彗星实验步骤Comet assay

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彗星试验步骤范文

彗星试验是一种用于检测和评估新药物或化合物的毒性和安全性的实

验方法。下面是彗星试验的步骤：

1.实验前准备：

-准备细胞培养物：选择一种常用的哺乳动物细胞系，如人肺细胞株。培养细胞，并确保细胞处于稳定的生长状态。

-准备测试物溶液：将待测试的化合物溶解在适当的溶剂中，以得到

所需的浓度。根据先前的研究或文献，确定起始浓度和待测物的浓度范围。

2.计算细胞培养物数量：

根据实验设计和所需的浓度范围，计算出需要的细胞数量。

3.处理细胞：

将细胞分为多个处理组和对照组。每个处理组使用不同浓度的待测物

处理细胞，对照组仅使用培养基或溶剂作为对照。

4.孵育细胞：

将处理后的细胞培养物放入恒温培养箱中孵育。按照特定的条件（温度、湿度、CO2浓度等）进行培养。

5.细胞收集：

在设定的时间点，收集细胞并通过离心将细胞沉淀下来。清除培养基

及其他杂质。

6.细胞裂解：

使用一种适当的裂解液（如悬浮剂），将细胞裂解并释放核酸。

7.准备凝胶：

准备琼脂糖凝胶，通常是用琼脂糖粉末和缓冲液混合制备。

8.凝胶电泳：

将裂解液样品和标准DNA样品分别加载到琼脂糖凝胶孔中。使用电场使DNA片段从样品中迁移出来。

9.DNA染色：

使用DNA染料（如Ethidium bromide）染色凝胶，以可视化DNA片段。

10.凝胶成像和分析：

使用紫外线照明或分子影像系统观察凝胶上DNA片段的大小和形状。使用适当的软件测量和分析DNA损伤程度。

11.数据分析：

将实验结果转化为数值形式，使用统计学方法进行数据分析，如计算DNA损伤指数或计算细胞生存率。比较不同浓度的样品与对照组的差异。

彗星试验步骤

1.5.4 彗星试验（单细胞凝胶电泳试验）：参照文献[i]，略加改动，进行碱性单细胞凝胶电泳，具体如下。

1.5.4.1 制片

将0.6%的NMPA（用PBS配制）于微波炉中加热融化后，浸泡磨砂玻片，用吸水纸将玻片滑面及四周吸干，自然晾干备用。

1.5.4.2 铺胶

取1.5.3中所备细胞悬液10μl，向其中加入70μl 37℃0.7%LMPA（用PBS配制），混匀后迅速滴于37℃预热的玻片上，立即盖上盖玻片，4℃固化10min。

1.5.4.3 裂解

轻轻取下盖玻片，将玻片浸于新鲜配制并预冷的细胞裂解液中，4℃避光裂解1h。

1.5.4.4 解旋

从裂解液中取出载玻片，用PBS浸泡玻片3×3min。用纸巾吸去玻片上残留的液体，置于水平电泳槽中，加新鲜配制的碱性电泳缓冲液至高于玻片表面3mm 以上，避光解旋30min。

1.5.4.5 电泳

电压25V，调整液面高度使电流达到300mA，电泳25min。

1.5.4.6 漂洗及染色

电泳完毕，取出玻片，用PBS浸泡2×15min，以中和强碱。用纸巾吸去玻片上残留的液体，然后滴加20μg/ml的EB20μl，盖上盖玻片，立即置荧光显微镜下观察。

以上步骤尽量在黄光下或暗处进行，避免其他原因所致的DNA损伤。每一剂量水平制片2张。

1.5.4.7 结果观察

荧光显微镜下200倍观察，激发波长515~560nm，发射波长590nm。每一剂量水平随机观察100个细胞，记录拖尾细胞数。计算拖尾细胞率（以下简称拖尾率），拖尾率＝(拖尾细胞数/100)×100%。每一剂量水平用目镜测微尺测量30个拖尾细胞的全长和头长，拖尾细胞尾长（以下简称尾长，tail length，TL）＝全

单细胞凝胶电泳试剂盒（彗星实验）说明书

单细胞凝胶电泳试剂盒（彗星实验）使用说明书

一单细胞凝胶电泳实验介绍

单细胞凝胶电泳( Single Cell Gel Electrophoresis, SCGE) 又名彗星试验(comet assay)， 1984 年起用于检测的真核细胞的DNA 断裂和修复，具有方法灵敏、快速优点，同时既可以定性又可以定量，目前DNA 损伤检测的其他方法（Giemsa 染色法,TUNUL 法、DNA 电泳梯度法、流式细胞检测法）是无法比拟的。彗星实验是检测DNA 微损伤和修复的新方法，得到国际遗传毒性检测程序工作会议认可。彗星实验是简单、快捷检测DNA 微损伤的方法，被广泛应用于遗传毒理、放射生物学、生物监测、癌症化疗和细胞凋亡、衰老等领域。是一个十分成熟的技术，逐渐成为快速检测DNA损伤的一种方法，尤其应用于新药开发、保健品开发、化妆品开发、环境监测和毒理学研究等领域。

彗星实验具有以下优点：

1 适用范围广，不仅适用于静止状态的细胞，且对T 和B 淋巴细胞敏感；

2 所需实验器材较少，一台荧光显微镜和一套电泳装置即可完成彗星实验；

3 实验流程短，一天可完成一个实验流程，且图像获取和数据分析可隔日完成；

4 安全性好，避免了同位素的使用；

5 在单细胞水平上对DNA 损伤进行可视性检测；

6 准确性好、灵敏度高；

7 属于新技术，客观实际，国际遗传毒性学术委员会认可。

二、试剂盒组成（见试剂盒内）

三、试剂使用说明（见试剂盒内）

四、操作步骤

1.各种细胞用冰冷的PBS 洗一次，离心收集，用PBS 重悬，密度为1×104-5个/ml。

体内彗星试验

附件15

体内彗星试验

In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay

1 范围

本规范确定了体内彗星试验的基本原则、要求和方法。

本规范适用于化妆品原料的遗传毒性检测。

2 试验目的

评价化妆品用原料的遗传毒性。

3 定义

3.1 碱性单细胞凝胶电泳：在单个细胞或细胞核水平检测DNA损伤的一种敏感技术。

3.2 彗星：经过电泳后细胞核的形状，形似彗星。细胞核部分形成彗星头部，在电场力的作用下脱离细胞核的DNA片断形成彗尾。

3.3 “刺猬状”细胞：显微图像下由小或模糊不清的头以及大的弥漫性尾组成的细胞。

3.4 尾部DNA含量：反应总强度（彗头与彗尾之和）中彗星的强度。可反应DNA片断的数量，用百分比表示。

3.5 最大耐受剂量：试验期内引起动物产生轻微毒性效应的最高剂量，在这个剂量下，动物产生明显的临床体征，如异常行为或反应，轻微的体重下降或靶组织细胞毒性，但是并不会引起死亡或痛苦。

4 试验原理

DNA双螺旋结构在强碱性溶液中（pH>13）会松弛，在电场力的作用下，正常的DNA 保留在原位不动，而单链或双链DNA断裂所形成的DNA片断在会向阳极移动，形成彗星状。DNA片断所形成的彗星状拖尾的长度及强度可以反应DNA片断的大小和数量。通过检测尾部DNA含量（%）等终点指标可以评价DNA损伤程度。

5 试验基本原则

动物染毒一定时间后处死并解剖动物，获取靶器官，制备单细胞悬液。单细胞悬液与琼脂糖混合后经过裂解过程去除细胞膜，并暴露于强碱性溶液（pH>13）中进行DNA解旋，经过电泳、固定、染色，在荧光显微镜下观察，通过分析软件对彗星状细胞进行分析，判定DNA损伤程度。每个样品需分析足够数量的细胞进行最终结果评价。

彗星试验

单细胞凝胶电泳分析法

单细胞凝胶电泳分析法(彗星分析法)

治愈癌症是一个难题,长期以来科学家们一直在苦苦探索.我们目前知道,致癌的过程与许多因素有关，但如果我们能阻止其中的任何一个步骤，癌细胞便无法形成。因此,探测致癌物质的技术与癌细胞的及时发现就显得尤其重要！然而截至目前为止，科学家们仍无法研究出一种简易基因测试法或综合的方法来检测出可能的致癌物。因此，致癌物对ＤＮＡ的作用仍是癌症研究的一个重要课题。

遗传毒物学为一专门研究化学及各类物质对人体遗传基因影响的科学。人体每天暴露在大量的化学物质当中，为了诊测这些物质对人体ＤＮＡ的影响，科学家们发明了多种测定方法，然而，多年来人们所使用的这些测试方法却不能准确与快速的辨识出会使人体致癌的物质。

为了解决这些问题，单细胞凝胶电泳法（Single Cell Gel Assay）应运而生，通常亦称之彗星分析法（Comet Assay）。它之所以称为彗星分析法是因为被破坏的DNA形似彗星，此方法已被证实是最具敏感性又最具快速性的方法。研究人员使用这种方法可在２４小时内获得初步结果，在十天之内能得到结论性的证据。此种测定方法速度远快于其它方法，不仅可以测出某种物质是否是致癌物，而且还可测出被破坏细胞的损害程度。

彗星分析法是用来判别某种物质是否是致癌物，并衡量其对人体ＤＮＡ修补的影响程度，这一分析过程是将健康的人体白血球接触于被测试的物质后，然后再用彗星分析法来进行测试，如果被测试的物质是致癌物质，那么ＤＮＡ将被破坏，而被损坏的ＤＮＡ将开始游离细胞核，形成彗星形状。ＤＮＡ受到致癌物质的损坏愈大，ＤＮＡ碎段就愈多，愈小的ＤＮＡ碎段游离的速度就愈快，也游离愈远，因而形成了彗星的尾部，而较大的一些碎段位置则靠近细胞核，因而形成彗星的头部。ＤＮＡ碎段的游动的程度不同使它呈现出彗星状，使研究人员能很容易看清细胞的损害程，彗星的长度与ＤＮＡ的损害程度有关，此长度是指从细胞核到彗星尾端的距离，也就是说，彗星尾端愈长，细胞的损害程度愈大。这种方法不但可以测出最小的ＤＮＡ碎段，还可以测出被破坏ＤＮＡ碎段的数目，迄今为止，这是最佳分析ＤＮＡ受损害的程度与方法。

彗星电泳方法整理

Comet assay简介

单细胞凝胶电泳技术（Single cell gel electrophoresis, SCGE），又称彗星试验（Comet assay），是在核酸沉淀法（Nucleoid sedimentation）和晕圈分析（Holo assay）等检测技术基础上逐步发展起来的一种在单细胞水平检测有核细胞DNA断裂的新技术。它主要包括Olive等建立的测定DNA双链断裂的中性单细胞凝胶电泳技术和Singh等建立的测定DNA单链断裂的碱性单细胞凝胶电泳技术。此技术已经被广泛应用于放射生物学、DNA断裂与修复、毒理学、肿瘤治疗评价、细胞凋亡等领域的研究。

是碱性单细胞凝胶电泳可以检测DNA链的断裂和碱不稳定点，请问碱不稳定点是不是DNA上的脱嘌呤/嘧啶位点呀？还有个问题就是彗星试验检测到的DNA断裂其实是DNA损伤与修复的共同作用的结果，而且DNA修复的一个重要方式就是核苷酸切除修复，因此DNA修复过程也会造成DNA链的断裂，所以彗星试验所反映的时间－效应关系，可能并非与真实的DNA损伤有偏差，因为它无法鉴别修复过程中的DNA断裂。

SCGE技术的原理：

细胞核中的DNA为负超螺旋结构，而且很致密，通常DNA双链以组蛋白为核心，盘旋而形成核小体。一般情况下，偶然的DNA单链断裂对核酸分子双股结构的连续性影响不大，而且不易释放出来，但是，如果用去污剂破坏细胞膜和核膜，用高浓度盐提取组蛋白，DNA 残留而形成类核。如果类核中的DNA有断裂，断裂点将引起DNA致密的超螺旋结构松散，在类核外形成一个DNA晕圈。将类核置于电场中电泳，DNA断片可从类核部位向阳极迁移，经荧光染色后，在阳极方向可见形似彗星的特征性图像，故称“彗星试验”。彗星尾部即为迁移出类核的DNA片段。此时彗星尾部有可能还与头部以单链或双链的形式相连。DNA损伤越严重，导致DNA超螺旋结构越松散，产生的断裂点越多，DNA片段越小，从而在彗星尾部出现的DNA断片越多，则慧尾的长度、面积和荧光强度越大。通过测量彗星尾部的长度、面积或荧光强度等指标，可以对DNA的损伤程度进行定量分析。

彗星实验

收集目标细胞：处死小鼠后，迅速分离肝脏，选取最左叶肝脏，在4℃放置2h的PBS溶液中多次清洗，直至看不到血液。将肝组织至于含有2 mL4℃PBS 溶液的小烧杯中，用小剪刀剪碎（2-3 mm）。台盼蓝排斥法检测细胞活力，细胞存活率大于95%方可用于实验，调整细胞密度为5×105-106个/ml。此步在暗室中进行。

制片：取100 μL置于45℃预热的0.75% NMA滴加于载玻片一侧，迅速盖上盖玻片（24 mm×50 mm），注意不要产生气泡，至4 ℃凝固约20分钟后轻轻移去盖玻片。吸取10 μL待检测的细胞悬液与100 μL 37℃预热的0.75% LMA混匀，迅速将细胞混悬液滴加到第一层凝固的NMA上，再迅速盖上盖玻片使其均匀铺开，同样需避免起泡。将玻片至4℃凝固约30 min，操作注意避光，每只动物制作三张平行片。

裂解：轻轻移去盖玻片，将载玻片水平轻缓浸入4℃预冷的裂解液（pH= 10），于4℃避光放置1 h。

解旋：轻轻拿出载玻片，浸入PBS缓冲液5 min，用滤纸吸去多余水分后放入电泳槽。玻片并列放置，不留空隙。将新鲜配置的冰冷电泳缓冲应用液轻轻倒入电泳槽，使液面完全覆盖载玻片，放置20 min解旋。避光进行。

电泳：根据预实验，设置电泳仪25V、300 mA电泳20 min。避光进行。

中和：切断电源，小心取出玻片，置染缸，中和缓冲液浸洗，3次×5 min/次。

脱水保存：从电泳仪中轻轻取出载玻片，浸入PBS缓冲液2次×5 min/次。吸干周围水分后放入乙醇脱水，约1 h后取出自然晾干保存。

CometAssay

Comet Assay

彗星分析系统

彗星试验—单细胞凝胶电泳Single cell gel electrophoresis是一种快捷、高灵敏度的检测DNA 受损的方法。

Comet Assay 专业彗星试验图像分析软件,提供专业快速的测量方法。

测量指标包括头半径,尾长度,积分光密度，头/尾DNA含量比例，尾矩，Olive 矩等多种参数。

具有自动或手动调节分割彗星头部和尾部功能

同时提供对双染色系统的分析

系统可广泛用于环境毒理学中对DNA具有损伤作用的分析：如紫外光、电离辐射、氧自由基等因素造成的DNA损伤。以及细胞凋亡，抗癌药物的药物毒理学研究，遗传毒理研究和肿瘤治疗的跟踪监测等

单细胞凝胶电泳（彗星试验):原理、应用和局限性

彗星试验:原理、应用和局限性

1。前言

过去十年中,彗星试验或单细胞凝胶电泳（SCGE）已成为一个评定DNA损伤的标准方法，广泛应用于遗传毒性试验、人类生物监测和分子流行病学、生态毒理学以及DNA损伤修复的基础研究，且因其简单、灵敏、多功能、快速、经济实用而赢得了广大科研工作者的青睐，和其有关的文献数目逐年上升.在应用彗星试验时不会过多去考虑它如何运作和它提供何种信息，因为它在论证DNA损伤中的成功已足以证明它的价值.这一点实在太可惜，因为它不仅能告诉我们细胞内存在的损伤的类型，而且能告诉我们损伤的程度。尽管彗星试验是检测DNA 断裂的基本方法,但由于对特异性核酸内切酶损伤的引入使其可以检测紫外线诱导的嘧啶二聚体，氧化碱基和烷基化损伤。

2。检测原理和检测指标

2.1 背景

二十世纪七十年代,Peter Cook和其同事们制定了一种用非离子去污剂使细胞

彗星实验

彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。本实验对Singh 等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。

1 材料与方法

1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％ CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。

1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。

1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；Triton

X-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC 分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。其余生化试剂均为分析纯。电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.2，

彗星电泳法检测细胞凋亡原理

细胞凋亡是细胞生命周期中的一种自然过程，也是一种重要的细胞死亡方式。在细胞凋亡过程中，细胞内会发生一系列的形态和生化变化，如细胞核染色质凝聚、细胞核碎裂、胞质内溶酶体释放等，这些变化是细胞凋亡的特征。

彗星电泳法（Comet Assay）是一种常用的细胞凋亡检测方法，它可以通过检测DNA断裂来判断细胞是否发生凋亡。这种方法以细胞的DNA为基础，通过电泳的方式使DNA在凝胶上产生“彗星尾巴”状的形态，从而判断细胞凋亡的发生程度。

彗星电泳法的原理是利用DNA在电场作用下的迁移能力差异来检测细胞凋亡。首先，将待检测的细胞经过相应处理，如破碎细胞膜、去除核膜等，使细胞内的DNA暴露在外。然后，将处理后的细胞混合在低熔点琼脂糖中，制备成凝胶。接下来，将凝胶浸泡在含有碱性溶液的电泳缓冲液中，形成电泳系统。在电场的作用下，DNA 会向阳极移动，形成“彗星尾巴”状。最后，通过染色和显微镜观察，可以看到DNA的形态变化，进而判断细胞凋亡的程度。

彗星电泳法的检测结果可以通过计算尾长、尾百分比、尾状因子等参数来评估细胞凋亡的程度。尾长是指从头部到尾部的距离，尾百分比是指尾部长度占总长度的百分比，尾状因子是尾长与头部直径的比值。通过对这些参数的测量和分析，可以得出细胞凋亡的程度

和类型。

彗星电泳法具有灵敏性高、操作简便、结果直观等优点，因此被广泛应用于细胞凋亡的研究和药物筛选等领域。它可以帮助科研人员更好地理解细胞凋亡的机制，以及评估药物对细胞凋亡的影响。此外，彗星电泳法还可以用于毒理学研究、环境污染监测等方面。

彗星实验(英语版)

彗星”分析法在放射生物学中的应用

来源：广东医学杂志点击数：196 更新时间：2007-4-25 文章录入：Admin

“彗星”分析法在放射生物学中的应用

贺玉香综述夏云飞审校

中山大学肿瘤防治中心放疗科(广州510060)

“彗星”分析法（comet assay）又叫单细胞凝胶电泳（single cell gel eletrophoresis, SCGE）或微凝胶电泳，是一种比较理想的单细胞水平检测哺乳类有核细胞DNA损伤的新技术。由Ostling等［1］1984年首次提出，后经Singh等［2］逐渐改进。现主要分为中性SCGE和碱性SCGE。其原理如下：去污剂或高盐裂解溶液破坏细胞膜，使得95%以上的蛋白质及细胞内其他成分渗出膜进入溶解液，DNA由于相对分子质量大而留在原位。电泳时小的DNA断片在电场作用下移出细胞核。经溴乙啶染色后在紫外线(uv)照射下发出荧光，每个受损的细胞均呈现“彗星”外观，明亮的头部为细胞核，一系列的DNA断片组成“彗尾”。未受损的细胞只有“彗核”而无“彗尾”。DNA断片迁移的距离与DNA断片分子质量和电荷数相关，DNA断片越多、越小，“彗尾”越长，又因荧光染料与DNA的结合是特异性的，因此，通过测定“彗星”尾部长度和荧光强度可推测DNA链断裂情况。如为中性裂解液加上50 ℃的处理只能破坏DNA超螺旋结构，而DNA双螺旋结构保存完好，只有小的双链片段在电场作用下移出细胞核，形成“彗星”尾部，故主要用于DNA双链断裂的检测。

而碱性SCGE中用碱性裂解液（pH>123）处理细胞，不但使细胞内蛋白成分更彻底地分离，也有利于DNA双螺旋破坏和单链片段移行，故用于检测DNA单链断裂。

彗星实验

彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。本实验对Singh等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC 波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价

D N A损伤的分析指标。

1 材料与方法

1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。

1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。

1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％ RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；Triton X-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。其余生化试剂均为分析纯。电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP 软件(casp-1.

在日本用的COMET试验方法

Comet test 试验方法

医科院方法

操作步骤

1 玻片制备低熔点琼脂（0.625%），正常熔点琼脂（1%）

1）制板：低熔点，5μl左右刮片，晾干备用。

2）第一层琼脂，正常熔点，120ul。

3）第二层和第三层，低熔点琼脂80微升加10微升细胞悬液。

4）细胞裂解液消化1小时

5）纯水洗2次

6）电泳液中解旋15分钟。

7）电泳20-30分钟，条件20V，电流300mA

8）中和液中和10分钟。

9）分析在荧光显微镜下选择515~560nm波长的激发光，通过590nm的滤光片，显微镜下可以观察到彗星状细胞荧光像，用系统软件控制CCD的摄像头，随机摄取几个视眼下的彗星图象，输入计算机，用IMI 对细胞逐个分析。如测量彗星尾长（彗星头部中心到尾部最远端的距离），每个剂量组测100个细胞，并用相应的软件分析。相应的软件分析DNA损伤按彗星尾部DNA量占全部DNA量的比例分为5级：

0级：＜5% 无损伤

1级 5~20% 轻度损伤

2级20~40% 中度损伤

3级40~95% 高度损伤

4级＞95% 重度损伤

经验25CM的细胞瓶长满后完全消化，一瓶细胞加0.8ML的PBS刚好浓度。

some questions:

1.How to evaluate the Number of Damages, e.g. number of strand breaks?

2. You said：DNA断裂频率与尾部DNA百分含量线性相关——直到一定水平

But you use non-linear classification criteria:

电泳

单细胞凝胶电泳技术，又称彗星试验（comet assay)是19世纪60年代在核沉淀和光环测试等检测技术基础上演化而来的一种检测真核细胞DNA损伤与修复的方法

1988年Singh首次提出碱性电泳技术，用来检测单链DNA断片

在1995年单细胞凝胶电泳技术我国逐渐开展

SCGE的原理•细胞核中的DNA为超螺旋结构并且致密，在强碱的条件下，DNA双股结构打开，单链上的断片可以释放出来

•包埋在凝胶中的细胞形成一个小室，细胞膜破裂后细胞的其他成分可以扩散到裂解液中，而DNA只能留于小室内

•在电场力的作用下带负电荷的影像

•DNA向阳极泳动，荧光染色后可观察到彗星样SCGE的操作流程实验设计、染毒→制备细胞悬液→制片→铺胶→裂解→解螺旋→电泳→中和、染色→观察结果和记录

SCGE的实验方法与技术溶液的配置

碱性裂解液：2.5M NaCl、100mMEDTA-Na2、100mMTris、1%Triton X-100、10%DMSO(后两者临用前加）

碱性电泳液：300mM NaOH,1mMEDTA-Na2

中和液：0.4M Tris-HCL

溴乙锭应用液：20ưg/ml实验步骤染毒、试验分组及对照

▪体外试验：

受试物+细胞（培养基或琼脂糖细胞悬液）

染毒时间H2O215分钟，其他一般1小时

▪体内试验：

受试物+动物（适当途径）

染毒时间1-72小时染毒、试验分组及对照

▪体外试验：

受试物+细胞（培养基或琼脂糖细胞悬液）

染毒时间H2O215分钟，其他一般1小时

▪体内试验：

受试物+动物（适当途径）

染毒时间1-72小时体外试验：

彗星试验方法

主要仪器

数显电热恒温水浴箱、电泳仪、电子分析天平、荧光显微镜及数码成像系统、匀浆器、磁力搅拌器。

主要试剂

氯化镉（CdCl2·2.5H2O），分析纯，上海亭新化工试剂厂，批号20080901。使用时用去离子水配制成不同浓度。

正常熔点琼脂糖（NMA），低熔点琼脂糖（LMA），N-十二烷基肌氨酸钠，Triton-X-100，溴化乙锭（EB）。

氯化钠，氯化钾，磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O），磷酸二氢钾（KH2PO4），乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA），三（羟甲基）胺基甲烷（Tris），氢氧化钠（NaOH），二甲基亚砜（DMSO），盐酸（HCl）等，均为国产分析纯试剂。

主要溶液的配制

磷酸缓冲液（PBS）NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4.12H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，无Ca2+、Mg2+双蒸水1000ml，调pH至7.4，冰箱4℃保存备用。

0.5%正常熔点琼脂糖（NMA）0.5g NMA与100ml磷酸缓冲液混合，加热溶解，冷却后冰箱4℃保存备用。

0.5%低熔点琼脂糖（LMA）0.5g LMA与100ml磷酸缓冲液混合，加热溶解，冷却后冰箱4 ℃保存备用。

细胞裂解液精确称取NaCl 146.1g，Na2EDTA 37.2 g ，N-十二烷基肌氨酸钠10 g，Tris 1.22 g，放入1000 ml烧杯中，加800ml双蒸水，磁力搅拌溶解（可加热），以4 mol/L NaOH调pH到10.0，在容量瓶中加水定容到1000 ml。冰箱4℃保存备用。临用前根据用量按总体积加1% Triton-X-100，10% DMSO混匀。

厦门大学-操作讲义-实验八.彗星试验单细胞凝胶电泳(SCGE)

(11)单细胞凝胶电泳结果分析
每片随机观察100个细胞，计数彗星细胞百分率，用目镜测微尺测量彗星细胞尾矩，进行统计学分析。统计学分析：采用SPSS软件进行单因素方差分析，各组间两两比较采用q检验。
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实验记录
表1 不同剂量镉处理LO2细胞中彗星细胞百分率和尾长比较
组别
细胞数彗星细胞尾长范围(μm)
配制0.65%正常熔点琼脂糖，微波炉中加热1min，摇匀，重复2~3次使其完全融解
75℃水浴锅保温
将干燥的载玻片缓慢浸入正常熔点凝胶中反复5~6次使得凝胶均匀分布在载玻片上，擦去载玻片背面残留的琼脂糖， 37℃温箱干燥(一次性铺好一天要用的底层琼脂糖凝胶 )
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操作步骤
(3)铺低熔点琼脂糖凝胶
铺好的玻片完全浸入临用配制的预冷细胞裂解液中，4℃ 水平放置，裂解2 h。
(5) 解链
将载玻片小心浸入预冷的解链电泳液中，4℃水平放置，解链0.5h。
(6) 电泳
接通电源，在300mA和25V条件下电泳20min。(调节液面)
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操作步骤
(7) 中和
电泳结束，将载玻片小心转移到托盘，浸入中和液中和 20min。中和后用冰水洗2次，2min/次。
尾长在高剂量时达到饱和不再增加，而尾矩则与剂量呈线性相关。因此，在尾长、密度、面积、尾矩等各项分