在哪里买的，盖玻片规格呢？裂解、电泳、中和的细节问题能否给点指导呢？能够得到您的帮助将非常感谢！
彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。
本实验对Singh等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。
用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指。