彗星实验要点
彗星实验步骤Comet assay
水稻植株彗星实验步骤
通过将Singh和Gichner等人建立的碱性彗星实验方案应用于水稻（Oryza sativa L.）来确定原发性DNA损伤。
所有的实验步骤都是在冰床上避光进行的。
1、对于每一盆水稻，取鲜叶0.1 g，用刀片切碎，加入2个100 μL装有三羟甲基氨基甲烷盐酸提取缓冲液（Tris-HCl提取液，0.1 M，pH=7.5，4℃保存）的离心管中；
2、每个离心管中取75 μL含细胞核样本添加到150 μL低熔点琼脂糖凝胶（LMPA，1%）中，混合；
3、取75 μL上述混合物，沉积在用正常熔点琼脂糖凝胶（NMPA，1%）制备的载玻片上，然后盖上盖玻片；
4、重复步骤3，每个样品制备3张载玻片，4℃保存15min；
5、在载玻片上添加一层LMPA以保护含有核的凝胶层；
6、将载玻片置于含有强碱性缓冲液（0.3 M NAOH和1 M EDTA，pH＞13）的电泳槽中浸泡15 min，诱导DNA的展开和变性；
7、电泳，电压为25 V，电流为30 mA，持续5 min，将DNA片段从未受损的DNA链中分离出来，温度4℃，避光；
8、观察载玻片，每张载玻片分析30个核，利用连接到图像分析系统的摄像机对彗星进行了检测，并利用图像软件分析；
9、彗星尾部端点强度（TI）与DNA损伤水平呈线性关系。
彗星实验要点
1、凋亡细胞的观察:看过国外此法作出的凋亡细胞彗星图像，很漂亮，用CASP软件分析后,其曲线呈典型的双峰，而正常细胞为单峰.我的一些教训：观察凋亡细胞最好把电压、电流、和电泳时间均调低，否则，凋亡细胞中的DNA片断跑的太块，荧光下根本看不到凋亡细胞的尾巴.注：我用的是中性条件，20V,200mA,20min, 凋亡细胞观察宜选用10V，100mA,10min.朋友们如果有异议，请不吝赐教，也对我有所帮助。
2、解旋20分钟应该没问题，但是我认为您的电泳时间过长，当然我不知道您的电泳条件(电压、电流、），我认为20分钟足够了,时间长了一是浪费时间，二是彗星图像不好，不利于分析.您的裂解时间有点短了,文献报道,最好不要少于1.5小时3、一般100ul0.5%低熔点胶中含400个细胞就足够了4、本版【图片仓库】子版有我做的彗星图像，感兴趣可以看看http：//www。
dxy。
cn/bbs/post/view？bid=66＆id=2729243＆sty=1&tpg=1&age=05、注意，CASP只读.tif扩展名的图像,如果你的相机拍摄的图像可以有.tif 格式,就更好了，如果是。
jpg格式，那还要在计算机中转换一下，不过很简单6、首先，荧光染色的东西最好马上看，否则影响结果。
其次,您的染色液量我觉得多了点，我用2ug/ml，1ml注射器1滴就可以。
第三，要忠于实验结果，图象内容不能更改，可以用ACDSEE或PHOTOSHOP 转换图象格式或大小，所以，作出来的实验图象质量要好7、。
背景的选择问题，如果图片质量好的话，背景大小不同，对结果影响不是很大,如果图片背景乱七八糟,那背景框的选择肯定对结果产生很大影响。
我的建议：背景框不要太大，参考我贴的那个图。
注意，背景框可以在细胞的上面或下面，如果背景框在上面时,分析后的图像（分析后出现一个头、尾分明的图像,是基本重合在细胞上的）质量很差，很不规则，那再把背景框调到下面试试，如果还是不好，那只能说你的结果质量不好了.背景框的选择关键在于分析同一批细胞，背景框要相同，才能保持资料的可比性。
体内彗星试验
附件15体内彗星试验In Vivo Mammalian Alkaline Comet Assay1 范围本规范确定了体内彗星试验的基本原则、要求和方法。
本规范适用于化妆品原料的遗传毒性检测。
2 试验目的评价化妆品用原料的遗传毒性。
3 定义3.1 碱性单细胞凝胶电泳：在单个细胞或细胞核水平检测DNA损伤的一种敏感技术。
3.2 彗星：经过电泳后细胞核的形状，形似彗星。
细胞核部分形成彗星头部，在电场力的作用下脱离细胞核的DNA片断形成彗尾。
3.3 “刺猬状”细胞：显微图像下由小或模糊不清的头以及大的弥漫性尾组成的细胞。
3.4 尾部DNA含量：反应总强度（彗头与彗尾之和）中彗星的强度。
可反应DNA片断的数量，用百分比表示。
3.5 最大耐受剂量：试验期内引起动物产生轻微毒性效应的最高剂量，在这个剂量下，动物产生明显的临床体征，如异常行为或反应，轻微的体重下降或靶组织细胞毒性，但是并不会引起死亡或痛苦。
4 试验原理DNA双螺旋结构在强碱性溶液中（pH>13）会松弛，在电场力的作用下，正常的DNA 保留在原位不动，而单链或双链DNA断裂所形成的DNA片断在会向阳极移动，形成彗星状。
DNA片断所形成的彗星状拖尾的长度及强度可以反应DNA片断的大小和数量。
通过检测尾部DNA含量（%）等终点指标可以评价DNA损伤程度。
5 试验基本原则动物染毒一定时间后处死并解剖动物，获取靶器官，制备单细胞悬液。
单细胞悬液与琼脂糖混合后经过裂解过程去除细胞膜，并暴露于强碱性溶液（pH>13）中进行DNA解旋，经过电泳、固定、染色，在荧光显微镜下观察，通过分析软件对彗星状细胞进行分析，判定DNA损伤程度。
每个样品需分析足够数量的细胞进行最终结果评价。
6 溶液的配制（所有溶液均现用现配）6.1 0.5%(w/v) 低熔点凝胶低熔点胶以0.5%(w/v)的浓度溶于D-PBS（无Ca2+、Mg2+和酚红）溶液中，并利用微波炉加热。
彗星试验
单细胞凝胶电泳分析法单细胞凝胶电泳分析法(彗星分析法)治愈癌症是一个难题,长期以来科学家们一直在苦苦探索.我们目前知道,致癌的过程与许多因素有关，但如果我们能阻止其中的任何一个步骤，癌细胞便无法形成。
因此,探测致癌物质的技术与癌细胞的及时发现就显得尤其重要！然而截至目前为止，科学家们仍无法研究出一种简易基因测试法或综合的方法来检测出可能的致癌物。
因此，致癌物对ＤＮＡ的作用仍是癌症研究的一个重要课题。
遗传毒物学为一专门研究化学及各类物质对人体遗传基因影响的科学。
人体每天暴露在大量的化学物质当中，为了诊测这些物质对人体ＤＮＡ的影响，科学家们发明了多种测定方法，然而，多年来人们所使用的这些测试方法却不能准确与快速的辨识出会使人体致癌的物质。
为了解决这些问题，单细胞凝胶电泳法（Single Cell Gel Assay）应运而生，通常亦称之彗星分析法（Comet Assay）。
它之所以称为彗星分析法是因为被破坏的DNA形似彗星，此方法已被证实是最具敏感性又最具快速性的方法。
研究人员使用这种方法可在２４小时内获得初步结果，在十天之内能得到结论性的证据。
此种测定方法速度远快于其它方法，不仅可以测出某种物质是否是致癌物，而且还可测出被破坏细胞的损害程度。
彗星分析法是用来判别某种物质是否是致癌物，并衡量其对人体ＤＮＡ修补的影响程度，这一分析过程是将健康的人体白血球接触于被测试的物质后，然后再用彗星分析法来进行测试，如果被测试的物质是致癌物质，那么ＤＮＡ将被破坏，而被损坏的ＤＮＡ将开始游离细胞核，形成彗星形状。
ＤＮＡ受到致癌物质的损坏愈大，ＤＮＡ碎段就愈多，愈小的ＤＮＡ碎段游离的速度就愈快，也游离愈远，因而形成了彗星的尾部，而较大的一些碎段位置则靠近细胞核，因而形成彗星的头部。
ＤＮＡ碎段的游动的程度不同 使它呈现出彗星状，使研究人员能很容易看清细胞的损害程，彗星的长度与ＤＮＡ的损害程度有关，此长度是指从细胞核到彗星尾端的距离，也就是说，彗星尾端愈长，细胞的损害程度愈大。
彗星实验
彗星实验收集目标细胞：处死小鼠后，迅速分离肝脏，选取最左叶肝脏，在4℃放置2h的PBS溶液中多次清洗，直至看不到血液。
将肝组织至于含有2 mL4℃PBS 溶液的小烧杯中，用小剪刀剪碎（2-3 mm）。
台盼蓝排斥法检测细胞活力，细胞存活率大于95%方可用于实验，调整细胞密度为5×105-106个/ml。
此步在暗室中进行。
制片：取100 μL置于45℃预热的0.75% NMA滴加于载玻片一侧，迅速盖上盖玻片（24 mm×50 mm），注意不要产生气泡，至4 ℃凝固约20分钟后轻轻移去盖玻片。
吸取10 μL待检测的细胞悬液与100 μL 37℃预热的0.75% LMA混匀，迅速将细胞混悬液滴加到第一层凝固的NMA上，再迅速盖上盖玻片使其均匀铺开，同样需避免起泡。
将玻片至4℃凝固约30 min，操作注意避光，每只动物制作三张平行片。
裂解：轻轻移去盖玻片，将载玻片水平轻缓浸入4℃预冷的裂解液（pH= 10），于4℃避光放置1 h。
解旋：轻轻拿出载玻片，浸入PBS缓冲液5 min，用滤纸吸去多余水分后放入电泳槽。
玻片并列放置，不留空隙。
将新鲜配置的冰冷电泳缓冲应用液轻轻倒入电泳槽，使液面完全覆盖载玻片，放置20 min解旋。
避光进行。
电泳：根据预实验，设置电泳仪25V、300 mA电泳20 min。
避光进行。
中和：切断电源，小心取出玻片，置染缸，中和缓冲液浸洗，3次×5 min/次。
脱水保存：从电泳仪中轻轻取出载玻片，浸入PBS缓冲液2次×5 min/次。
吸干周围水分后放入乙醇脱水，约1 h后取出自然晾干保存。
染色：在玻片上滴加EB染色液50 μL（5 μg/mL）染色，盖上新盖玻片。
用滤纸吸去多余染料，于2 h内使用荧光显微镜镜检。
镜检：EB染色后，未受损细胞在镜下表现为为圆形荧光核心，只有彗星头部，没有明显的尾。
受损细胞则有彗星尾伸向正极，形成一个亮的头部和尾部，形似彗星。
彗星实验
彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。
本实验对Singh 等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。
用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价DNA损伤的分析指标。
1 材料与方法1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％ CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。
1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。
1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；TritonX-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC 分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。
其余生化试剂均为分析纯。
电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP软件(casp-1.2.2，/index.php下载)；CO2培养箱：BB16HF型(上海力申科学仪器有限公司)；环地牌紫外辐照计(北京师范大学光电仪器厂)。
1.4 实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。
彗星实验_精品文档
彗星实验引言彗星一直以来都是天文学家们极感兴趣的研究对象。
这些神秘的天体经常在夜空中出现，但它们的起源和特性仍然是一个谜。
为了更好地理解彗星，科学家们进行了许多实验研究，探索彗星的成因、组成和行为。
本文将介绍一些与彗星相关的实验研究，以及这些实验对科学理解的贡献。
一、彗星的成因实验彗星的成因一直是科学家们关注的焦点。
根据现代天文学的认识，彗星由冰和尘埃组成的核心围绕太阳运行而形成，当彗星靠近太阳时，由于太阳的热量，核心表面的冰会汽化并形成彗尾。
为了验证这一理论，科学家进行了一系列实验。
实验1：模拟彗星核心科学家使用低温环境下的实验设备，模拟了彗星核心的条件。
他们将不同比例的冰和尘埃混合物注入真空箱中，然后通过控制温度和压力来模拟彗星附近的条件。
结果显示，当冰暴露在太阳热量下时，会出现蒸发现象，形成气体云团。
实验2：热解冰的实验为了更好地理解彗星冰的汽化过程，科学家进行了热解冰的实验。
他们使用激光或加热器对不同类型的冰进行加热，观察其汽化速率和生成的气体成分。
通过这些实验，科学家发现不同类型的冰具有不同的汽化温度和成分。
这些发现有助于推动彗星的起源研究。
二、彗星成分的研究实验除了了解彗星的成因外，科学家们还对彗星的成分进行了深入研究。
彗星的核心主要由冰、岩石和有机物质组成。
为了确定彗星的成分，科学家开展了一系列实验。
实验3：分析彗星样本在现实情况下，样本收集是非常困难的，因为彗星的远离地球。
然而，科学家有机会分析来自彗星的尘埃颗粒和气体，这些尘埃和气体是由彗星释放的。
通过采集和分析这些样本，科学家能够了解彗星中存在的化学物质和元素。
实验4：模拟彗星成分为了更好地理解彗星的成分，科学家基于已有的数据和实验结果，制作了模拟彗星成分的实验材料。
这些材料通常由冰、尘埃和有机物质组成，以模拟彗星核心的成分。
科学家通过研究和分析这些模拟物质，进一步了解彗星成分的可能性。
三、彗星行为的实验研究除了了解彗星的成因和成分外，科学家们还对彗星的行为进行了实验研究。
彗星实验量化步骤
彗星实验是一种用于测量DNA损伤的实验方法，其量化步骤如下：
1.细胞处理：将待测细胞进行处理，例如加入化学物质或辐射等，以诱导DNA损伤。
2.细胞裂解：将处理后的细胞进行裂解，使细胞内的DNA暴露出来。
3.电泳：将裂解后的细胞进行电泳分离，一般采用琼脂糖凝胶电泳，将DNA片段按大小分离。
4.染色：将电泳后的DNA染色，通常采用ethidium bromide或SYBR Green等染料，以便观察和记录DNA损伤情况。
5.成像：将染色后的凝胶置于紫外线下进行成像，以记录DNA损伤情况。
6.分析：使用专业软件对成像结果进行分析，计算DNA损伤程度的量化指标，例如尾部长度、尾部强度等。
7.统计分析：对实验数据进行统计学分析，例如t检验、方差分析等，以确定DNA 损伤是否具有显著差异。
彗星实验——精选推荐
彗星实验Comet Assay彗星分析系统软件功能: 彗星试验-单细胞凝胶电泳Single cell gel electrophoresis 是⼀种快捷、⾼灵敏度的检测DNA 受损的⽅法.Comet Assay 专业彗星试验图像分析软件,提供专业快速的测量⽅法。
测量指标包括头半径，尾长度，积分光密度，头/尾DNA 含量⽐例，尾矩，Olive 矩等多种参数。
具有⾃动或⼿动调节分割彗星头部和尾部功能同时提供对双染⾊系统的分析系统可⼴泛⽤于环境毒理学中对DNA 具有损伤作⽤的分析：如紫外光、电离辐射、氧⾃由基等因素造成的DNA 损伤。
以及细胞凋亡，抗癌药物的药物毒理学研究，遗传毒理研究和肿瘤治疗的跟踪监测等单细胞凝胶电泳(彗星试验):原理、应⽤和局限性彗星试验：原理、应⽤和局限性1. 前⾔过去⼗年中，彗星试验或单细胞凝胶电泳（SCGE）已成为⼀个评定DNA损伤的标准⽅法，⼴泛应⽤于遗传毒性试验、⼈类⽣物监测和分⼦流⾏病学、⽣态毒理学以及DNA损伤修复的基础研究，且因其简单、灵敏、多功能、快速、经济实⽤⽽赢得了⼴⼤科研⼯作者的青睐，和其有关的⽂献数⽬逐年上升。
在应⽤彗星试验时不会过多去考虑它如何运作和它提供何种信息，因为它在论证DNA损伤中的成功已⾜以证明它的价值。
这⼀点实在太可惜，因为它不仅能告诉我们细胞内存在的损伤的类型，⽽且能告诉我们损伤的程度。
尽管彗星试验是检测DN A断裂的基本⽅法，但由于对特异性核酸内切酶损伤的引⼊使其可以检测紫外线诱导的嘧啶⼆聚体，氧化碱基和烷基化损伤。
2.检测原理和检测指标2.1 背景⼆⼗世纪七⼗年代，Peter Cook和其同事们制定了⼀种⽤⾮离⼦去污剂使细胞溶解来研究核结构的⽅法。
这种处理除去胞膜、胞质和核质，并使核⼩体破裂（⼏乎所有的组蛋⽩均被浓盐提取），剩下的就是由核基质或RNA、蛋⽩质组成的⽀架以及DNA所构成的类核，其DNA的双螺旋以核⼩体的组蛋⽩为核⼼形成负超螺旋结构。
厦门大学-操作讲义-实验八.彗星试验单细胞凝胶电泳(SCGE)
用浓度为2μg/ml的PI染色液4℃染色5min。染色结束，用 预冷的PBS漂洗2min，弃PBS，50%甘油保湿。3h内阅完 玻片。
13
操作步骤
(10)镜检
使用荧光正置显微镜观察玻片，仪器参数设置为490nm激 发光(蓝绿色，看见红色荧光)、200倍观察、TIFF格式保存 文件。阅片时要保持玻片湿润，先低倍大体观察，再选择 有代表性区域阅片。
应用：是检测DNA微损伤的新方法， 在国际遗传毒性检测程序工作会议上已得到认可。 检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、 监测环境污染物对机体的遗传损害、 研究毒物致癌机制，等
4
单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis, SCGE)
特点： ①实验流程短(一天可完成实验); 图像获取和数据分析可隔日 完成； ②在单细胞水平上对DNA损伤进行可视性检测； ③准确性好、灵敏度高。
铺好的玻片完全浸入临用配制的预冷细胞裂解液中，4℃ 水 平放置，裂解2 h。
(5) 解链
将载玻片小心浸入预冷的解链电泳液中，4℃水平放置， 解 链0.5h。
(6) 电泳
接通电源，在300mA和25V条件下电泳20min。(调节液面)
12
操作步骤
(7) 中和
电泳结束，将载玻片小心转移到托盘，浸入中和液中和 20min。中和后用冰水洗2次，2min/次。
(11)单细胞凝胶电泳结果分析
每片随机观察100个细胞，计数彗星细胞百分率，用目镜 测 微尺测量彗星细胞尾矩，进行统计学分析。 统计学分析：采用SPSS软件进行单因素方差分析，各组 间 两两比较采用q检验。
14
实验记录
表1 不同剂量镉处理LO2细胞中彗星细胞百分率和尾长比较
彗星实验要点
彗星实验要点彗星是太阳系中的天体，由冰和尘埃组成。
研究彗星有助于我们了解宇宙的起源和演化过程。
在进行彗星实验时，需要注意以下要点：一、实验目的：实验的目的是观察和研究彗星的结构、成分以及行为规律，为研究宇宙的起源和演化提供数据和依据。
二、实验材料：1. 彗星模型：用于模拟真实彗星的结构和成分。
可采用球形模型，表面覆盖冰块和尘埃颗粒。
2. 光源：提供照明，以便观察彗星的亮度和行为。
3. 显微镜：用于放大观察彗星的细节和变化。
4. 光谱仪：用于分析彗星发出的光谱，确定其成分。
三、实验步骤：1. 准备工作：清洁实验器材，确保实验环境无尘、没有杂质。
2. 彗星模型的制作：按照彗星的特征，制作一个模拟彗星的球形模型，并在表面覆盖一层冰块和尘埃颗粒。
3. 光源照明：将光源照射在彗星模型上，观察彗星的亮度变化。
4. 显微镜观察：使用显微镜放大观察彗星模型的细节，并记录下变化和特征。
5. 光谱分析：使用光谱仪对彗星发出的光谱进行分析，确定彗星的成分。
四、实验注意事项：1. 安全第一：在实验进行过程中，要遵循实验室安全规范，避免任何可能的危险。
2. 实验环境：保持实验环境的稳定和整洁，避免影响实验结果。
3. 观察细节：在观察彗星模型时，要仔细观察和记录下彗星的细节变化，包括亮度、颜色、飘尾等。
4. 精确测量：在进行光谱分析时，要确保测量的准确性和精度，注意仪器的校准。
5. 结果分析：基于实验所观察到的数据和现象，进行合理的分析和推理，得出结论。
五、实验结果与讨论：1. 根据光谱分析的结果，确定彗星中的成分，如水、氨、甲烷等。
2. 分析彗星模型的亮度变化和飘尾现象，研究彗星的活动规律和运动轨迹。
3. 结合已有的彗星观测数据和理论模型，对实验结果进行讨论和比较。
六、实验结论：实验结果表明，彗星是由冰和尘埃组成的天体，其活动和运动受到多种因素的影响。
彗星实验为研究宇宙的起源和演化提供了重要的数据和依据。
七、实验的意义与展望：通过彗星实验，我们可以更好地了解彗星的结构、成分和活动规律，进一步探索宇宙的奥秘。
彗星实验
彗星实验(Comet assay),又称单细胞凝胶电泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE),各种理化因子作用细胞后引起的DNA链的断裂可用该方法检测[1～3]，并在统计学基础上对损伤程度做出评估[4]。
本实验对Singh等[5]建立的碱性彗星实验的一些步骤作了改良。
用超净工作台上的紫外消毒灯[可发射波长为254 nm的紫外线(Ultraviolet，UV)，属于UVC 波段范围]作为DNA损伤的诱导因子[7～9]，诱导K562细胞DNA损伤，用改良彗星实验检测损伤程度，验证改良的实验系统是否可靠，同时筛选并评价D N A损伤的分析指标。
1 材料与方法1.1 细胞K562细胞，来源于第四军医大学免疫学教研室，37 ℃、5％CO2培养箱中培养，取对数期细胞进行实验。
1.2 紫外线照射装置紫外消毒灯(ZSZ-20型，20 W，天津市紫晶特种光源有限公司)。
1.3 主要试剂和仪器培养基：10％新生牛血清(杭州四季青公司)，90％ RPMI-1640培养液(Hyclone公司)；双抗(青、链霉素，100 UI/ml)；Triton X-100(Genview分装)；二甲基亚砜、肌苷酸钠(Sigma分装)；低熔点琼脂糖(FMC分装)；常熔点琼脂糖(Spanish分装)。
其余生化试剂均为分析纯。
电泳仪：由西北大学物理系提供；电泳槽：DYC33A型(北京市六一仪器厂)；显微镜：Leica DM LB 2 (Leica 公司)；彗星图象分析软件：CASP 软件(casp-1.2.21.4 实验分组及UV处理收集对数生长的K562细胞，台盼蓝染色计数，细胞活力大于95％，用Hank's(pH7.4)调整细胞密度至1×105/ml，接种于塑料培养皿中(ф=35 mm，2 ml/plate)，然后进行紫外线照射(0.3 mW/cm2)。
实验分为对照组和8个照射组，各照射组分别照射3、5、10、40，60、120、180、240 s，对照组不进行紫外线照射，之后进行彗星实验。
彗星实验原理和方法
彗星实验原理和方法彗星是太阳系中一种具有尾巴的天体，主要由冰和尘埃组成。
彗星实验是通过模拟彗星状况来研究其物理性质和行为的实验。
彗星实验的原理是利用实验室中的设备和材料模拟彗星的环境和特征，从而观察和测量彗星相关现象。
本文将介绍彗星实验的原理和方法。
彗星实验的原理基于以下几个重要因素：彗星的组成、彗星的运动、彗星的进化过程。
彗星主要由冰和尘埃组成，当彗星靠近太阳时，太阳的辐射会使冰融化并形成尾巴；彗星的运动受到引力的影响，会围绕太阳轨道运动；彗星是古老物质的遗迹，可以提供有关太阳系形成和演化的信息。
彗星实验可以采用不同的方法和设备进行，下面是一种常见的彗星实验方法。
材料准备：-细粒子状尘埃：可以使用石英粉末或其他微尘颗粒。
-液态冰：可以使用液态氮或液态二氧化碳，用于模拟彗星的冰质。
-模拟太阳光源：可以使用激光或强光作为太阳光源。
步骤：1.准备一个实验室内的真空室，可以模拟外太空的真空环境。
2.在真空室内，制备一块透明板，将细粒子状尘埃均匀地撒在板上，形成尘埃层。
3.涂抹一层透明粘合剂在尘埃层上，使其牢固粘在板上。
4.用液态冰均匀地喷洒在尘埃层上，形成冰层。
5.在一侧装置模拟太阳光源，将激光或强光聚焦在冰层上。
6.开启真空室，创建接近真空的环境，同时以控制速度旋转冰层。
7.开启模拟太阳光源，照射在旋转的冰层上。
8.观察实验现象并进行记录和测量。
主要关注冰的蒸发和尘埃的运动情况。
彗星实验的结果可以提供有关彗星物理性质和行为的信息。
例如，可以通过观察冰的蒸发和尘埃的运动模式来研究彗星尾巴的形成和演化过程；可以测量冰的蒸发速率和尘埃的扩散速度，从而了解彗星的物质损失和彗星尾巴的演化机制。
彗星实验的优点是可以在控制条件下进行观察和测量，可以重复实验以验证结果。
然而，由于彗星的复杂性和特殊性，彗星实验仍然有一定的限制和挑战，需要进一步的研究和改进。
总之，彗星实验通过模拟彗星环境和特征，可以研究彗星的物理性质和行为。
彗星实验
1.制片第一层胶: 将预热45℃的80ul, 0.6% 的正常熔点琼脂糖(NMA ) 滴在磨砂载玻片的磨砂面上, 迅速用一干净玻片边缘将胶铺平, 或加盖盖玻片压平胶面, 将玻片臵保湿盒内,4℃,10 min 使胶凝固。
第二层胶: 将10ul 待测细胞悬液盒75ul, 0.6% 的低熔点琼脂糖(LMA ) 在37℃混匀,滴在第一层胶板上(加盖玻片者需先轻轻揭去盖玻片) , 迅速加干净的盖玻片使胶铺平, 将玻片臵保湿盒内, 4℃,10 min使胶凝固。
第三层胶: 在凝固的LMA 层上滴加37℃,0.6%LMA,盖上盖玻片,使其凝固。
铺第一层胶的目的是使第二层胶平整、附着紧密, 铺第三层胶的目的是对第二层胶中的细胞起保护作用。
2.裂解移去盖玻片, 将载玻片水平浸入新配臵的预冷4℃裂解液( 2.5 mol/LNaCl, 100mmol/L Na2EDTA,10 mmol/L Tris, 1%肌氨酸钠, pH = 10, 用前加入1% 体积的Triton X2100, 10%二甲亚砜) 中至少1小时。
此步骤的目的是溶解细胞膜及核膜, 除去蛋白质、RNA 等, 仅存留核骨架。
3.解旋从裂解液中取出载玻片, 用蒸馏水浸泡或PBS 冲洗, 洗去胶表面的盐溶液然后将载玻片臵于水平电泳槽中, 倒入新配制的碱性电泳缓冲液(1 mmol/L Na2EDTA,300 mmol/L NaOH, pH = 13), 约没过胶面0.25cm 左右, 碱解旋20～40 min, 以便使DNA 在碱性条件下解旋成单链DNA,使DNA 断片在电泳场中易于迁移。
4.电泳电压25V,电流300mA,低温避光,电泳20～40min。
5.中和将载玻片取出,用0.4 mmol/L Tris 缓冲液(pH = 7.5) 中和2～3 次, 每次5～15 min, 以除去碱和去污剂,以免影响染色效果。
6.染色观察根据显微镜的滤镜种类选择染色剂。
常用吖啶橙(2mg/L)、溴化乙啶(20mg/L)、碘化丙啶(2.5～5.0 mg/L )、4,6-联脒-2-苯基吲哚(5 mg/L )或苯并嗯唑啉2-2喹啉等, 用量50～ 100ul, 滴臵胶板上, 盖上盖玻片, 24小时内检测, 时间过长将导致荧光减弱。
彗星实验原理
彗星实验原理一、引言彗星是天文学中的一种天体，由于其不规则的形状和长尾巴的特征，备受人们关注。
为了更好地研究彗星，科学家们开展了许多实验，其中最著名的就是彗星实验。
本文将详细介绍彗星实验的原理。
二、什么是彗星实验彗星实验是一种用于模拟彗星运动轨迹的实验。
科学家通过在实验室中制造类似于彗星运动轨迹的物理环境，来研究和探索这些天体。
三、原理1. 引力作用在太阳系中，每个天体都会受到其他天体的引力作用。
这种引力作用会影响它们的运动轨迹。
同样地，彗星也会受到太阳和其他行星的引力作用，并且其运动轨迹也会因此发生变化。
2. 离心力作用除了引力作用外，离心力也会影响彗星运动轨迹。
当一个物体在高速旋转时，它所受到的离心力就越大。
同样地，在太阳系中旋转速度快的行星和卫星所受到的离心力也会更大。
3. 摩擦力作用摩擦力是指当一个物体在介质中运动时，由于介质的阻力而产生的一种力。
对于彗星来说，其尾巴所处的空间中存在着一定的气体和尘埃，因此彗星在运动过程中也会受到摩擦力的作用。
4. 实验装置为了模拟彗星运动轨迹，科学家们通常使用一个旋转的圆盘来代表太阳，并在圆盘上放置一些小球来代表行星和卫星。
然后将一个小球（代表彗星）放置在圆盘上，并让它开始旋转。
通过改变圆盘的旋转速度、小球之间的距离以及小球之间的质量等因素，科学家们可以模拟出不同情况下彗星运动轨迹的变化。
四、应用通过彗星实验，科学家们可以更好地理解和研究太阳系中各个天体之间的相互作用关系，从而更好地预测和解释彗星运动轨迹上出现的各种现象。
此外，还可以借助实验结果来验证天文观测数据的准确性，并为未来的天体探测任务提供指导。
五、结论彗星实验是一种用于模拟彗星运动轨迹的实验，其原理主要包括引力作用、离心力作用和摩擦力作用等因素。
通过这种实验，科学家们可以更好地研究和解释彗星运动轨迹上出现的各种现象，并为未来的天体探测任务提供指导。
彗星电泳法
彗星电泳法引言彗星电泳法（Comet assay），又称为碱性单细胞凝胶电泳（alkaline single-cell gel electrophoresis），是一种常用于评估DNA单链断裂程度及修复能力的实验技术。
该方法采用凝胶电泳原理，可以通过观察DNA在电泳中的迁移情况，定量分析DNA的双链断裂、单链断裂及碱解位点等信息，从而评估DNA的损伤程度。
彗星电泳法的原理彗星电泳法的原理是基于以下核心步骤：首先，细胞样品被混悬于低熔点琼脂糖凝胶中，并在裂解液中经过裂解，使DNA在凝胶中解旋并生成碱性单链凝胶。
然后，电泳运行期间，电场引起DNA向阳极移动，而碱解位点产生的碱性断裂会导致DNA 片段扩散，形成类似彗星尾巴的凝胶结构。
最后，经过染色和显微镜观察，可以评估DNA的尾巴长度和形态，进而对DNA的损伤程度进行定量分析。
彗星电泳法的步骤1.细胞样品准备：从感兴趣的组织或细胞中获取细胞样品，确保准备成单细胞悬液。
2.碱性裂解：将细胞样品与裂解液混合，并孵育一段时间，使DNA完全解旋并生成碱性单链凝胶。
3.电泳运行：将样品嵌入琼脂糖凝胶中的水平电泳槽中，通过施加电压使DNA向阳极运动，进行电泳分离。
4.染色和显微镜观察：完成电泳后，对凝胶进行染色处理，然后在显微镜下观察和拍照记录。
5.图像分析和结果计算：通过图像处理软件对拍摄的彗星图像进行分析，计算出DNA尾巴长度、形态等参数，从而评估DNA的损伤程度。
彗星电泳法的应用彗星电泳法在生物医学研究领域具有广泛的应用，主要用于以下几个方面：1. 检测环境致突变物质彗星电泳法可以用于评估环境中存在的致突变物质对细胞DNA的损伤程度，如化学物质、辐射等。
通过比较不同处理组织样品的彗星图像特征，可以评估不同处理条件下DNA的损伤程度，进而评估致突变物质的毒性和致突变性。
2. 评估细胞DNA修复能力彗星电泳法可以用于评估细胞对DNA损伤的修复能力。
研究人员可以在不同时间点收集细胞样品，然后通过彗星电泳法评估不同时间点DNA损伤的程度，从而了解细胞DNA修复过程中的动态变化。
彗星实验原理
彗星实验原理引言：彗星是宇宙中一种常见的天体，它们由冰和尘埃组成，随着它们接近太阳，冰会融化并释放出尘埃和气体，形成美丽的尾巴。
彗星实验旨在模拟彗星的形成和演化过程，以深入研究它们的物理特性和化学成分。
本文将介绍彗星实验的原理和相关实验方法。
一、原理：彗星实验的基本原理是模拟宇宙中的低温和真空环境，使冰体受到太阳光辐射和其他外部因素的影响而产生物质的释放和形态变化。
主要包括以下几个方面：1.1 低温环境模拟在彗星实验中，科学家使用低温设备或液氮等冷却剂将实验室温度降低到接近宇宙中的低温环境，通常在几十到几百摄氏度以下。
这样可以使冰体保持固态，并模拟宇宙中的低温条件。
1.2 真空环境模拟为了模拟宇宙中的真空环境，彗星实验通常在高真空条件下进行。
科学家使用真空泵将实验室内的气体抽取，降低压强，使实验室内的气体浓度接近于零，以模拟真空环境。
1.3 光辐射模拟彗星实验中，科学家使用光源模拟太阳光辐射，照射到冰体上。
太阳光中的紫外线和其他辐射能够加热冰体并引起其物质的释放和变化。
二、实验方法：彗星实验的具体方法可以根据研究目的和实验条件的不同而有所差异。
下面介绍几种常见的实验方法。
2.1 冰体加热实验科学家将冰体放置在真空室内，并通过光源照射冰体，加热冰体表面。
随着冰体受热，冰体内的冰开始融化，并释放出尘埃和气体。
科学家可以通过观察和分析释放物质的特性来研究彗星的物理和化学性质。
2.2 冰体射流实验科学家将冰体装置在喷嘴中，并通过真空泵抽取气体，使喷嘴内部形成真空环境。
然后，科学家通过加热冰体，使冰体融化并形成射流。
通过观察射流的形态和特性，科学家可以了解冰体在真空环境下的行为和变化。
2.3 冰体基质实验科学家将冰体与其他物质（如尘埃、有机物等）混合，并模拟宇宙中的条件。
通过研究冰体与其他物质之间的相互作用，科学家可以推测彗星中的化学成分以及其形成和演化过程。
三、实验结果及意义：彗星实验的实验结果可以提供有关彗星物理特性和化学成分的重要信息，并对我们理解彗星的起源和演化提供帮助。
彗星试验方法
主要仪器数显电热恒温水浴箱、电泳仪、电子分析天平、荧光显微镜及数码成像系统、匀浆器、磁力搅拌器。
主要试剂氯化镉（CdCl2·2.5H2O），分析纯，上海亭新化工试剂厂，批号20080901。
使用时用去离子水配制成不同浓度。
正常熔点琼脂糖（NMA），低熔点琼脂糖（LMA），N-十二烷基肌氨酸钠，Triton-X-100，溴化乙锭（EB）。
氯化钠，氯化钾，磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O），磷酸二氢钾（KH2PO4），乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA），三（羟甲基）胺基甲烷（Tris），氢氧化钠（NaOH），二甲基亚砜（DMSO），盐酸（HCl）等，均为国产分析纯试剂。
主要溶液的配制磷酸缓冲液（PBS）NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4.12H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，无Ca2+、Mg2+双蒸水1000ml，调pH至7.4，冰箱4℃保存备用。
0.5%正常熔点琼脂糖（NMA）0.5g NMA与100ml磷酸缓冲液混合，加热溶解，冷却后冰箱4℃保存备用。
0.5%低熔点琼脂糖（LMA）0.5g LMA与100ml磷酸缓冲液混合，加热溶解，冷却后冰箱4 ℃保存备用。
细胞裂解液精确称取NaCl 146.1g，Na2EDTA 37.2 g ，N-十二烷基肌氨酸钠10 g，Tris 1.22 g，放入1000 ml烧杯中，加800ml双蒸水，磁力搅拌溶解（可加热），以4 mol/L NaOH调pH到10.0，在容量瓶中加水定容到1000 ml。
冰箱4℃保存备用。
临用前根据用量按总体积加1% Triton-X-100，10% DMSO混匀。
碱性电泳缓冲液Na2EDTA 0.186g，NaOH 6g，加500ml双蒸水定容，pH13，现配现用。
Tris-HCl中和液称取Tris 48.44g，加600ml双蒸水溶解，用浓盐酸（约13.5ml）调pH值至7.5，加水定容到1000ml，4℃保存备用。
彗星实验
彗星实验彗星实验又称单细胞凝胶电泳实验。
实验原理：它能有效地检测并定量分析细胞中DNA单，双链缺口损伤的程度。
当各种内源性和外源性DNA损伤因子诱发细胞DNA链断裂时，其超螺旋结构受到破坏，在细胞裂解液作用下，细胞膜、核膜等膜结构受到破坏，细胞内的蛋白质、RNA以及其他成分均扩散到电解液中，而核DNA由于分子量太大不能进入凝胶而留在原位。
在中性条件下，DNA片段可进入凝胶发生迁移，而在碱性电解质的作用下，DNA发生解螺旋，损伤的DNA断链及片段被释放出来。
由于这些DNA的分子量小且碱变性为单链，所以在电泳过程中带负电荷的DNA会离开核DNA 向正极迁移形成"彗星"状图像，而未受损伤的DNA部分保持球形。
DNA 受损越严重，产生的断链和断片越多，长度也越大，在相同的电泳条件下迁移的DNA量就愈多，迁移的距离就愈长。
通过测定DNA迁移部分的光密度或迁移长度就可以测定单个细胞DNA损伤程度，从而确定受试物的作用剂量与DNA损伤效应的关系。
该法检测低浓度遗传毒物具有高灵敏性，研究的细胞不需处于有丝分裂期。
同时，这种技术只需要少量细胞。
实验材料：玻片、琼脂糖、细胞裂解液、碱性解链溶液（PH>13,200mM NaOH,1Mm EDTA）、电泳槽、超纯水、DAPI、PBS、荧光显微镜。
实验步骤：1.制片：配制1%的琼脂糖凝胶，于微波炉中加热融化后，浸泡磨砂玻片，用吸水纸将玻片滑面及四周吸干，自然晾干备用；2.细胞处理：将细胞消化收集，离心后吸弃上清，用预冷的1*PBS清洗细胞一次，以1*10^5细胞/ml悬浮细胞；3.铺胶：将细胞与凝胶以一定的比例（1：10）混匀后迅速滴于玻片上，在显微镜下观察细胞的数目（注意调整比例及铺板均匀），4℃黑暗环境中固化10min；4.裂解：轻轻取出玻片，将玻片浸于预冷的细胞裂解液中，4℃避光裂解30-60min;5.解旋：从裂解液中取出载玻片，用PBS浸泡玻片3次，每次3mim,用纸巾吸去玻片上的液体，置于水平电泳槽，加入新鲜配制的碱性电泳缓冲液至高于玻片表面3mm以上，避光解旋30min;6.电泳：电压30V,电流300Ma,电泳30min。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1、凋亡细胞的观察：看过国外此法作出的凋亡细胞彗星图像，很漂亮，用CASP软件分析后，其曲线呈典型的双峰，而正常细胞为单峰。
我的一些教训：观察凋亡细胞最好把电压、电流、和电泳时间均调低，否则，凋亡细胞中的DNA片断跑的太块，荧光下根本看不到凋亡细胞的尾巴。
注：我用的是中性条件，20V，200mA,20min, 凋亡细胞观察宜选用10V,100mA,10min。
朋友们如果有异议，请不吝赐教，也对我有所帮助。
2、解旋20分钟应该没问题，但是我认为您的电泳时间过长，当然我不知道您的电泳条件（电压、电流、），我认为20分钟足够了，时间长了一是浪费时间，二是彗星图像不好，不利于分析。
您的裂解时间有点短了，文献报道，最好不要少于1.5小时3、一般100ul0.5％低熔点胶中含400个细胞就足够了4、本版【图片仓库】子版有我做的彗星图像，感兴趣可以看看/bbs/post/view?bid=66&id=2729243&sty=1&tpg=1&ag e=05、注意，CASP只读.tif扩展名的图像，如果你的相机拍摄的图像可以有.tif 格式，就更好了，如果是.jpg格式，那还要在计算机中转换一下，不过很简单6、首先，荧光染色的东西最好马上看，否则影响结果。
其次，您的染色液量我觉得多了点，我用2ug/ml，1ml注射器1滴就可以。
第三，要忠于实验结果，图象内容不能更改，可以用ACDSEE或PHOTOSHOP 转换图象格式或大小，所以，作出来的实验图象质量要好7、。
背景的选择问题，如果图片质量好的话，背景大小不同，对结果影响不是很大，如果图片背景乱七八糟，那背景框的选择肯定对结果产生很大影响。
我的建议：背景框不要太大，参考我贴的那个图。
注意，背景框可以在细胞的上面或下面，如果背景框在上面时，分析后的图像（分析后出现一个头、尾分明的图像，是基本重合在细胞上的）质量很差，很不规则，那再把背景框调到下面试试，如果还是不好，那只能说你的结果质量不好了。
背景框的选择关键在于分析同一批细胞，背景框要相同，才能保持资料的可比性。
结果的保存，记得好像使用说明里提到了，如果没有提到，那就是我原创的！！！呵呵，先卖个关子。
FILE菜单下有一个EXPORT RESULTS（输出结果）的按钮，点击以后，默认是.TXT文本文件，好了，给你的输出文件起个名字，选择保存位置，点击确定就OK了，回到你保存的输出结果文件，发现它是一个不可识别的文件，那就直接把它的扩展名改成.TXT，打开它，看看你的结果，包括13个指标，很好，这个.TXT的结果文件可以被SPSS统计软件直接识别，不是很方便吗？？（如果你愿意把数据一个一个地输入统计软件，我也没意见，呵呵）。
这里还有一个小窍门，在用SPSS读取之前，最好把你的结果文件调整一下，这也是我发现的。
把所有的指标都排列到第一行，下面的结果要和指标一一对应，每个数据之间留空格（默认的），行与行之间不要用回车，就是不要有空行，其实调整起来很简单，主要是调节.TXT文本文件阅读框的宽度。
调好后，SPSS软件直接识别，很方便，为你节省很大工作量，不信就试试。
8、我用双层铺胶法，自制微电泳槽，第一层:0.75％正常熔点胶，100μl，第二层：0.75％低熔点胶，75μl+25μl淋巴细胞悬液，用枪直接把凝胶吹到自制的微电泳槽中，铺平即可。
第二层以相同的方法铺到第一层上面，不必担心脱胶的问题。
9、盖玻片用普通的就可以了，但是可以自做的，普通的盖玻片其实有点小了，如果胶很多的话，第二层胶非常厚，这样不利于观察细胞，而且不利于电泳。
3。
染色后要用双蒸水冲洗，据我的经验，冲要冲的非常干净，否则背景太亮了，拍照后不容易分析。
但是又不能使劲的冲，否则胶很容易掉下来。
4。
电泳的时间一般是20分钟，电压各个细胞是不同的，你可以查查有关资料，自己做做预试验。
一般情况下，对照组的细胞的tail DNA%应为10%左右，不超过20%，如果尾巴太短了，也不好。
5。
分析要用荧光显微镜的，具体的染液，有不同的激发波长。
casp软件在前面的帖子中就有。
很好用的，在推荐一次哦。
最好用显微镜自带的相机，如果你的技术好的话，可以在目镜照相，洗出来扫描后可以分析的。
6.把EB滴加在胶上就可以了。
观察时要在暗室里。
我是用EB的，电泳后，直接在胶板上滴上一滴，然后用水冲洗，用滤纸吸去多余水分，荧光显微镜观察10、SCGE技术的原理：细胞核中的DNA为负超螺旋结构，而且很致密，通常DNA双链以组蛋白为核心，盘旋而形成核小体。
一般情况下，偶然的DNA单链断裂对核酸分子双股结构的连续性影响不大，而且不易释放出来，但是，如果用去污剂破坏细胞膜和核膜，用高浓度盐提取组蛋白，DNA残留而形成类核。
如果类核中的DNA有断裂，断裂点将引起DNA致密的超螺旋结构松散，在类核外形成一个DNA晕圈。
将类核置于电场中电泳，DNA断片可从类核部位向阳极迁移，经荧光染色后，在阳极方向可见形似彗星的特征性图像，故称“彗星试验”。
彗星尾部即为迁移出类核的DNA片段。
此时彗星尾部有可能还与头部以单链或双链的形式相连。
DNA损伤越严重，导致DNA超螺旋结构越松散，产生的断裂点越多，DNA片段越小，从而在彗星尾部出现的DNA断片越多，则慧尾的长度、面积和荧光强度越大。
通过测量彗星尾部的长度、面积或荧光强度等指标，可以对DNA的损伤程度进行定量分析。
随着SCGE技术的发展，可测量的指标也越来越多，而且更准确。
目前，用于S CGE分析的指标主要分为四类，包括形状指标、距离指标、强度指标和矩类指标。
其中形状指标有彗星细胞率；距离指标包括彗星尾长、彗星全长、彗星头部半径、尾部半径；强度指标包括头部DNA百分含量、尾部DNA百分含量、头部面积、尾部面积等；矩类指标包括尾矩、Olive尾矩等。
11、H2O2是作为阳性对照的吧？它是标准的断裂剂。
但是不同的细胞对它的敏感程度是不同的，我觉得前几个数据有必要删掉，30微摩尔以下的浓度应该是会造成断裂的。
．PI染色我见过，染出来的效果也是很不错，是蓝色的。
不一定用EB染色呀，毒性又大。
12、单细胞琼脂糖凝胶电泳（comet assay）Single Cell Agarose Gel Electrophoresis (SCGE)步骤：一、细胞悬液的制备：1. 吸弃旧培养基，D-Hanks冲洗2遍2. 0.25%胰酶消化，待细胞变圆，间隙增大，立即终止消化，用弯头吸管轻轻吹打细胞，使成细胞悬液，加入离心管，1000rpm，离心10min，弃上清，以1 mlD-Hanks悬浮细胞，以上应在暗室及较低温度下进行。
各组收集细胞2~3×1 06个，必须分散成单个。
悬浮于1mlPh7.4PBS中，此步在暗室及较低温度下进行。
二、玻片制备：1. 玻片磨砂。
2. 制备0.5%正常熔点琼脂糖(NMPA)和0.5%低熔点琼脂糖(LMPA)各20ml。
用pH7.4 PBS配制。
称0.1g溶于20mlPBS，如NMA与玻片附着不紧，可升高其浓度至0.65%。
铺第一层胶：0.5%NMPA 100μl于磨砂玻片面，迅速盖上盖玻片，室温>5min 使其固化，即为第一层胶；第二层胶：37℃0.5%LMPA 100μl+30-50μl（1-2x106）细胞悬液(10:1)混匀，迅速铺于第一层胶上，盖新盖玻片，移入冰箱>5min，使其固化。
* 余下的细胞1000g×10min离心，于0.1-0.2ml悬浮缓冲液中混匀，做Wester n-blot。
三、细胞溶解：1. 玻片缓缓浸入新鲜配制的冰凉细胞溶解液中，4℃>1小时或过夜。
玻片在细胞消化液中可至少存放4周。
细胞溶解液配制NaCl 146.1 gNa2EDTA 37.2 gTris base 1.2 g用约12克NaOH调节pH至10。
用去离子水定容至890ml。
过滤除菌，为贮备液。
室温保存。
应用液加入Triton X-100 至1%DMSO 至10%（消除血液或动物组织中血红蛋白释放的铁产生的自由基）应用前冷藏30~60分钟。
4、碱化处理及电泳：取出玻片，放入水平电泳槽中(正极端)，并列放置，不留空隙。
倒入新鲜配制的冰冷电泳缓冲应用液，高于胶2mm，无气泡。
放置10~ 30分钟，本室一般采用15min，使DNA解链。
25V, 300mA电泳20分钟。
通过调节液面来调电压。
(电压先调到最大，电流300mA然后通过液面来调节电压) 电泳缓冲应用液：10N NaOH 30.0 ml（12克）200mM EDTA 5.0 ml （二钠为0.372g）(附言：电泳缓冲液储备液：10N NaOH 200g/500ml水，两周内用。
200mM EDTA 14.89g/200ml水，pH=10,室温保存。
）定容至1000ml，混匀，电泳前新鲜配制。
可通过改变液面高度来调节电压。
5、中和：切断电源，取出玻片，置染缸，中和缓冲液浸洗，3次×5min。
中和缓冲液：Tris base 48.5 g去离子水定容至1000ml用>10 N HCl调节pH至7.5。
室温保存。
6、染色呈中性后，凉干玻片，50μl EB应用液染色，盖上新盖玻片。
EB染色液(10×贮备液)EB 1 mg 去离子水20 ml 室温避光保存。
临用时将贮备液稀释10倍。
使终浓度为5μg/ml以上除中和及染色外，各步均应在暗处进行，以避免额外的DNA损伤。
7、镜检及结果评价EB染色后的DNA样品应尽快在荧光显微镜下观察。
未受损细胞表现为以圆形荧光核心，即彗星头部，没有尾巴。
受损细胞则有彗尾伸向阳极，形成一个亮的头部和尾部。
用目镜测微尺或拍摄×400倍照片再作判断。
每个样品中至少随机挑选25个细胞测定。
彗星尾长度<35μm为未损伤，35-70μm为中度损伤，>70μm为重度损伤裂解液中，最难溶解的是SLS,它在中性的时候不易溶于水，所以你把其他的药品加进去后，先不要加SLS，这里需要磁力搅拌器搅拌，但是时间不会很长。
溶解后，用NaoH把PH调到10，这里调PH值要用NaoH固体，然后把SLS加进去，在用磁力搅拌器搅拌，一般需要加热，50度左右就可以了。
大约搅拌1个小时就可以溶解。
这时，溶液应该是透明的，不是乳白色的。
加热溶解的过程中，可能会损失一定的水分，等搅拌完了后，你要把溶液的量补充到你最后需要的体积。
当你从冰箱中取出裂解液后，裂解液如果有沉淀，你就把它放在37度水浴中让它充分溶解，然后把DMSO和Triton-100加进去，这时，还是乳白色的，你把他放在37度中放一会就可以了。
注意，溶液的颜色是透明清亮的，浑浊的话，不能起到裂解的效果，最后跑不出彗星来。