反应器细胞培养技术在疫苗生产中的应用和发展

反应器细胞培养技术在疫苗生产中的应用和发展

王建超、张韧、陈文庆、阎杰

北京天和瑞生物科技有限公司，北京市昌平科技园白浮泉路11号，邮编:102200

摘要我国疫苗市场正迅速发展，疫苗生产技术也正经历着一场深刻的技术革新：从大规模转瓶培养动物细胞疫苗工艺技术向生物反应器培养动物细胞疫苗工艺技术的转变。这种疫苗工艺技术的转变，合乎世界生物制药发展趋势，也表明我国疫苗生产技术正逐步与世界生物制药技术发展主流接轨。反应器细胞培养技术不仅提高我国疫苗生产工艺水平和疫苗质量，推动生物反应器、反应器细胞培养技术在我国疫苗行业中的研发应用和技术发展，将促使我国从疫苗生产大国向疫苗生产强国的发展。本文从反应器细胞培养技术的历史发展、应用现状、关键技术因素，以及核心设备——生物反应器的发展、应用等方面进行了综述，分析并探讨了国产生物反应器以及反应器细胞培养技术在我国疫苗生产中的应用前景。

我国是世界疫苗产品的最大使用国和最大生产国。因为SARS、流感、禽流感、蓝耳病等疾病的发生，我国疫苗市场增长迅速，每年以平均15％的速度递增，远远高于全球10%的水平, 预计到2012年包括兽用疫苗在内的中国疫苗市场规模可超过100亿元。目前人用、兽用等疫苗生产企业近百家，疫苗品种数量与发达国家差距较小，但关键生产工艺以及部分疫苗质量存在较大差距。涉及动物细胞培养生产的疫苗，大部分疫苗生产企业采用的转瓶培养动物细胞，因不同转瓶是一个独立的细胞培养单元，每瓶的细胞质量、病毒产量和滴度都不同，导致疫苗批间差大，而且操作劳动强度大，隐性污染引起高内毒素等缺点。

我国政府高度重视疫苗在疾病防治中的作用，国家政策和科研基金等对企业疫苗生产和研发工作给予重要的支持。我国扩大了国家计划免疫规划范围，将甲肝、流脑等15种可以通过接种疫苗有效预防的传染病纳入国家免疫规划。口蹄疫、蓝耳病、禽流感、猪瘟、狂犬病等动物疾病疫苗都纳入了国家强制性免疫计划。另外，科技部和发改委在“863”计划、重大新药创制国家重大科技专项、国家科技支撑等计划中，对疫苗的研究开发与产业化都做出了重点安排和支持。

中国具有人口优势，经济也在迅猛的增长，农牧副业也保持良好的发展势头。谁能掌握和应用不断发展创新的疫苗生产技术，谁才能在市场中脱颖而出并持续发展。这就需要国内生物制药企业要加强在疫苗生产关键技术的创新和应用，比如使用适合疫苗生产的个性化培养基，严格控制原材料的品质；升级自身的疫苗生产工艺，采用先进的反应器悬浮培养细胞工艺，提高生产效率，增强生物制品的安全性和有效性。

本文将从疫苗生产过程的关键生产技术——反应器培养动物细胞技术在疫苗生产中

的发展历史、应用现状、关键技术因素及未来发展等内容做一综述。

反应器细胞培养技术的发展及趋势

1962年Capstile成功地大规模悬浮培养BHK21细胞，以及1967年Van Wezel成功应用微载体培养贴壁动物细胞，标志着反应器培养动物细胞技术的起步[1]。20世纪70年代起，2000－5000L的反应器悬浮培养BHK21细胞开始应用于口蹄疫疫苗的生产中。进入80和90年代，在细胞融合技术和基因工程技术等生物技术发展的基础上，抗体药物迅速发展，极大地推进反应器细胞培养技术在生物制药中应用。2008年，抗体类药物的年销售额将达到200亿美元，占生物技术药物市场的1/3，上万升的动物细胞反应器培养规模和先进的流加培养工艺技术的应用都首先是在抗体生产中获得突破。目前，2000L－10000L生物反应器在生物制药中的应用已非常普遍，单抗生产的反应器规模已经达到20000L－25000L。2006年，全球生产型动物细胞培养反应器的总规模为197万升，动物细胞培养反应器体积还在不断增加：瑞士龙沙、葛兰素史克等生物大公司都分别在新加坡建设上万升的动物细胞反应器生产线。有关资料预计，全球生物制药行业的生物反应器使用率将从2005年的60% 增长到2011年的85%。随着生物反应器在生物制药中的广泛应用，反应器细胞培养技术也变得更为成熟，包括流加培养技术、灌注培养技术、细胞代谢分析技术、细胞密度在线检测技术、低血清细胞培养技术及无血清细胞培养基的应用等[2]。

反应器细胞培养技术是以反应器悬浮培养动物细胞生产或研制生物制品的一种通用的平台技术，可广泛地用于生产单抗、人用疫苗或者兽药疫苗等生物制品。国内人用和兽用疫苗生产企业有100多家，但只有5家左右企业是采用反应器细胞培养技术生产疫苗，如辽宁成大和广州诺诚分别采用30L和14L进口反应器生产人狂犬病疫苗、南京梅里亚300L反应器生产禽苗，金宇集团650L/1200L国产CLA VORUS TM反应器生产口蹄疫疫苗。其他超过95%的疫苗企业生产仍然采用批量小、效率低、劳动强度大、占用场地多的转瓶机，生产应用的细胞培养基是50年代开发的MEM、DMEM、199、PRMI1640等基础培养基，血清添加比例10％左右，细胞培养和病毒生产效率低。其中的部分疫苗生产企业已感觉到反应器细胞培养技术是个重要的发展趋势，开始重视和研发反应器细胞培养技术，但基本处于研发阶段，距离产业化的反应器生产工艺尚有较大差距。我国的治疗性抗体总体上处于起步阶段，所用的无血清培养基和生物反应器均进口为主，比如北京百泰和上海中信国健等。

从当前动物细胞大规模培养的发展趋势来看，反应器悬浮培养动物细胞技术、无血清培养技术等是当前世界范围内各大生物公司产业化生产疫苗等生物制品的首要选择和发展

方向。反应器悬浮培养细胞、无血清培养在大规模疫苗生产中能提高单位制品产量、细胞高密度培养及表达、简化生产工艺、降低生产成本、保证大规模生产的制品质量等方面都起到非常重要的作用，是目前世界各大生物公司竞相开发的前沿课题。美国FDA和我国SFDA都鼓励和要求各生物公司建立起规模化、自动化的疫苗生产技术平台，从而提高和保证疫苗质量。

因为疫苗产品的竞争实质是不同企业在其核心技术基础上的疫苗质量之争，谁在未来掌握了反应器疫苗生产工艺技术以及生产平台，提高了效力和安全性等疫苗质量，谁将会下一轮行业发展中掌握市场主动权。

动物细胞培养反应器是关键设备

疫苗生产过程中应用到的动物细胞基质主要分为两类：贴壁培养型细胞和悬浮培养型细胞，并且以贴壁培养型细胞为主，比如Vero等传代细胞和2BS、KMB17等二倍体细胞。悬浮培养型细胞也是从贴壁培养型细胞发展而来的，经过细胞在悬浮培养基中的驯化或筛选，适应于悬浮培养环境，比如BHK21细胞、CHO细胞等。根据细胞的特点，反应器细胞培养也分为两种：悬浮培养和微载体悬浮培养。在动物细胞的培养过程中，细胞培养反应器是整个疫苗生产过程的关键设备，它要为细胞提供适宜的生长环境，决定着所培养细胞的质量和产量，影响着疫苗的生产效率和产品质量。

动物细胞与微生物细胞有很大不同，没有细胞壁，比较脆弱，对剪切敏感，因此，对体外培养环境的要求更为严格，传统的微生物反应器不能用于动物细胞的大规模培养。动物细胞培养用生物反应器应遵循一些基本原则：严密的结构实现反应器长期的无菌性要求、低剪切基础上良好的流体混合性实现高效的传质和传热要求、可靠的检测和控制系统具有良好的稳定性等。

细胞培养反应器可简单地分为机械搅拌式生物反应器、气升式生物反应器、中空纤维生物反应器以及抛弃式的一次性生物反应器等。目前，超过70％的动物细胞反应器是机械搅拌式生物反应器，而且细胞培养的最大规模已经放大到25000升。机械搅拌式生物反应器主要由罐体、电机和电子控制器等部分组成。实验室研究用的台式反应器（Bench bioreactor），罐体一般是玻璃的，疫苗或者抗体等工业化应用的罐体则由是不锈钢制造的。搅拌由顶端或底部的电机来驱动，能获得良好的混合和传质效果。罐体顶端或侧面的在线传感器，连接着控制器，可以连续测定罐体培养液的温度、pH值、溶氧（dissolve oxygen，DO）等参数，并通过计算机程序实现在线检测和控制。对于几升的玻璃罐，可以用高压锅灭菌；对于几十