彗星实验要点

1、凋亡细胞的观察：看过国外此法作出的凋亡细胞彗星图像，很漂亮，用CASP软件分析后，其曲线呈典型的双峰，而正常细胞为单峰。我的一些教训：观察凋亡细胞最好把电压、电流、和电泳时间均调低，否则，凋亡细胞中的DNA片断跑的太块，荧光下根本看不到凋亡细胞的尾巴。注：我用的是中性条件，20V，200mA,20min, 凋亡细胞观察宜选用10V,100mA,10min。朋友们如果有异议，请不吝赐教，也对我有所帮助。

2、

解旋20分钟应该没问题，但是我认为您的电泳时间过长，当然我不知道您的电泳条件（电压、电流、），我认为20分钟足够了，时间长了一是浪费时间，二是彗星图像不好，不利于分析。您的裂解时间有点短了，文献报道，最好不要少于1.5小时

3、一般100ul0.5％低熔点胶中含400个细胞就足够了

4、本版【图片仓库】子版有我做的彗星图像，感兴趣可以看看

/bbs/post/view?bid=66&id=2729243&sty=1&tpg=1&ag e=0

5、注意，CASP只读.tif扩展名的图像，如果你的相机拍摄的图像可以有.tif 格式，就更好了，如果是.jpg格式，那还要在计算机中转换一下，不过很简单

6、首先，荧光染色的东西最好马上看，否则影响结果。

其次，您的染色液量我觉得多了点，我用2ug/ml，1ml注射器1滴就可以。第三，要忠于实验结果，图象内容不能更改，可以用ACDSEE或PHOTOSHOP 转换图象格式或大小，所以，作出来的实验图象质量要好

7、。背景的选择问题，如果图片质量好的话，背景大小不同，对结果影响不是很大，如果图片背景乱七八糟，那背景框的选择肯定对结果产生很大影响。我的建议：背景框不要太大，参考我贴的那个图。注意，背景框可以在细胞的上面或下面，如果背景框在上面时，分析后的图像（分析后出现一个头、尾分明的图像，是基本重合在细胞上的）质量很差，很不规则，那再把背景框调到下面试试，如果还是不好，那只能说你的结果质量不好了。背景框的选择关键在于分析同一批细胞，背景框要相同，才能保持资料的可比性。

结果的保存，记得好像使用说明里提到了，如果没有提到，那就是我原创的！！！呵呵，先卖个关子。FILE菜单下有一个EXPORT RESULTS（输出结果）的按钮，点击以后，默认是.TXT文本文件，好了，给你的输出文件起个名字，选择保存位置，点击确定就OK了，回到你保存的输出结果文件，发现它是一个不可识别的文件，那就直接把它的扩展名改成.TXT，打开它，看看你的结果，包括13个指标，很好，这个.TXT的结果文件可以被SPSS统计软件直接识别，不是很方便吗？？（如果你愿意把数据一个一个地输入统计软件，我也没意见，呵呵）。这里还有一个小窍门，在用SPSS读取之前，最好把你的结果文件调整一下，这也是我发现的。把所有的指标都排列到第一行，下面的结果要和指标一一对应，每个数据之间留空格（默认的），行与行之间不要用回车，就是不要有空行，其实调整起来很简单，主要是调节.TXT文本文件阅读框的宽度。调好后，SPSS软件直接识别，很方便，为你节省很大工作量，不信就试试。

8、我用双层铺胶法，自制微电泳槽，第一层:0.75％正常熔点胶，100μl，

第二层：0.75％低熔点胶，75μl+25μl淋巴细胞悬液，用枪直接把凝胶吹到自制的微电泳槽中，铺平即可。第二层以相同的方法铺到第一层上面，不必担心脱胶的问题。

9、盖玻片用普通的就可以了，但是可以自做的，普通的盖玻片其实有点小了，如果胶很多的话，第二层胶非常厚，这样不利于观察细胞，而且不利于电泳。3。染色后要用双蒸水冲洗，据我的经验，冲要冲的非常干净，否则背景太亮了，拍照后不容易分析。但是又不能使劲的冲，否则胶很容易掉下来。

4。电泳的时间一般是20分钟，电压各个细胞是不同的，你可以查查有关资料，自己做做预试验。一般情况下，对照组的细胞的tail DNA%应为10%左右，不超过20%，如果尾巴太短了，也不好。

5。分析要用荧光显微镜的，具体的染液，有不同的激发波长。casp软件在前面的帖子中就有。很好用的，在推荐一次哦。最好用显微镜自带的相机，如果你的技术好的话，可以在目镜照相，洗出来扫描后可以分析的。

6.把EB滴加在胶上就可以了。观察时要在暗室里。

我是用EB的，电泳后，直接在胶板上滴上一滴，然后用水冲洗，用滤纸吸去多余水分，荧光显微镜观察

10、SCGE技术的原理：

细胞核中的DNA为负超螺旋结构，而且很致密，通常DNA双链以组蛋白为核心，盘旋而形成核小体。一般情况下，偶然的DNA单链断裂对核酸分子双股结构的连续性影响不大，而且不易释放出来，但是，如果用去污剂破坏细胞膜和核膜，用高浓度盐提取组蛋白，DNA残留而形成类核。如果类核中的DNA有断裂，断裂点将引起DNA致密的超螺旋结构松散，在类核外形成一个DNA晕圈。将类核置于电场中电泳，DNA断片可从类核部位向阳极迁移，经荧光染色后，在阳极方向可见形似彗星的特征性图像，故称“彗星试验”。彗星尾部即为迁移出类核的DNA片段。此时彗星尾部有可能还与头部以单链或双链的形式相连。DNA损伤越严重，导致DNA超螺旋结构越松散，产生的断裂点越多，DNA片段越小，从而在彗星尾部出现的DNA断片越多，则慧尾的长度、面积和荧光强度越大。通过测量彗星尾部的长度、面积或荧光强度等指标，可以对DNA的损伤程度进行定量分析。

随着SCGE技术的发展，可测量的指标也越来越多，而且更准确。目前，用于S CGE分析的指标主要分为四类，包括形状指标、距离指标、强度指标和矩类指标。其中形状指标有彗星细胞率；距离指标包括彗星尾长、彗星全长、彗星头部半径、尾部半径；强度指标包括头部DNA百分含量、尾部DNA百分含量、头部面积、尾部面积等；矩类指标包括尾矩、Olive尾矩等。

11、H2O2是作为阳性对照的吧？它是标准的断裂剂。但是不同的细胞对它的敏感程度是不同的，我觉得前几个数据有必要删掉，30微摩尔以下的浓度应该是会造成断裂的。．PI染色我见过，染出来的效果也是很不错，是蓝色的。不一定用EB染色呀，毒性又大。

12、单细胞琼脂糖凝胶电泳（comet assay）

Single Cell Agarose Gel Electrophoresis (SCGE)