单细胞凝胶电泳(SCGE)检测锰损伤神经元DNA

单细胞凝胶电泳(SCGE)检测锰损伤神经元DNA1

陆彩玲，郭松超，鲁力，陈维平，邝晓聪

广西医科大学公共卫生学院，广西南宁（530021）

E-mail：lcling78@

摘要：目的建立体外染锰细胞模型，探讨锰神经毒性的作用机制。方法：以原代培养的成熟皮层神经元为靶，据本室前期试验结果确定低中高不同浓度的锰液（分别为0.2mmol/L,0.6mmol/L,1.0mmol/L），与神经细胞共孵育。显微镜观察各组神经细胞形态学的变化，用单细胞凝胶电泳试验（SCGE）检测神经细胞的DNA损伤，以彗星细胞尾长及彗星样细胞百分率为评价损伤的指标。结果：光镜下可见不同浓度锰孵育后神经细胞形态学发生改变，单细胞凝胶电泳试验显示神经细胞DNA出现不同程度的损伤，彗星尾长及彗星样细胞百分率较对照组明显增加（P＜0.01）。尤以高浓度锰组损伤组严重，显著高于中低浓度组（P＜0.01）。结论：锰不但能引起体外培养的神经细胞外在的形态学损伤，还可导致神经细胞DNA的损伤。

关键词：锰，单细胞凝胶电泳 (SCGE)，DNA损伤

目前，随着生产工艺的改进和预防措施的加强，严重的职业性锰中毒已很少发生，但长期低剂量的锰暴露依然存在，并对接触者的潜在影响仍不可低估。慢性锰中毒是进行性的、不可逆的病变，并且锰对接触者的危害正由临床型向亚临床型转变，因而更为敏感、特异的效应指标，以早期筛检出亚临床中毒者及高危人群，是今后锰神经毒性研究中重点解决的问题。

DNA损伤是遗传毒理学的一个重要研究领域，长期不可逆转的DNA损伤累积可诱导细胞突变、畸变。单细胞凝胶电泳(Singl cells gel eletrophoresis,SCGE)又称彗星试验（comet assay），由Ostling等（1984）首创，后经Singh等（1988）进一步完善并逐渐发展起来的一种快速检测单细胞 DNA损伤的实验方法，适用于多种细胞，广泛应用于检测诱变剂、射线等对DNA的损伤、监测环境污染物对机体的遗传损害、研究毒物致癌机制等方面，具有经济、简捷、灵敏等优点，日益广泛地应用在各种诱变剂的遗传毒性检测上。鉴于此，本研究以此法检测染锰后对神经细胞遗传物质的影响，探讨锰神经毒性的机制，为锰中毒的防治提供研究基础。

1. 材料与方法

1.1 试剂

MnCl2·4H2O(购自上海生化试剂公司, AR级), Dulbcco's Modifed Eagle 培基(DMEM,高糖)及新生小牛血清购自Gibco公司(美国)，L-谷氨酰胺与多聚赖氨酸 (PL YS)购自生物工程产品公司（上海）.低熔点凝胶(LMPA)及正常熔点凝胶(NMPA)、TritonX-100、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)、Tris-HCl、溴乙锭(EB) 购自Sigma 公司（美国）其他所有试剂都达试验用的分析纯级

1.2 皮层神经元的原代培养

制备原代皮层神经元方法参照方法所述[1]. 取新生24小时内Wistar 乳大鼠，消毒后冰层上剥离大脑皮层，解剖显微镜下剔除血管、脑膜及海马组织后转入盛D-Hank’s液的玻璃瓶，机械法分离神经细胞。200um稠布筛网过滤神经细胞悬液，滤后悬液800转/分离心5

1本课题得到国家自然科学基金资助项目（项目批准号：30260095）的资助。

分钟，弃上清，重悬细胞并离心，重复3次。最后，以含15%新生小牛血清的DMEM调整细胞密度为1×105 /ml，接种于24孔板内的圆玻片上，玻片提前用多聚赖氨酸包被（隔夜），细胞培养于37°C、5% CO2培养箱。3-5天后加入阿糖胞苷(Ara C, 10-5mol/l)以抑制非神经细胞增殖。

1.3 尼氏染色

确认培养物即是所需神经细胞，采用传统的的尼氏染色法，步骤如下。镊子夹出孔板中的圆玻片，PBS小心洗掉培养液并用中性福尔马林液固定30分钟。PBS冲洗，1%甲苯胺蓝染色3分钟，去离子水冲洗后乙醇纠正色差，脱水后于光学显微镜下观察。

1.4 细胞分组

培养7-9天，神经细胞达最佳生长状况后即开始试验。根据神经细胞与含锰的DMEM 孵育与否，将细胞分对照组与锰处理组。后者包括低、中、高三个浓度锰组，根据本室前期的研究结果，锰的浓度分别设为0.2mmol/L,0.6mmol/L,1.0mmol/L ，对照组为正常培养的神经细胞。各组干预24小时后终止处理。

1.5 单细胞凝胶电泳

单细胞凝胶电泳（SCGE或彗星试验）参照Sigh等人的方法[2]并稍作改动。冰冻的载玻片覆盖100ul1%的低熔点凝胶并储存于4°C，15分钟直到胶凝结。细胞与0.6%正常熔点凝胶的混合物铺做第二层并置4°C，15分钟直至凝固。此后载玻片浸入新鲜制备的、预冷的裂解液中裂解90分钟。之后，载玻片平放于电泳槽电泳（电泳条件为200mA,20V,30min），再以中性缓冲液淋洗载玻片，10ug/ml EB染色后在配有数码相机的病理图像分析仪下观察、分析。整个试验操作在暗室中进行，以免造成DNA额外的、人为的损伤。以计数的100个细胞中彗星样细胞出现率及彗星尾长为评价DNA损伤程度的指标(200×)。

1.6 统计分析

所有数据以均数（M）±标准差(S.D)表示，单因素方差（ANOV A）比较各组均数的统计学差异，行×列比较各组百分率的构成差异，统计学差异水平设为5%。

2. 结果

2.1 体外的皮层神经细胞

体外的神经细胞在24小时内黏附于孔板底的圆玻片，头3天生长迅速。阿糖胞苷加入后抑制了非神经细胞的增殖，神经细胞轮廓清晰，以多型胞体,突起粗大，核浆比例大为特征，神经元间在体外形成神经网络。(图1)

Figure 1

Fig1 400×成熟的皮层神经元，胞体多形，突起粗大、光滑，核浆比例大，相互间形成神经网络。

Figure 2

Fig2 400× 示核及丰富的尼氏小体，神经元胞浆中核及尼氏小体经甲苯胺蓝染色后显蓝紫色。

图1--2 体外正常培养的神经细胞及其鉴定（尼氏染色）

2.2 神经元的尼氏染色

皮层神经元胞浆中具有大量的尼氏小体，与碱性甲苯胺蓝有强大的亲和力而被染成蓝紫色，胞浆中央往往有一至两个核仁，但非神经胶质细胞则没有这些特征。（图2）

2.3 锰干预后神经细胞的形态学改变

皮层神经元经不同浓度锰处理24小时后，镜下可见明显的形态学损伤变化，正常的神经网络遭破坏，神经皱缩或肿胀成一小球，并随着锰浓度的增加的加剧。仍贴壁的神经元则轮廓模糊，间断的神经突起呈串珠样改变。（图3—6)