大麦叶绿体基因RNA编辑位点的预测与鉴定

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大麦DUF668家族基因鉴定及表达分析

麦类作物学报 2024,44(2):158-168J o u r n a l o fT r i t i c e a eC r o ps d o i :10.7606/j.i s s n .1009-1041.2024.02.03网络出版时间:2023-12-13网络出版地址:h t t ps ://l i n k .c n k i .n e t /u r l i d /61.1359.s .20231212.1500.010大麦D U F 668家族基因鉴定及表达分析收稿日期:2023-01-23 修回日期:2023-07-04基金项目:国家自然科学基金面上项目(32272159);国家重点研发计划项目(2019Y F D 1005002-03-04)第一作者E -m a i l :799148942@q q .c o m (王月雪)通讯作者E -m a i l :z yh b o b @163.c o m (赵彦宏)王月雪1,母景娇1,王孜逸2,耿梓瀚1,倪守飞1,刘梦迪1,蔡倩2,赵彦宏1,王艳芳2(1.鲁东大学农学院,山东烟台264025;2.鲁东大学生命科学学院,山东烟台264025)摘要:D U F 668家族基因对植物逆境胁迫响应有重要作用㊂为探讨大麦D U F 668家族基因的结构及表达模式,采用生物信息学的方法对大麦D U F 668基因结构㊁蛋白结构㊁系统进化树㊁共线性及表达模式进行了分析㊂结果显示,供试大麦中共鉴定出9个D U F 668基因,分布在5条染色体上㊂系统发育进化树将9个D U F 668基因分为三个亚组,第Ⅰ亚组包括H v D U F 668-01㊁H v D U F 668-02和H v D U F 668-09,内含子数量较多,均有11个内含子;第Ⅲ亚组包括H v D U F 668-04㊁H v D U F 668-05㊁H v D U F 668-07和H v D U F 668-08,内含子数0~3个,其中H v D U F 668-04与H v D U F 668-05没有内含子;第Ⅱ亚组包括H v D U F 668-03和H v D U F 668-06,内含子数量(9和7)介于第Ⅰ亚组和第Ⅲ亚组之间㊂蛋白保守基序分析表明,9个蛋白均含有D U F 668保守结构域的特征序列及D U F 3475保守结构域的特征序列(H v D U F 668-06除外);第Ⅰ亚组蛋白的M o t i f 数量(8~10个)比第Ⅱ㊁Ⅲ亚组(4~6个)多,且包含第Ⅱ㊁Ⅲ亚组中的所有M o t i f ㊂表达谱分析表明,不同D U F 668基因在不同组织和发育时期的表达量存在差异,H v D U F 668-09在颖果中的表达量随着颖果的发育而升高,而H v D U F 668-01和H v D U F 668-02则相反;H v D U F 668-01和H v D U F 668-02在花序中的表达量随着花序的发育而升高㊂q R T -P C R 结果显示,受黄矮病病毒侵染大麦幼苗与未受侵染幼苗相比,H v D U F 668-04㊁H v D U F 668-05和H v D U F 668-08表达量提高了100~180倍㊂关键词:大麦;D U F 668家族基因;生物信息学;逆境胁迫;表达模式分析中图分类号:S 512.3;S 330 文献标识码:A 文章编号:1009-1041(2024)02-0158-11I d e n t i f i c a t i o na n dE x p r e s s i o nP r o f i l e s o fD U F 668G e n eF a m i l y i nB a r l e yW A N GY u e x u e 1,M UJ i n g j i a o 1,W A N GZ i y i 2,G E N GZ i h a n 1,N I S h o u f e i 1,L I U M e n g d i 1,C A I Q i a n 2,Z H A OY a n h o n g 1,W A N GY a n f a n g2(1.C o l l e g e o fA g r i c u l t u r e ,L u d o n g U n i v e r s i t y ,Y a n t a i ,S h a n d o n g 264025,C h i n a ;2.C o l l e g e o fL i f e s c i e n c e ,L u d o n g U n i v e r s i t y,Y a n t a i ,S h a n d o n g 264025,C h i n a )A b s t r a c t :T h eD U F 668g e n e f a m i l yp l a y sa n i m p o r t a n t r o l e i n p l a n t s t r e s s r e s po n s e .I no r d e r t oe x -p l o r e t h e g e n e s t r u c t u r e a n d e x p r e s s i o n p a t t e r no f b a r l e y D U F 668g e n e f a m i l y ,w e a n a l yz e d t h e g e n e s t r u c t u r e ,p r o t e i n s t r u c t u r e ,p h y l o g e n e t i c t r e e ,c o l l i n e a r i t y a n d e x p r e s s i o n p a t t e r no f b a r l e y D U F 668g e n e f a m i l y b y bi o i n f o r m a t i c s .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t n i n eD U F 668g e n e sw e r e i d e n t i f i e d ,d i s t r i b u -t e do n f i v e c h r o m o s o m e s .T h e n i n eD U F 668g e n e sw e r e d i v i d e d i n t o t h r e e s u b g r o u p s b yp h y l o ge n e t i c t r e e .S u b g r o u p Ic o n t a i n ed H v D U F 668-01,H v D U F 668-02a n d H v D U F 668-09w i t h11i n t r o n s ,w h i le s u b g r o u p Ⅲco n t a i n e d H v D U F 669-04,H v D U F 668-05,H v D U F 668-07a n d H v D U F 668-08,w i t ht h e l e a s t i n t r o n s ,a m o n g w h i c h H v D U F 668-04a n d H v D U F 668-05h a dn o i n t r o n s ;s u b g r o u p Ⅱco n t a i n e d H v D U F 668-03a n d H v D U F 668-06,w i t h i n t r o n s b e t w e e n s u b g r o u p Ⅰa n d s u b g r o u p Ⅲ.P r o t e i n c o n -s e r v e dm o t i f a n a l y s i s s h o w e d t h a t a l l p r o t e i n s c o n t a i n e d t h e c h a r a c t e r i s t i c s e qu e n c e so fD U F 668c o n -s e r v e dd o m a i na n dD U F3475c o n s e r v e dd o m a i n(e x c e p t f o rH v D U F668-06).T h en u m b e ro fm o t i f i n s u b g r o u pⅠ(8-10)w a sm o r e t h a n t h a t i n s u b g r o u pⅡa n dⅢ(4-6),a n d t h em o t i f s o f s u b g r o u pⅡa n dⅢw e r e a l s o c o n t a i n e d i n s u b g r o u pⅠ.E x p r e s s i o n p r o f i l e a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e e x p r e s s i o no f d i f f e r e n tD U F668g e n e sw a s d i f f e r e n t i nd i f f e r e n t t i s s u e s a n dd e v e l o p m e n t a l s t a g e s.T h e e x p r e s s i o n o f H v D U F668-09i nc a r y o p s i si n c r e a s e d w i t ht h ed e v e l o p m e n to fc a r y o p s i s,w h i l et h ee x p r e s s i o no f H v D U F668-01a n d H v D U F668-02i n c r e a s e d w i t ht h ed e v e l o p m e n to f i n f l o r e s c e n c e.T h er e s u l t so f q R T-P C Rs h o w e d t h a t t h e e x p r e s s i o n l e v e l so f H v D U F668-04,H v D U F668-05a n d H v D U F668-08i n b a r l e y s e e d l i n g s i n f e c t e d b y y e l l o wd w a r f v i r u sw e r e i n c r e a s e d b y100-180t i m e s c o m p a r e dw i t h t h o s e o f s e e d l i n g sw i t h o u t y e l l o wd w a r f v i r u s i n f e c t i o n.K e y w o r d s:B a r l e y;D U F668g e n e f a m i l y;B i o i n f o r m a t i c s;S t r e s s;E x p r e s s i o n p r o f i l e a n a l y s i sD U F(d o m a i no fu n k n o w nf u n c t i o n)家族是一大类含有未知功能的超基因家族总称[1-2]㊂随着研究的深入,D U F家族的数量迅速增加,截至2021年,整个家族已扩展至D U F3598[3]㊂大部分D U F基因被认为与非生物胁迫有关[4-9]㊂D U F668是其中一类高度保守的植物特异性的转录因子[10],其特征是包含29个氨基酸的保守结构域,在植物抗逆与抗病的过程中发挥着重要作用[11]㊂该结构域最初在拟南芥中发现,位于拟南芥P S I蛋白的C-末端,P S I蛋白具有促进植物生长的作用[12]㊂Z h o n g等[10]研究了拟南芥和8种禾本科代表作物(103个)的D U F668家族基因,发现其对抗旱和生物防御至关重要㊂Z h a o等[11]研究结果显示,D U F668家族基因可增加棉花抗逆性㊂D U F668家族蛋白的重要特征是其中一个亚组包含A v r9/C f-9;C f-9是一种通过识别A v r 多肽而产生特种抗性的蛋白质,而两者相互识别成为C f/A v r互作体系中的一种[10,13]㊂A v r9/C f-9对病原体入侵的识别被作为分析植物防御反应信号通路的典型模型系统[14]㊂研究显示,A v r9/ C f-9有助于水稻提高对伤口及稻瘟病的防御能力[10],有助于棉花提高抗寒性及抗黄萎病的能力[10-11]㊂大麦是世界第四大重要的谷物,也是世界上最早驯化作物之一,不仅是重要的粮食和饲料作物,也是有价值的二倍体模式谷物[15]㊂大麦生长发育过程中面临着很多逆境胁迫[15-18]及病虫害[19-21],而有关D U F668家族在大麦中的进化㊁功能和分类尚未得到系统研究㊂本研究拟系统鉴定大麦D U F668家族的成员,并利用生物信息学的方法对鉴定到的成员进行染色体分布㊁基因结构㊁顺式作用元件等分析,以揭示其可能的生物学功能,为大麦抗逆育种提供参考㊂1材料与方法1.1大麦D U F668家族成员的鉴定及定位从E n s e m b l P l a n t数据库(h t t p://p l a n t s.e n-s e m b l.o r g/i n d e x.h t m l)和U n i P r o t数据库(h t-t p s://w w w.u n i p r o t.o r g/)中下载大麦蛋白序列㊂从P f a m数据库(h t t p://p f a m.x f a m.o r g/)获取D U F668蛋白特征文件(P F05003)㊂利用HMM E R3软件(h t t p://w w w.h mm e r.o r g/)扫描大麦蛋白序列并预测候选的D U F668蛋白;通过S MA R T软件(h t t p://s m a r t.e m b l-h e i d e l-b e r g.d e/)对候选的D U F668蛋白进行鉴定㊂从P h y t o z o m e数据库(h t t p s://p h y t o z o m e. j g i.d o e.g o v/p z/p o r t a l.h t m l)获取大麦D U F668基因在染色体上的位置信息,通过MG2C软件(h t t p://m g2c.i a s k.i n/m g2c_v2.1/)绘制染色体位置图;利用C e l l-P l o c2.0(h t t p://w w w.c s b i o. s j t u.e d u.c n/b i o i n f/C e l l-P L o c-2/)进行蛋白亚细胞定位㊂1.2蛋白结构及基因结构分析利用P r o t P a r a m(h t t p s://w e b.e x p a s y.o r g/ p r o t p a r a m/)预测蛋白的基本理化性质;通过S O P MA(h t t p s://n p s a-p r a b i.i b c p.f r/c g i-b i n/ n p s a_a u t o m a t.p l?p a g e=n p s a_s o p m a.h t m l)预测蛋白的二级结构;使用S W I S S-MO D E L(h t-t p s://s w i s s m o d e l.e x p a s y.o r g/i n t e r a c t i v e)预测蛋白的三级结构;通过T MHMM工具(h t t p s:// s e r v i c e s.h e a l t h t e c h.d t u.d k/s e r v i c e.p h p?T M-HMM-2.0)预测蛋白跨膜结构域㊂利用G S D S(h t t p://g s d s.c b i.p k u e d u.c n/)绘制基因结构图;利用M E M E(h t t p://m e m e s u-i t e.o r g/t o o l s/m e m e)绘制蛋白保守基序图(M o-t i f最大数值设定为10),利用G E N E D O C软件进㊃951㊃第2期王月雪等:大麦D U F668家族基因鉴定及表达分析行保守序列分析㊂1.3顺式作用元件、进化与共线性分析使用P l a n t C A R E(h t t p://b i o i n f o r m a t i c s. p s b.u g e n t.b e/w e b t o o l s/p l a n t c a r e/h t m l/)预测基因启动区域的顺式作用元件并绘制其分布图谱㊂利用M E G A-X软件[22]进行D U F668蛋白的多序列比对,并采用邻接法(N e i g h b o r-j o i n i n g, N J)构建系统发育进化树㊂利用T B t o o l s[23]分别对大麦与玉米㊁大麦与水稻之间的D U F668基因进行共线性分析㊂1.4大麦D U F668基因在不同组织的表达分析从E x p r e s s i o nA l t a s数据库(h t t p s://w w w.e b i.a c.u k/g x a/e x p e r i m e n t s)下载大麦R N A-S e q 转录组数据(E-MT A B-2809),该套数据包含了大麦的根㊁花序1c m㊁花序5c m㊁节间㊁颖果15d㊁颖果5d㊁幼苗和胚芽共8个组织的基因表达信息;从该转录组数据中获取大麦D U F668基因的F P-KM值,并使用T B t o o l s软件绘制大麦D U F668基因的表达热图㊂1.5大麦D U F668基因在不同胁迫下的表达分析试验材料为抗大麦黄矮病品种M o r e x和感病品种A t l a s68㊂将大麦M o r e x种子平铺于平板上浸湿的纱布表面,保持纱布湿润,待种子萌发露白后转移至水培盒进行温室培养,温室条件为昼26ħ/夜23ħ,光照周期为16h光照/8h黑暗;用霍格兰营养液配置100μm o l㊃L-1M e J A㊁100μm o l㊃L-1P E G6000,以营养液为对照;将温室培养7d的大麦分别移至750m L上述溶液中,其中营养液培养分为两组,一组暗处理,一组正常温室培养;不同处理12h㊁24h㊁48h后,取幼苗地上部30m g,于-80ħ保存待用㊂每个处理3次重复㊂将大麦A t l a s68种子分两组播种于花盆中,并放置在温室培养,温室条件同上;大麦出苗15d 后,用不少于20只携带黄矮病毒的蚜虫对其中一组幼苗进行侵染,用同样数量的无毒蚜虫接在另一组大麦幼苗上,作为对照组;蚜虫取食2d后灭蚜,灭蚜后第6天取其地上部分叶片30m g,3次重复,并于-80ħ保存备用㊂用R N Ai s o l a t e rT o t a lR N A E x t r a c t i o nR e-a g e n t(R401-01,诺唯赞)参照使用说明书提取不同处理大麦叶片(-80ħ保存)总R N A㊂使用超微量核酸蛋白测定仪(D e N o v i x,D S-11)测定R N A提取浓度㊂利用试剂盒H i S c r i p tI I1s t S t r a n dc D N A S y n t h e s i s K i t(+g D N A w i p e r)(R212-02,诺唯赞)参照说明书合成c D N A㊂利用P r i m e r3在线软件(h t t p s://p r i m e r3.u t.e e/)设计大麦D U F668基因的q R T-P C R引物,以H v A c t i n基因作为内参,引物由上海生工生物工程有限公司合成㊂使用实时荧光定量试剂盒B i o E a s y M a s t e rM i xS Y B R G r e e n(艾科瑞)参照说明书在A B I7500荧光定量P C R仪中进行基因扩增;扩增条件为95ħ15s,60ħ15s,72ħ30s,39个循环;每个样品3次重复㊂采用2-ΔΔC t 方法计算基因的相对表达量㊂2结果与分析2.1大麦D U F668家族成员的鉴定结果及分析利用HMM E R从大麦中鉴定到9个D U F668基因,其长度为1187~11490b p,对应的C D S长度为888~2007b p;根据其在染色体上的位置分别命名为H v D U F668-01~ H v D U F668-09(表1)㊂9个基因不均匀地分布在大麦的5条染色体上(图1),在C h r5H上最多(4个),在C h r2H和C h r6H上没有检测到;H v D U F668基因在染色体上分布较为分散,没有成簇分布现象㊂这与水稻和棉花的D U F668基因在染色体上的分布特征类似[10-11]㊂9个大麦D U F668蛋白质长度为475~680a a,相对分子量为34.1~74.2k D,等电点(p I)为7.4~9.0,亲水指数(G R A V Y)均为负数,表明大麦D U F668蛋白均为亲水性碱性蛋白(p I>7),但亲水程度有差异(表2)㊂大部分蛋白的二级结构表现为α-螺旋>无规则卷曲>β-折叠>β-转角,只有H v D U F668-06蛋白的二级结构表现为α-螺旋>无规则卷曲>β-转角>β-折叠;9个蛋白的α-螺旋和无规则卷曲占比之和均大于90%㊂H v D U F668蛋白的三级结构呈现出一定的规律性,同一亚组有较大的相似性,不同亚组间有一定差别(图2)㊂跨膜结构域预测结果显示,9个H v D U F668蛋白均不含跨膜结构域,暗示H v D U F668蛋白合成后不会经历跨膜运输㊂亚细胞定位预测结果显示,9个蛋白均定位于细胞核中㊂2.2基因结构及蛋白保守基序分析根据进化树,9个H v D U F668基因被划分为3个亚组,第Ⅰ亚组包括H v D U F668-01㊁H v D U F-668-02和H v D U F668-09共3个基因,其内含子数量较多,均有11个;第Ⅱ亚组包含H v D U F668-03㊃061㊃麦类作物学报第44卷和H v D U F 668-06基因,分别有9和7个内含子;第Ⅲ亚组包含H v D U F 668-04㊁H v D U F 668-05㊁H v D U F -668-07和H v D U F 668-08共4个基因,内含子数依次为0㊁0㊁2和3(图3)㊂由此可看出,不同亚组间的H v D U F 668基因内含子数存在明显差异㊂这与棉花D U F 668家族基因类似[11]㊂第Ⅰ亚组H v D U F 668表1 大麦D U F 668基因的染色体定位及序列信息T a b l e 1 C h r o m o s o m a l l o c a l i z a t i o no f b a r l e y DU F 668g e n e s 基因名G e n e n a m e基因I DG e n e I D位置P o s i t i o n长度L e n g t h /b pC D S /b p 亚组S u b g r o u pH v D U F 668401H O R V U 1H r 1G 074410C h r 1H :507969852~507980221:+6561938ⅠH v D U F 668-02H O R V U 3H r 1G 082170C h r 3H :598203067~598214558:-6802007ⅠH v D U F 668-03H O R V U 4H r 1G 018430C h r 4H :84574590~84578912:-6751992ⅡH v D U F 668-04H O R V U 4H r 1G 060260C h r 4H :505089218~505091246:-4751404ⅢH v D U F 668-05H O R V U 5H r 1G 041250C h r 5H :311355148~311357153:+5551638ⅢH v D U F 668-06H O R V U 5H r 1G 077430C h r 5H :553244801~553250995:-3021569ⅡH v D U F 668-07H O R V U 5H r 1G 112000C h r 5H :637875117~637876304:+563888ⅢH v D U F 668-08H O R V U 5H r 1G 124940C h r 5H :667585479~667589994:+4961461ⅢH v D U F 668-09H O R V U 7H r 1G 116880C h r 7H :644288248~644294274:+6331869Ⅰ+:前导链;-:滞后链㊂+:L e a d i n g s t r a n d ;-:L a g g i n g st r a n d .表2 大麦D U F 668蛋白的基本理化性质T a b l e 2 S e q u e n c e f e a t u r e s a n d p h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f t h eD U F 668p r o t e i n s i nb a r l e y蛋白名称P r o t e i nn a m e蛋白I DP r o t e i n I D 长度L e n g t h /a a 分子量MW /k D 等电点P I 亲水指数G R A V Y α-螺旋α-h e l i x β-折叠β-s h e e t β-转角β-a n g l e 卷曲C o i l定位L o c a t i o n H v D U F 668-01M 0Y V S 164572.47.4-0.5250.54.502.842.2N u c l e u sH v D U F 668-02A 0A 287L Y 8651774.19.2-0.6850.34.792.442.5N u c l e u s H v D U F 668-03A 0A 287N F 5666374.29.3-0.5548.77.394.239.7N u c l e u s H v D U F 668-04F 2C Z T 146751.49.9-0.3362.33.002.432.3N u c l e u s H v D U F 668-05A 0A 287RW 7235959.79.6-0.2656.04.771.737.6N u c l e u s H v D U F 668-06A 0A 287RW 0530234.18.5-0.2968.20.662.728.5N u c l e u s H v D U F 668-07A 0A 287RW 2536461.68.5-0.2753.87.102.336.8N u c l e u s H v D U F 668-08M 0X 41251752.110.6-0.2663.26.161.429.2N u c l e u s H v D U F 668-09A 0A 287X X Z 762269.78.7-0.7051.14.662.342.0N u c l e us 图1 大麦H v D U F 668在染色体上的位置F i g .1 C h r o m o s o m e l o c a t i o n s o f b a r l e y Hv D U F 668g e n s ㊃161㊃第2期王月雪等:大麦D U F 668家族基因鉴定及表达分析图2 9个大麦D U F 668蛋白的三级结构图F i g .2 T e r t i a r ys t r u c t u r e s o f t h e n i n e D U F 668p r o t e i n s i nb a r l e y基因较长,其中H v D U F 668-02最长(大于11k b );第Ⅲ亚组的基因较短,其中H v D U F 668-07最短(介于1k b ~2k b )㊂9个H v D U F 668基因内含子的长度差别较大,第Ⅲ亚组基因的内含子较短㊂内含子数量越多,基因形成剪接体的潜在能力越高,推测第Ⅰ亚组H v D U F 668基因形成剪接体的能力强于其它两个亚组㊂蛋白保守基序分析结果(图4)显示,9个H v D U F 668蛋白中共鉴定出10个保守的M o t i f ㊂所有成员均包含M o t i f 1与M o t i f 5,其中M o t i f 1包含D U F 668家族的典型特征保守结构域(29个氨基酸),M o t i f 5则包含D U F 3475家族保守结构域;推测这两个M o t i f 对大麦H v D U F 668的功能至关重要㊂第Ⅰ亚组的H v D U F 668蛋白(H v D U F 668-01㊁H v D U F 668-02㊁H v D U F 668-09)都包含10个M o t i f,且具有相同的排列顺序㊂第Ⅲ亚组H v D U F 668蛋白共包含6个M o t i f ,其中5个M o t i f (M o t i f 1㊁M o t i f 6㊁M o t i f 3㊁M o t i f 5和M o t i f 7)是该亚组所有蛋白共有的,且排列顺序基本一致;M o t i f 2仅在H v D U F 668-07和H v D U F 668-05检测到㊂第Ⅱ亚组的H v D U F 668-03蛋白具有8个M o t i f ,而H v D U F 668-06蛋白则具有最少的M o t i f (4个)㊂总的来看,3个亚组均含有M o t i f 4㊁M o t i f2㊁M o t i f 6和M o t i f 1;不同亚组间的M o t i f 组成存在差异,推测同一亚组大麦H v D U F 668蛋白具有相似功能,不同亚组的H v D U F 668则存在功能差异㊂2.3 进化分析及共线性分析将拟南芥(A r a b i d o ps i st h a l i a n a )㊁亚洲棉(G o s s y p i u ma r b o r e u m )㊁玉米(Z e a m a ys )㊁水稻(O r y z a s a t i v a )㊁野生稻(O r y z ar u f i p o g p o n )㊁二穗短柄草(B r a c h y p o d i u m d i s t a c h yo n )和大麦(H o r d e u mv u l ga r e )的D U F 668蛋白序列(共83条)进行比对,并构建系统进化树(图5)㊂结果发现,83条蛋白被分为3个亚族(Ⅰ亚族㊁Ⅱ亚族㊁Ⅲ亚族)㊂其中,第Ⅱ亚族仅存在于单子叶植物,推测这一亚族是单子叶植物单独分化而来,或者在进化过程中双子叶植物丢失了这一亚族;第Ⅰ亚族与第Ⅲ亚族均含有单㊁双子叶植物,推测其起源于共同祖先,且D U F 668是高度保守的基因家族㊂大麦9个D U F 668蛋白中有7个相邻分支均是二穗短柄草,说明相比其它物种,大麦与二穗短柄草的亲缘关系更近㊂共线性分析结果(图6)显示,大麦与水稻D U F 668基因有6对共线性基因对,大麦与玉米D U F 668基因有3对共线性基因对,大麦与拟南芥没有共线性基因对㊂这说明大麦与同属于单子叶禾本科的水稻的亲缘关系比属于双子叶植物的拟南芥更近;大麦与水稻的亲缘关系近于玉米㊂共线性基因对往往具有相同或高度相似的功能,推测大麦与水稻之间的6对共线性D U F 668基因具有相似功能㊂图3 大麦D U F 668基因结构分析F i g .3G e n e s t r u c t u r e a n a l y s i s o f b a r l e y DU F 668㊃261㊃麦类作物学报第44卷图4 大麦D U F 668蛋白保守结构域与蛋白基序分析F i g .4 A n a l y s i s o f t h e c o n s e r v e dd o m a i n s a n dm o t i f s o fD U F 668i nb a r l ey图5 D U F 668家族基因的多物种进化树F i g .5 P h y l o g e n e t i c t r e e o fD U F 668g e n e f a m i l y i nm u l t i -s pe c i e s 图6 大麦与水稻和玉米D U F 668家族基因的共线性分析F i g .6 C o l l i n e a r i t y a n a l y s i sD U F 668g e n e f a m i l y i nb a r l e y ,r i c e a n d s o yb e a n ㊃361㊃第2期王月雪等:大麦D U F 668家族基因鉴定及表达分析2.4 大麦D U F 668基因顺式作用元件分析利用P l a n t C A R E 软件从大麦H v D U F 688基因上游的启动区(起始密码子上2000b p)进行顺式作用元件预测分析,结果发现,9个大麦H v D U F 668基因的上游启动区中共存在266个顺式作用元件㊂根据功能将其分为4种类型:植物生长,胁迫响应,植物激素响应和光响应(表3和图7)㊂其中,参与植物激素响应的顺式作用元件数量最多,主要包括茉莉酸甲酯㊁脱落酸㊁生长素㊁赤霉素和水杨酸等响应元件;其次是光响应顺式作用元件,包括A A A 基序(光响应元件)和A E -b o x(光响应模块的一部分)等;植物生长类中鉴定出C A T -b o x (分生组织表达)和O 2位点(参与玉米醇溶蛋白代谢调节)等多个作用元件;胁迫响应原件有M B A ㊁C C A A T -b o x 等㊂4个类型中,激素响应元件和光响应元件的数量较大,分别为99和86个,推测H v D U F 668在大麦对激素响应中发挥重要的作用,并且其基因的转录可能受光周期的调控;逆境胁迫的响应元件含有57个,暗示该家族基因在大麦面对逆境胁迫时发挥了重要的作用;植物生长的响应元件数量最少(37个),证明该家族基因在大麦的生长过程中也有一定的作用㊂表3 H v D U F 668基因的顺式作用元件T a b l e 3 C l a s s i f i c a t i o no f c i s -a c t i n g r e g u l a t o r y e l e m e n t s i nb a r l e y Hv D U F 668g e n e s 类型T y pe 顺式作用元件C i s -e l e m e n t光响应元件L i g h t r e s p o n s e e l e m e n t A C E ㊁S p1㊁A T C T -m o t i f ㊁G -b o x ㊁B o x4㊁G T 1-m o t i f ㊁T C T -m o t i f ㊁A E -b o x ㊁A A A C -m o t i f ㊁A T 1-m o t i f ㊁G A -m o t i f ㊁T C C C -m o t i f ㊁B o x Ⅱ㊁c h s -C MA 2a 和G A T A -m o t i f激素响应元件H o r m o n e r e s po n s e e l e m e n t A B R E ㊁A T -A B R E ㊁G A R E -m o t i f ㊁P -b o x ㊁C G T C A -m o t i f ㊁T G A C G -m o t i f ㊁T G A -e l e m e n t㊁A u x R R -c o r e 和T C A -e l e m e n t 植物生长响应元件P l a n tG r o w t he l e m e n tO 2-s i t e ㊁C A T -b o x ㊁R Y -e l e m e n t ㊁G C N 4-m o t i f ㊁M S A -l i k e ㊁c i r c a d i a n ㊁A -b o x 和H D -Z i p 1胁迫响应元件S t r e s s r e s po n s e e l e m e n t M B A ㊁C C A A T -b o x ㊁W b o x ㊁WU N -m o t i f ㊁G C -m o t i f ㊁A R E ㊁L T R 和T C -r i c h r e pe a ts 图7 大麦D U F 668家族基因的顺式作用元件分析F i g .7 A n a l y s i s o f c i s -a c t i n g e l e m e n t s o f b a r l e y D U F 668g e n e f a m i l y2.5 大麦D U F 668家族基因在不同组织中的表达分析研究基因的时空表达模式有助于了解基因潜在的功能[24]㊂对大麦D U F 668基因在8个不同组织中的表达量进行分析,结果(图8)显示,H v D U F 668-01与H v D U F 668-02基因在这8个组织中均有非常高的表达量,暗示这2个基因对大麦生长发育有重要的作用;H v D U F 668-07基因在这8个组织中表达量极低,甚至不表达;H v D U F 668-09㊁H v D U F 668-04与H v D U F 668-06基因在某些特定组织中表达量处于中等水平;H v D U F 668-03㊁H v D U F 668-05和H v D U F 668-08基因在这8个组织中表达量都相对较低㊂H v D U F 668-04㊁H v D U F 668-06和H v D U F 668-09基因在幼苗㊁根和节间的表达量明显高于其在花序与颖果等组织中的表达量;H v D U F 668-03基因则在颖果中的表达量明显高于其他组织,而且随着颖果的发育而增加;H v D U F 668-02和H v D U F 668-09基因在颖果中的表达量则是随着颖果的发育而降低㊂总的来看,H v D U F 668基因的表达具有明显的组织特异性,而且在不同的发育阶段其表达量也不同㊂除H v D U F 668-07基因外,其余8个基因在大麦被分析组织中都有表达,这进一步证实了H v D U F 668基因在大麦的生长发育等方面发挥着特定作用㊂㊃461㊃麦类作物学报第44卷图8 大麦H v D U F 668基因在不同组织中的表达量F i g .8 E x p r e s s i o no f b a r l e y Hv D U F 668g e n e s i nd i f f e r e n t t i s s u e s 2.6 大麦D U F 668家族基因在不同胁迫下的表达分析为了探索H v D U F 668基因在不同胁迫下的表达模式,用1种激素(M e J A )㊁2种环境胁迫(干旱㊁暗处理)以及1种生物胁迫(大麦黄矮病毒侵染)对大麦幼苗进行了处理,利用q R T -P C R 分析处理后不同时间H v D U F 668基因的相对表达量,引物序列如表4㊂结果(图9)显示,与C K 相比,胁迫处理12h 的大麦叶片中,有6个H v D U F 668基因表达发生显著变化;有3个H v D U F 668基因在病毒侵染后与未侵染相比表达显著增强㊂对照C K 中,随着时间推移,H v D U F 668-01㊁H v D U F 668-02和H v D U F 668-05的相对表达量先升高后降低,H v D U F 668-08的相对表达量先降低后升高,H v D U F 668-04的相对表达量降低,H v D U F 668-09的相对表达量升高㊂经M e J A 处理后,随着时间推移,H v D U F 668-01和H v D U F 668-09表达量先上升后降低,在24h 时表达量最高;H v D U F 668-02和H v D U F 668-05表达量先下降后上升;H v D U F 668-04和H v D U F 668-08表达量逐步上升,H v D U F 668-08表达量变化显著,48h 时较C K 增加40倍㊂推测该基因在激素表4 q R T -P C R 分析所用引物T a b l e 4 P r i m e r s u s e d i nR T -q P C Ra n a l ys i s 基因名称G e n en a m e上游引物(5'-3')F o r w a r d pr i m e r 下游引物(5'-3')R e v e r s e p r i m e rH v A c t i n C C A C G A G A C G A C C T A C A A C C A C T G A G C A C G A T G T T T C C H v D U F 668-01A G G C A T G A C A G A C A C A G C A G C A G A C C A T C A A G C C T G T C A A H v D U F 668-02A A G G C T C A T C A T G G T T T T G G G A T G C T G A A G C G A T A C G A C A H v D U F 668-04T A C G C G A A C G T G A T C T T G T C T C C T C T C A A C C T C T C C C T C A H v D U F 668-05G T G G A T G C T C G A A A G A G G T C A C T G G A A T C C T C G T T G T T G G H v D U F 668-08A G C A G G A C G T G A A G A A C C T C C C T C C A T C G A C A T G G A C T T T H v D U F 668-09T T G T A C C A T G G A C T G C C A G AC C A T G T C A C T C C C G A A G T T T㊃561㊃第2期王月雪等:大麦D U F 668家族基因鉴定及表达分析误差线表示标准误差;图柱上方*和**表示处理与C K间的相对表达量差异在0.05和0.01水平显著㊂T h e e r r o r b a r r e p r e s e n t s t h e s t a n d a r d e r r o r;*a n d**a b o v e c o l u m n sm e a n s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t r e a t m e n t sw i t hC Ka t 0.05a n d0.01l e v e l s,r e s p e c t i v e l y.图9不同胁迫下9个基因相对表达量分析F i g.9E x p r e s s i o n p r o f i l e a n a l y s i s o f t h e n i n e H v D U F668g e n e s i nb a r l e y u n d e r d i f f e r e n t s t r e s s e s响应中起着至关重要的作用㊂经P E G6000处理后,随着时间推移, H v D U F668-02表达量先降低后升高,H v D U F668-04呈上升趋势,但在48h表达量大幅度升高;H v D U F668-01和H v D U F668-08表达量逐渐上升,H v D U F668-08在48h时表达量最高;㊃661㊃麦类作物学报第44卷H v D U F668-09表达量先升高后降低,在24h表达量最高,较C K高10倍㊂推测这2个基因与干旱胁迫有关㊂经暗处理后,随着时间推移,H v D U F668-02和H v D U F668-05表达量呈降低趋势,H v D U F668-04的表达量在48h开始上升;H v D U F668-01与H v D U F668-08表达量升高,H v D U F668-01在24 h表达量最高,H v D U F668-08在12h时表达量较C K高30倍左右,推断该基因对光响应敏感程度较高,在光反应中可能起着关键的作用㊂前人研究发现,含有A v r9/C f-9的水稻具有抗病性[10]㊂系统进化分析中,发现H v D U F668-04㊁H v D U F668-05和H v D U F668-08与水稻含有A v r9/C f-9的基因同属于第Ⅲ亚族㊂因此对这3个H v D U F668基因进行黄矮病毒侵染,结果发现,H v D U F668-04㊁H v D U F668-05和H v D U F668-08表达量发生了显著变化,表达量较C K高100~180倍㊂说明这3个基因在大麦遭受黄矮病侵染时发挥重要作用,可能介导大麦的生物防御反应㊂3讨论D U F家族最初是一类功能未知的超基因家族,随着研究的深入,部分功能被发掘㊂本研究在全基因组和蛋白数据库的基础上,利用两种预测工具(HMME R㊁S MA R T)共同预测并鉴定出了9个大麦H v D U F668基因,这比单一软件预测结果会更可靠,但可能漏掉非典型大麦D U F668蛋白,是本研究的缺点㊂本研究基因结构分析发现,第Ⅲ亚组中的H v D U F668-04和H v D U F668-05基因没有内含子,第Ⅰ亚组最多,为11个,第Ⅱ亚组分别有7个和9个,这与水稻与棉花中基因结构相似[10-11]㊂对蛋白基序分析后发现,除大麦H v D U F668-06蛋白外,其他8个蛋白均含有2个高度保守的D U F668和D U F3475结构域,这与前人研究相似[10-11]㊂另外,本研究还在P f a m数据库中发现,该家族90%以上的成员中,这2个特征结构域是共存的(2148条蛋白序列中有1961条序列包含这2个特征结构域)㊂本研究还发现,D U F3475特征结构域均位于D U F668保守结构域的前面,在进化过程中这2个结构域的排列顺序高度保守,推测两者之间在功能上可能存在着一定的联系㊂本研究中,系统进化分析将大麦D U F668蛋白分为3个亚族㊂其他物种研究中,将其分为2个亚族[10-11]㊂不同亚族间的基因结构及基序排列都有一定差异㊂依据多物种系统进化树可知,第Ⅰ亚族与第Ⅲ亚族均含有单双子叶植物,推测D U F668家族基因起源于共同祖先,是一个高度保守的基因家族㊂研究发现,四倍体棉花品种比二倍体的棉花品种的D U F668家族成员多两倍,推测D U F668家族成员在物种中数量与几倍体相关㊂本研究材料大麦为二倍体植物,共鉴定出9个D U F668基因,与前人研究8种禾本科代表作物(103个)得出单子叶禾本科植物中D U F668家族成员数量相近[11]的结论一致㊂本研究在共线性分析中发现,大麦与拟南芥及棉花基因组间虽然存在着共线区块,但未发现共线性基因对(结果未给出);但在大麦与水稻间存在的共线性基因对中,发现1个大麦的H v D U F668基因对应2个O s D U F668基因,同时也有1个水稻O s D U F668基因对应2个大麦H v D U F668基因;在大麦和玉米间存在的共线性基因对中,存在1个大麦的H v D U F668对应3个玉米Z m D U F668基因的现象,这可能是由串联和片段复制驱动的基因扩增事件所导致的㊂在水稻中,许多具有高度相似序列的基因在染色体上以同源基因对的形式聚集[11],但在本研究大麦种内共线性分析中,鉴定出的9个基因之间并没有共线性关系㊂本研究对表达模式分析后发现,H v D U F668-01㊁H v D U F668-02和H v D U F668-09在8个组织中都表达,并且这3个基因均是高量表达,且同属于一个亚组㊂这在棉花中也出现了类似情况[11]㊂大麦H v D U F668-04㊁H v D U F668-05和H v D U F668-08在黄矮病病毒侵染下呈现高量表达,这3个大麦成员与水稻包含A v r9/C f-9的成员[10]同属一个亚族,推测这3个基因有助于提高大麦对病原菌的防御能力,也可能含有A v r9/C r-9,介导大麦的生物防御反应㊂有关此家族在大麦生长发育和抗胁迫反应中的具体功能及机制尚需更多研究㊂参考文献:[1]B A T E MA N A,C O G G I L LP,F I N N R D.D U F s:F a m i l i e s i n s e a r c ho f f u n c t i o n[J].A c t a C r y s t a l l o g r a p h i c a.S e c t i o n F, S t r u c t u r a l B i o l 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病原物

病原物-寄主互作中的转录图谱关键词：聚类分析，遗传基因组学，元分析，最低限度信息，微阵列，植物实体，信号转导级联反应摘要：使用基因组技术可以解决在整个发育过程或者生化途径背景下的的研究假设，基因网络，相关基因的染色体位置并且可以推断其进化史。

通过一系列的平台，研究者可以用多种试验和条件研究整个转录物组。

这些数据的诠释产生新的见解，并可以揭示之前没有描述过的现象。

在植物病菌相互作用的领域，转录图谱在以下给出了前所未有的见解：以基因对基因为基础的防御和基础防御的机制，寄主对非寄主，生物存活者与死亡者，维管与非维管病原体的致病性。

这样，基因组技术使广泛系统方法更加便与在寄主与病原体相互作中统一理论和独特特征。

引言通过多种试验和条件研究可以解决在整个发育过程或者生化途径背景下的研究假设。

根据全基因组序列，关于RNA快速积累的数据和蛋白表达模式使判断基因如何对复杂的表现型起作用成为可能。

转录图谱的遗传继承性可被用于绘制染色体的相关位置，调整其位置。

另外，基于已知作用的基因的表达模式，比较在模式生物中的基因表达网络和作物物种可被用于推断作用和进化史。

植物病理学中的热点包括以基因对基因为基础的防御和基础防御的机制，寄主对非寄主，生物存活者与死亡者，维管与非维管病原体的致病性。

已经阐述了不同的表达技术和在大规模生物学统计设计的重要性。

我们着重在关键的系统，比如怎样有效地利用转录图谱来促进在寄主-病原物方面的生物发现。

随着在公共数据库中大量的微阵列数据的增加，使用元-图谱方法作出结论建立多种实验，也很有益。

不同的实验设计和操作是公认的避免得到错误结论的前提。

在之前共数据中可以得到新的信息，不同的基因表达模式可用于包含几个试验的元分析的涉及的观点。

模式系统用于作物：不仅仅是只在拟南芥中平行表达图谱，曾经被认为仅仅在有基础结构的大的研究群体有用，现在认为可以用于小的群体和单独的实验室。

生物的多数微阵列平台通过商业和公共资源存在。

基因组学中的RNA编辑

基因组学中的RNA编辑近几年，随着科技的不断进步，基因组学已经成为研究热点之一。

在众多基因组学研究的领域中，RNA编辑技术无疑是备受关注的。

RNA编辑是一种重要的后转录修饰，它可以在转录后改变RNA序列中的碱基，形成新的RNA分子，从而产生新的蛋白质。

本文将详细探讨RNA编辑的定义、机制、方法、应用以及未来发展方向。

一、RNA编辑的定义在生物学中，RNA编辑是指一种基因表达的后转录修饰，通过改变RNA序列中的碱基类型来形成新的RNA分子。

RNA编辑的结果是RNA分子与基因组DNA不完全匹配，并且在转录后产生一系列新的蛋白质变体。

与DNA修饰不同的是，RNA编辑是在成熟的RNA分子上进行的，包括mRNA、tRNA和rRNA。

RNA编辑机制很复杂，涉及到多种蛋白质和辅酶的参与。

二、RNA编辑的机制RNA编辑的机制可以简单分为两类：腺嘌呤到肌苷（A-to-I）编辑和胸腺嘧啶到尿嘧啶（T-to-U）编辑。

其中，A-to-I编辑是最为常见的RNA编辑类型。

在A-to-I编辑过程中，腺嘌呤（A）被酰胺转移酶（ADAR）催化成为肌苷（I）。

ADAR家族是RNA编辑过程中最为重要的催化因子之一，它可以通过催化反应将A合成成I。

在生物体内，ADAR基因的表达量与腺嘌呤到肌苷编辑的发生密切相关。

在胸腺嘧啶到尿嘧啶编辑中，胸腺嘧啶（T）被脱甲基酶TDG催化成为尿嘧啶（U）。

由于T-to-U编辑是一种较为少见的编辑类型，其研究较为困难。

三、RNA编辑的方法RNA编辑技术是一种基因工程技术，需要一系列高难度的实验操作。

下面简单介绍一下RNA编辑的实验方法。

1.基于ADAR蛋白的克隆与其它蛋白质一样，ADAR蛋白的全长编码序列可以通过基因克隆的方式进行获得。

科学家可以将ADAR编码序列插入到外源性表达载体中，并使用转染的方式将表达载体导入到人类细胞系中，实现肌苷（I）的合成。

2.CRISPR/Cas9基因编辑技术CRISPR/Cas9基因编辑技术是当前最为常用的基因编辑技术之一。

实验五观察细胞中DNA和RNA的分布

人的口腔上皮细胞或蚕豆叶表皮洋葱表皮?大烧杯小烧杯温度计滴管消毒牙签载玻片盖玻片铁架台石棉网火柴酒精灯吸水纸显微镜?2质量分数为09的nacl溶液质量分数为08的盐酸吡罗红甲基绿染色剂取a液20mlb液80ml配成染色剂使用时现配
实验三观察DNA和RNA在细胞中的分布
原理：甲基绿和吡罗红两种染色剂对 DNA和RNA的亲和力不同，甲基绿使 DNA呈现绿色，吡罗红使RNA呈现红色。利用甲基绿和吡罗红混合染色剂将细胞染色，可以显示DNA和RNA在细胞中的分布。盐酸能够改变细胞膜的通透性，加速染色剂进入细胞，同时使染色体中的DNA与蛋白质分离，有利于DNA和染色剂结合。
洋葱表皮细胞

结论：通过各种动植物实验材料的观察，同学们观察到的结果非常相似，在细胞核部分被染成了绿色，而在细胞质部分被染成了红色。说明DNA主要分布在细胞核中，RNA主要分布在细胞质中。
注意事项

1.材料的选择 ① 选用的实验材料既要容易获得，又要便于观察； ② 常用的观察材料由人的口腔上皮细胞、洋葱鳞片叶表皮细胞(为避免原有颜色的干扰，不可使用紫色表皮细胞) 2.取材要点 ① 取口腔上皮细胞之前，应先漱口，以避免装片中出现太多的杂质； ② 取洋葱表皮细胞时，尽量避免材料上带有叶肉组织细胞。 3.冲洗载玻片时水的流速要尽量慢，切忌直接用水龙头冲洗。 4.安全要点 ① 用酒精灯烘烤载玻片时，不要只集中于材料处，而应将载玻片在火焰上来回移动，使载玻片均匀受热，以免破裂； ② 烘烤后的载玻片不要马上放入盛有稀盐酸的烧杯中，最好先自然冷却1分钟。 5.换用高倍镜观察材料时，只能用细准焦螺旋进行调焦，切不可动粗准焦螺旋。
Unna染色法：

Unna染色法： 1899年Pappenheim 首创了甲基绿-哌洛宁（mehtyl-green-pyronim）染色法。1902 年Unna对这一方法进行了改良。1940年 Brachet研究证明用甲基绿—哌洛宁对DNA和 RNA有选择性的染色效果。碱性的甲基绿-哌洛宁混合染料处理细胞后，由于DNA、RNA 对染料具有的亲和力不同，而使这两种染料对两类核酸具有了选择性。 DNA被甲基绿染成绿色，RNA被哌洛宁染成红色，这样就能使细胞中两种核酸分布显示出来。

215502050_基因编辑技术在植物启动子编辑中的研究进展

生物技术进展 2023 年第 13 卷第 3 期 321 ~ 328Current Biotechnology ISSN 2095‑2341进展评述Reviews基因编辑技术在植物启动子编辑中的研究进展盖思宇1§ ，陈子奇2§，夏涵超1 ，赵仁贵1* ，刘相国2*1.吉林农业大学农学院，长春 130118；2.吉林省农业科学院，长春 130119摘要：植物基因的表达决定了植物的表型特征，而基因的表达受启动子的直接调控。

启动子作为基因的一个组成部分，控制着基因表达(转录)的起始时间和表达程度。

利用基因编辑技术对启动子进行定向编辑之后，会因为基因序列特有的重组排列、顺式表达等因素使得植物中的某个或某些基因的表达模式发生改变，进而影响基因功能。

这些改变最终直接或间接地改变了植物的外在表型特征，而一些正向改变会对植物的品质起到优化和改良作用。

综合近几年基因编辑技术对启动子的研究，主要从启动子的构成与分类、基因编辑技术和启动子编辑的研究进展这3个方面对启动子的编辑在植物中的应用进行了概述和总结，以期为启动子编辑技术应用于植物改良提供参考。

关键词：基因编辑技术；启动子编辑；植物品质改良DOI ：10.19586/j.20952341.2023.0001 中图分类号：Q37 文献标志码：AResearch Progress of CRISPR/Cas9 Technology in Plant Promoter EditingGAI Siyu 1§， CHEN Ziqi 2§， XIA Hanchao 1 ， ZHAO Rengui 1* ， LIU Xiangguo 2*1.Faculty of Agronomy ，Jilin Agricultural University ，Changchun 130118，China ；2.Jilin Academy of Agricultural Sciences ，Changchun 130119，ChinaAbstract ：Plant gene expression determines plant phenotypic characteristics ， and gene expression is directly regulated by pro⁃moters. As a component of genes ， promoters control the initiation time and expression degree of gene expression （transcription ）. After directed editing of promoters by gene editing technology ， the expression pattern of one or some genes in plants would be changed due to the unique recombination and arrangement of gene sequences ， cis -expression and other factors ， thus affecting the function of genes. These changes ultimately directly or indirectly change the external phenotypic characteristics of plants ， andpositive changes would help to optimize and improve plant quality. In this paper ， the application of promoter editing in plants was summarized from three aspects ： the structure and classification of promoters ， gene editing technology and the research progress of promoter editing ， which was expected to provide reference for plant improving by promoter editing.Key words ：gene editing technology ； promoter editing ； plant quality improvement2019年，一种突破基因编辑瓶颈、优化传统基因编辑的新策略——启动子靶向编辑［1］，给研究者提供了一个新的研究思路。

RNA编辑的机制及其生物学意义

RNA编辑的机制及其生物学意义RNA编辑是一种重要的基因调控方式，指的是在RNA翻译前通过删除、插入或改变碱基等方式对RNA分子进行修改的过程。

RNA编辑在真核生物的细胞中普遍存在，尤其在神经系统中表现得尤为明显。

近年来，随着RNA编辑机制的深入研究，其生物学意义也逐渐被人们所认识。

1. RNA编辑的机制RNA编辑主要是通过酶类介导进行的。

其中最常见的编辑酶类别为腺苷酸脱氨酶（ADAR）。

ADAR酶可以将腺苷（A）碱基转化为肌苷（I）碱基。

在转化过程中，ADAR通过将A碱基的氨基团转移至其亚胺基上来完成转化过程。

此外，其他一些蛋白质也被发现能够介导RNA编辑，例如线粒体tRNA编辑酶PUS1和细胞质RNA编辑酶APOBEC家族等。

RNA编辑具体过程中，ADAR酶首先与RNA靶序列结合，然后将腺苷（A）修饰为肌苷（I）。

除此以外，腺苷酸脱氨酶也可以对一些RNA序列中存在的其他碱基进行修饰，例如对胞嘧啶（C）和尿嘧啶（U）进行修饰等。

这些修饰的方式，可分为脱氨酶活性和具有特殊结构的RNA序列。

2. RNA编辑的生物学意义RNA编辑在生物学中具有重要的物理及生理功能，尤其是在神经系统中扮演着一个重要的角色。

某些细胞株和神经元中的RNA 编辑后成果物中含有一些重要的功能型转录产物，包括神经元体淀粉样蛋白（NEP）和麻风病菌感染负载B（CFTR），这些物质对神经系统和心血管系统等都有着重要的功能作用。

其中，RNA编辑在神经系统中应用最为广泛。

比如，人类脑启发基因（BDNF）在季节性抑郁障碍和季节性情感障碍中都会面临RNA编辑，而这些RNA编辑在BDNF蛋白产物分泌以及在神经元内的传递过程中发挥着重要的作用。

此外，RNA酶对ADAR酶的活性进行抑制的机制也非常重要，这种抑制在大脑中具有重要的催化作用，例如在痉挛性强直性瘫痪和思觉失调型精神障碍中都可以出现上述情况。

RNA编辑不仅涉及到对神经系统的影响，其在代谢疾病和免疫系统中的作用也值得注意。

大麦VQ_基因家族鉴定及表达分析

54卷大麦VQ基因家族鉴定及表达分析倪守飞1，母景娇1，耿梓瀚1，王孜逸2，丛钰莹1，王月雪1，刘梦迪1，蔡倩1，赵彦宏1*，王艳芳2*（1鲁东大学农学院，山东烟台264025；2鲁东大学生命与科学学院，山东烟台264025）摘要：【目的】鉴定大麦VQ基因家族成员并进行表达分析，为大麦VQ基因的功能挖掘提供理论依据。

【方法】从大麦基因组中鉴定VQ基因家族成员，利用生物信息学方法对其结构特征及编码蛋白序列进行分析，基于转录组测序数据及实时荧光定量PCR方法进行大麦组织表达模式、盐胁迫和生物胁迫分析。

【结果】在大麦基因组中鉴定出29个HvVQ 基因（HvVQ1~HvVQ29），HvVQ蛋白序列平均长度较短（214aa），多数HvVQ蛋白为碱性或偏中性蛋白，HvVQ基因不均地分布在大麦染色体上，定位于细胞核中。

29个HvVQ蛋白均含有保守基序FxxxVQxhTG，近90%的HvVQ基因不含内含子。

进化分析将大麦、拟南芥与水稻的VQ基因家族成员分为7个亚族（Ⅰ~Ⅶ），HvVQs基因不均地分布在Ⅱ~Ⅶ亚族中。

大麦与水稻的共线性基因对数（17对）远多于与拟南芥的共线性基因对数（1对），种内共线性分析发现1对共线性基因对，非同义替换率/同义替换率（Ka/Ks）计算发现HvVQ蛋白主要处于纯化选择状态。

HvVQ基因启动区富含生长发育作用元件、非生物胁迫反应元件和激素反应元件，种类及分布均呈多样性。

对蛋白网络预测分析推断其与HvWRKY的2类亚族（Ⅱ-c和Ⅲ）存在互作关系。

大多数HvVQ基因在组织中表达，HvVQ19在受到盐胁迫时表达量明显上调，在根尖和根伸长区表达量分别上调1.40和1.10倍；对其中10个HvVQ基因进行实时荧光定量PCR检测，HvVQ2基因在蚜虫和黄矮病毒胁迫下表达量均显著下调（倍数变化<0.5为显著抑制，>2.0为显著诱导），HvVQ7和HvVQ15基因在蚜虫和黄矮病毒胁迫下表达量上调最显著，其他7个HvVQ基因也均表现出差异表达。

燕麦PRR基因家族鉴定与表达分析

麦类作物学报 2023,43(11):1394-1403J o u r n a l o fT r i t i c e a eC r o ps d o i :10.7606/j.i s s n .1009-1041.2023.11.04网络出版时间:2023-09-18网络出版地址:h t t ps ://l i n k .c n k i .n e t /u r l i d /61.1359.S .20230914.1600.016燕麦P R R 基因家族鉴定与表达分析收稿日期:2022-10-29 修回日期:2023-07-01基金项目:国家重点研发计划项目(2022Y F E 0119800);内蒙古农牧业创新基金项目(2022C X J J N 04);麦类种质创新利用自治区高等学校重点实验室资助项目;内蒙古农业大学生命科学学院团队经费资助项目(T D 202103)第一作者E -m a i l :470917658@q q.c o m 通讯作者:韩冰(E -m a i l :h b _n m g@163.c o m )南金生1,王跃飞2,安江红1,3,刘娜1,温欣燕1,王梦旭1,王媛媛1,强泽1,韩冰1(1.内蒙古农业大学麦类种质创新利用自治区高等学校重点实验室,内蒙古呼和浩特010018;2.内蒙古自治区农牧业生态与资源保护中心,内蒙古呼和浩特010010;3.内蒙古自治区农牧业科学院,内蒙古呼和浩特010031)摘要:春㊁夏播燕麦是长日照作物,光周期不敏感燕麦的创制使其在短日照条件下能正常生长发育㊂P R R 基因是光周期途径中重要的昼夜节律调节基因㊂前期转录组研究表明P R R 基因可能与燕麦光周期不敏感性有关㊂本研究从转录组和全基因组水平对燕麦P R R 基因家族进行鉴定㊁生物信息学分析和表达研究㊂结果表明,在燕麦转录组和基因组水平分别鉴定到6个和2个P R R 基因,均包含R E C 和C C T 结构域;进化分析表明燕麦P R R 基因与小麦㊁大麦㊁黑麦草和山羊草的亲缘关系较近;燕麦P R R 基因启动子区域包含与光响应㊁生长发育和胁迫相关的顺式作用元件;q R T -P C R 分析表明燕麦P R R 基因的表达具有节律特征,全生育期过程中A s P R R 1和A s P R R 2在穗和叶的表达量均呈现由低到高㊁下降后再升高的双峰趋势,且A s P R R 2基因的表达量高于A s P R R 1㊂以上结果说明,A s P R R 基因在燕麦光周期途径中发挥负调控作用,其下调表达促进了光周期不敏感性燕麦g p 012在短日照条件下开花㊂本研究为揭示A s P R R 基因在燕麦光周期不敏感机制中的作用奠定了基础㊂关键词:燕麦;光周期不敏感;P R R 基因;表达分析中图分类号:S 512.6;S 330 文献标识码:A 文章编号:1009-1041(2023)11-1394-10I d e n t i f i c a t i o na n dE x p r e s s i o nA n a l y s i s o f P R R G e n eF a m i l yi nO a t N A NJ i n s h e n g 1,W A N GY u e f e i 2,A NJ i a n g h o n g 1,3,L I UN a 1,W E NX i n ya n 1,W A N G M e n g x u 1,W A N GY u a n y u a n 1,Q I A N GZ e 1,H A NB i n g1(1.K e y L a b o r a t o r y o fW h e a tG e r m p l a s mI n n o v a t i o na n dU t i l i z a t i o nA u t o n o m o u sR e g i o nH i g h e r S c h o o l ,I n n e rM o n go l i a A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,H o h h o t ,I n n e rM o n g o l i a 010018,C h i n a ;2.I n n e rM o n g o l i aA u t o n o m o u sR e g i o nA g r i c u l t u r e a n dA n i m a l H u s b a n d r y E c o l o g y a n dR e s o u r c eP r o t e c t i o nC e n t e r ,H o h h o t ,I n n e rM o n g o l i a 010010,C h i n a ;3.I n n e rM o n g o l i aA c a d e m y of Ag r i c u l t u r a l a n dA n i m a lH u s b a n d r y ,H oh h o t ,I n n e rM o n go l i a 010031,C h i n a )A b s t r a c t :S p r i n g a n d s u mm e r s o w n o a t s a r e l o n g -d a y c r o p s ,a n d t h e c o n s t r u c t i o n o f p h o t o pe r i o d -i n s e n -s i t i v e o a t s e n a b l e s t h e mt o g r o wa n dd e v e l o p n o r m a l l y u n d e r s h o r t -d a y co n d i t i o n s .T h e P R R g e n e i s a n i m p o r t a n t c i r c a d i a n r h y t h m -r e g u l a t i n g g e n e i n t h e p h o t o p e r i o d p a t h w a y .P r e l i m i n a r y t r a n s c r i pt o m e s t u d i e s i n d i c a t e d t h a t P R R g e n e sm a y b e a s s o c i a t e dw i t ho a t p h o t o p e r i o d i n s e n s i t i v i t y .I n t h i s s t u d y,t h e i d e n t i f i c a t i o n ,b i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s a n d e x p r e s s i o n p a t t e r na n a l y s i s o f t h eo a t P R R g e n e f a m i l yw e r e p e r f o r m e d a t t h e t r a n s c r i pt o m e a n dw h o l e g e n o m e l e v e l s .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t s i xa n d t w o P R R g e n e sw e r e i d e n t i f i e da t t h e t r a n s c r i p t o m ea n d g e n o m e l e v e l s ,r e s p e c t i v e l y ,i n c l u d i n g R E Ca n d C C Td o m a i n s ;e v o l u t i o n a r y a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h eo a t P R R g e n e i s c l o s e l y re l a t e d t ow h e a t ,b a r -l e y ,r y e g r a s s a n d g o a t g r a s s ;t h e p r o m o t e r r e g i o n of t h e o a t P R Rg e n e c o n t a i n s c i s -a c t i n g el e m e n t s r e -l a t e d t o l i g h t r e s p o n s e ,g r o w t h a n d s t r e s s ;q R T -P C Ra n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e e x p r e s s i o no f o a t P R R g e n eh a d r h y t h m i c c h a r a c t e r i s t i c s .D u r i n g t h ew h o l e g r o w t h p e r i o d ,t h e e x pr e s s i o n l e v e l s o f A s P R R 1Copyright ©博看网. All Rights Reserved.a n d A s P R R2i ne a r s a n d l e a v e s s h o w e d ab i m o d a l t r e n d f r o ml o wt o h i g h,t h e nd ec r e a s ed a n d t he n i n-c r e a s e d,a n d t h e e x p r e s s i o n l e v e l of A s P R R2g e n e i shi g h e r t h a n t h a t o f A s P R R1.T h e r e s u l t s i n d i c a-t e d t h a t t h e A s P R R g e n e p l a y e d an e g a t i v e r e g u l a t o r y r o l e i n t h e p h o t o p e r i o d p a t h w a y o f o a t,a n d i t s d o w n-r e g u l a t e de x p r e s s i o n p r o m o t e dt h ef l o w e r i n g o f p h o t o p e r i o di n s e n s i t i v eo a t so f g p012u n d e r s h o r t-d a y c o n d i t i o n s.T h i ss t u d y l a y st h ef o u n d a t i o nf o rr e v e a l i n g t h er o l eo f A s P R R g e n ei nt h e m e c h a n i s mo f p h o t o p e r i o d i n s e n s i t i v i t y o f o a t.K e y w o r d s:O a t;P h o t o p e r i o d-i n s e n s i t i v e;P R R g e n e;E x p r e s s i o na n a l y s i s燕麦是禾本科燕麦属(A v e n as a t i v a L.)一年生草本植物,是一种世界性的粮饲兼用作物[1]㊂光是植物的重要环境因子,参与多个生理过程,包括光形态建成㊁避荫反应㊁种子萌发㊁开花和衰老[2-3]㊂植物通过自身的光响应系统,能够准确及时地响应外界光信号的变化[4-5]㊂昼夜长短影响植物开花的效应叫做光周期现象,G a r n e r和A l-l a r在1920年研究发现日照长度是调控烟草成花的重要因素,由此提出光周期现象[6]㊂根据开花结实对昼夜长短的不同响应,将植物划分为长日照㊁短日照和日中性植物等类型㊂植物开花是一个受外部环境和内部基因调节的复杂生物学过程㊂在拟南芥中,C O N S T A N S/ C O N S T A N S L I K E/T O C1基因家族成员参与光周期开花调控㊁光信号途径和生物钟调控等过程[7-8]㊂C C T家族包括C M F(C C T MO T I F F AM I L Y)亚家族㊁C O L(C O N S T A N S-l i k e)亚家族和P R R亚家族[9]㊂氨基端的P R R/R L D(r e-c e i v e r l i k e d o m a i n)结构域和羧基端的C C T结构域是伪应答蛋白调节(p s e u d o-r e s p o n s er e g u l a-t o r s,P R R s)基因家族结构的显著特征[10-12]㊂N 端响应调节接收结构域和参与A S P磷酸化信号转导途径的接收域极度相似,C端C C T结构域与酵母血红素激活蛋白(H A P2)的N F-Y A2D N A 结合区相似,C O(C O N S T A N S)的C C T结构域能够与其他H A P蛋白结合[13-14]㊂拟南芥中鉴定出了P R R1(T O C1)㊁P R R3㊁P R R5㊁P R R7和P R R9基因[15-17],水稻中有5个直系同源P R R基因,分别为O s P R R1/O s T O C1㊁O s P R R37㊁O s P R R59㊁O s-P R R73和O s P R R95[18]㊂传统的燕麦是长日照作物,当日照时长低于14h时,传统的春夏播燕麦材料(下文统称普通燕麦材料)不能抽穗开花[19]㊂为了提高燕麦产能,扩大适种范围,创制光周期不敏感材料成为育种工作亟待解决的问题㊂前期通过野生燕麦与栽培燕麦品种的杂交创制出一批对光周期不敏感的种质资源,在海南自然短日照条件下可以正常生长发育㊂前期通过转录组测序挖掘出了与光周期不敏感相关的差异表达基因,并预测了燕麦光周期不敏感模型[20];一个昼夜光周期的表达量分析表明,P R R家族成员在普通燕麦材料和光周期不敏感材料中表达量变化趋势㊁表达峰值出现时间和表达量均存在差异,这些基因可能通过响应昼夜节律变化进而影响燕麦光周期敏感性[21]㊂本研究根据转录组数据筛选出31个与燕麦光周期不敏感相关P R R家族基因的转录本,进行蛋白理化性质分析㊁结构预测㊁进化分析及光周期的表达分析;进一步在全基因组水平挖掘到2个A s P R R 基因家族成员,利用生物信息学方法全面分析其染色体定位㊁基因结构㊁进化关系㊁启动子区域的顺式作用元件及其表达模式,为揭示光周期不同敏感性燕麦材料在响应短日照胁迫下的分子机制奠定基础㊂1材料和方法1.1材料与处理供试材料包括普通燕麦红旗2号(本实验室保存)和之前创制的光周期不敏感材料g p012㊂对供试材料进行短日照处理,控制日照时长为12 h,播种和遮光方法参考杨晓虹等[22]的研究㊂1.2燕麦P R R基因家族成员的鉴定转录组水平:根据C O G_c l a s s_a n n o t a t i o n㊁G O_a n n o t a t i o n㊁K E G G_a n n o t a t i o n㊁K O G_c l a s s_ a n n o t a t i o n㊁P f a m_a n n o t a t i o n㊁S w i s s p r o t_a n n o t a-t i o n㊁e g g N O G_c l a s s_a n n o t a t i o n和n r_a n n o t a t i o n 的分类和注释结果筛选出与植物开花调控㊁昼夜节律相关的转录本㊂基因组水平:根据G r a i n G e n e s网站(h t-t p s://w h e a t.p w.u s d a.g o v/G G3/g r a i n g e n e s_ d o w n l o a d s/o a t-o t3098-p e p s i c o)公布的燕麦基因组数据库,利用已经鉴定的9条拟南芥(A r a b i-d o p s i s t h a l i a n a)P R R家族蛋白序列的保守结构㊃5931㊃第11期南金生等:燕麦P R R基因家族鉴定与表达分析Copyright©博看网. All Rights Reserved.域构建隐马尔可夫模型(H i d d e n M a r k o v M o d-e l s,HMM),以此模型搜寻A v e n as a t i v a的所有编码蛋白序列,使用b l a s t p(n c b i-b l a s t-2.10.1+)进行比对,找出A v e n as a t i v a蛋白序列中的所有潜在的P R R家族序列㊂对获得的候选序列利用软件p f a m s c a n(v1.6)和P f a m A(v33.1)数据库对目标序列进行结构域注释,确定同时含有P F06203㊁P F00072结构域的序列作为最终的P R R序列㊂1.3生物信息学分析利用B L A S T在线分析基因同源性;利用D N AMA N同源序列比对;利用P r o t P a r a m工具预测蛋白质基本理化性质;利用N P S@s e r v e r在线工具预测蛋白质二级结构㊂使用在线分析软件G S D S(h t t p://g s d s.c b i.p k u.e d u.c n/i n d e x.p h p)预测基因结构;用M E M E软件(V5.0.5,h t t p:// m e m e.n b c r.n e t/m e m e)分析保守m o t i f㊂用鉴定出来的A s P R R蛋白与拟南芥㊁小麦㊁大麦㊁玉米㊁高粱和黑麦草等的P R R蛋白家族序列构建N J 树㊂用m a f f t(V7.427)进行多序列比对,然后用M E G A(M E G A7.0)软件进行N J树的构建,B o o t s t r a p设为1000㊂截取基因结构上游2k b 区域作为启动子调节序列,利用(h t t p://b i o i n-f o r m a t i c s.p s b.u g e n t.b e/w e b t o o l s/p l a n t c a r e/h t-m l/)预测启动子上面的T F结合位点㊂在基因启动子物理图谱中标记和显示结合位点的位置㊂利用在线软件(h t t p://w w w.s o f t b e r r y.c o m/b e r r y.p h t m l? t o p i c=p r o t c o m p p l&g r o u p=p r o g r a m s&s u b g r o u p= p r o l o c)对A s P R R家族成员进行亚细胞定位预测㊂根据A s P R R基因在染色体上的位置,利用网站h t-t p://m g2c.i a s k.i n/m g2c_v2.0/绘制染色体物理位置图㊂利用S i g n a l P-4.1工具进行共线性分析㊂1.4R N A的提取与c D N A合成使用T r a n s z o lU p P l u s试剂盒提取试验材料叶片的总R N A,以超微量紫外分光光度计对R N A进行浓度定量测定,1%琼脂糖凝胶电泳检测R N A完整性和浓度,并反转录为c D N A㊂1.5引物设计利用P r i m e r5.0软件,设计q R T-P C R所需引物,试验所用引物由北京六合华大有限公司合成(表1)㊂表1q R T-P C R所用引物T a b l e1P r i m e r o f t h e q R T-P C Ra n a l y s i s引物名称P r i m e r n a m e 上游U p s t r e a m(5'-3')下游D o w n s t r e a m(5'-3')目的片段T a r g e ts e g m e n t/b p退火温度A n n e a l i n gt e m p e r a t u r e/ħA s P R R1A C T G T T T C C T C C G T C C C T C T T G C G T T G C A C T C T T G T A T G11860 A s P R R2G G T T C T C C A T C C C A G C A C T T G G T T C A G C G T T C T T C T A T C10160 A c t i n G A G C G G G A A A T T G T A A G G G A C A T G G A T G G C T G G A A G A G G A C185601.6q R T-P C R以c D N A作为模板,以燕麦A c t i n为内参基因,进行q R T-P C R分析㊂反应体系20 L:c D-N A1 L,正反向引物各0.5 L(10 m o l㊃L-1),2ˑT r a n s S t a r tT i p G r e e n q P C RS u p e r M i x 10 L,d d H2O8 L㊂反应程序:95ħ预变性1 m i n;按照下列循环参数进行扩增反应:95ħ15 s,退火温度15s,72ħ10s,40个循环;60ħ30 s,20ħ10s㊂每个待测基因均进行3次技术重复及3次生物学重复㊂采用2-菪菪C T法分析数据㊂2结果与分析2.1燕麦P R R家族成员理化特征分析转录组测序数据中功能注释为P R R基因的转录本共31个,包含6个P R R基因,分别是P R R1(7个)㊁P R R3(3个)㊁P R R6(1个)㊁P R R37(6个)㊁P R R73(12个)和P R R95(2个)㊂筛选获得上述6个注释为P R R基因的最长转录本,其中P R R1-7编码513个氨基酸,P R R3-2编码703个氨基酸,P R R3-2编码253个氨基酸,P R R37-2编码434个氨基酸,P R R73-2和P R R73-6均编码767个氨基酸,P R R95-1编码594个氨基酸(表2)㊂2.2燕麦P R R蛋白家族成员结构域及建模利用在线预测工具分析31个P R R基因编码蛋白序列二级结构㊂结果表明,无规则卷曲所占比例最大,其次是α螺旋,延伸链与β-转角所占比例较小(图1)㊂P R R1-5㊁P R R1-7㊁P R R3-2㊁P R R3-3㊁P R R73-2㊁P R R73-6㊁P R R95-1等7个基因编码产物含有R E C结构域和C C T结构域,P R R1-2㊁P R R73-1编码产物不包含保守结构域㊂同时含有R E C和C C T结构域的序列中,R E C结构域的氨基酸数目有79和104两类,C C T结构域的氨基酸数目也有43和44两类,P R R1-2和P R R73-1编码蛋白均不含有R E C和C C T结构域(图2)㊂㊃6931㊃麦类作物学报第43卷Copyright©博看网. All Rights Reserved.表2 31个P R R 基因转录本比对注释信息T a b l e 2 A n n o t a t i o n i n f o r m a t i o no f 31P R R g e n e s t r a n s c r i pt s 基因名称G e n e n a m e基因数目G e n e n u m b e r编码区C o d i n g s e q u e n c e /b p 氨基酸数目N u m b e r o f a m i n o a c i d s 分子量M o l e c u l a rw e i gh t /k D a 等电点I s o e l e c t r i c p o i n t P R R 17282~154293~51317.26~57.495.20~11.40P R R 331653~2112550~70359.10~76.528.54~8.68P R R 6176225327.904.86P R R 376735~1305244~43426.95~46.326.35~9.83P R R 7312255~230484~7678.92~83.405.68~9.87P R R 9521389~1785462~59451.06~66.155.86~9.12图1 燕麦P R R 家族蛋白二级结构特征预测F i g .1 P r e d i c t i o no f p r o t e i n s e c o n d a r y s t r u c t u r e c h a r a c t e r i s t i c s o fP R Rf a m i l yi no at 图2 燕麦P R R 家族成员蛋白保守结构域分析F i g .2 P r o t e i n c o n s e r v e dd o m a i na n a l y s i s o fP R Rf a m i l y㊃7931㊃第11期南金生等:燕麦P R R 基因家族鉴定与表达分析Copyright ©博看网. All Rights Reserved.2.3燕麦与其他物种P R R蛋白的进化分析为了研究燕麦P R R家族成员的进化关系,使用M E G A7.0对燕麦P R R家族成员与其他物种的P R R蛋白构建系统发育树(图3)㊂结果表明, P R R1与大麦(H o r d e u m v u l g a r e)T O C1㊁小麦(T r i t i c u m a e s t i v u m)T O C-A1/T O C-B1/T O C-D1㊁山羊草(A e g i l o p s t a u s c h i i)P R R1亲缘关系较近;P R R3与山羊草㊁大麦的P R R3亲缘关系较近;P R R37与山羊草亲缘关系最近;P R R73与山羊草㊁大麦的P R R73亲缘关系较近;P R R95与黑麦草(L o l i u mr i g i d u m)的亲缘关系最近㊂2.4燕麦A s P R R基因家族成员的全基因组鉴定根据拟南芥P R R蛋白构建隐马可夫模型对燕麦蛋白数据库进行搜索,同时具有P F06203和P F00072结构域的才认定为A s P R R蛋白㊂结果得到2个A s P R R家族成员,分别定位在4A和5C 染色体上,其中A s P R R1位于4A染色体的中部, A s P R R2位于5C染色体的末端(表3)㊂共线性分析结果表明二者之间不存在共线性㊂A s P R R1和A s P R R2基因分别编码703和621个氨基酸,其编码蛋白分子量分别为76.5和68.6k D a,等电点分别为8.65和6.52,蛋白不稳定指数分别为47.23和54.07,G R A V Y值分别为-0.657和-0.756,结果表明A s P R R1和A s P R R2为不稳定的疏水蛋白㊂经亚细胞定位预测分析,A s P R R1定位在细胞外,而A s P R R2定位在细胞核中㊂2.5燕麦A s P R R家族的基因结构和蛋白的m o t i f 结构分析经过基因结构预测发现A s P R R1和A s P R R2均包含9个外显子和8个内含子(图4)㊂为了研究燕麦A s P R R序列的保守性,利用M E M E软件进行蛋白序列分析,预测到15个保守m o t i f(图5)㊂m o t i f1㊁m o t i f2和m o t i f3最为保守,而m o-t i f6㊁m o t i f8㊁m o t i f10和m o t i f13等基序在两个基因中的位置不同㊂2.6燕麦A s P R R蛋白家族系统进化为了明确燕麦A s P R R基因家族与拟南芥㊁水稻㊁小麦㊁大麦㊁黑麦草与山羊草P R R家族间的进化关系,利用P R R蛋白与燕麦A s P R R蛋白序列构建系统进化树(图6),结果发现A s P R R1与黑麦草的A P R R3关系最近,A s P R R2与黑麦草P R R95关系最近㊂图3燕麦与其他物种的P R R蛋白的进化分析F i g.3E v o l u t i o n a r y a n a l y s i s o fP R R p r o t e i n s i no a t a n do t h e r s p e c i e s㊃8931㊃麦类作物学报第43卷Copyright©博看网. All Rights Reserved.表3 燕麦A s P R R 基因家族成员信息T a b l e 3 I n f o r m a t i o no f A s P R R g e n e f a m i l y me m b e r s i no a t 基因名称G e n e n a m e基因I DG e n e I D定位L o c a t i o n大小S i z e /a a 分子量M o l e c u l a r w e i g h t /k D a 等电点I s o e l e c t r i cp o i n t 不稳定指数I n s t a b i l i t y i n d e x 亲疏水性G R A V Y 亚细胞定位S u b c e l l u l a r l o c a t i o nA s P R R 1T R I N I T Y _D N 1560_c 0_g 1_i 5.m r n a 24A :202676858-20268209470376.58.6547.23-0.657胞外E x t r a c e l l u l a r (S e c r e t e d )A s P R R 2T R I N I T Y _D N 2367_c 0_g 1_i 1.m r n a 15C :553642744-55364675062168.66.5254.07-0.756细胞核N u c l e ar图4 燕麦A s P R R 基因结构分析F i g .4 A n a l ys i s o f A s P R R g e n e s t r u c t u r e i no a t 图5 燕麦A s P R R 家族蛋白的m o t i f 分析F i g .5 M o t i f a n a l y s i s o fA s P R Rf a m i l ypr o t e i n s i no at 图6 燕麦与其他物种P R R 基因家族蛋白进化树F i g .6 D e n d r o g r a mo f P R R f a m i l y i no a t a n do t h e r s pe c i e s ㊃9931㊃第11期南金生等:燕麦P R R 基因家族鉴定与表达分析Copyright ©博看网. All Rights Reserved.2.7 燕麦As P R R 基因顺式作用元件分析截取基因结构上游2000b p 区域作为启动子调节序列,分析顺式作用元件的分布㊂图7展示了排在前15的元件,不同元件用不同颜色表示,其中包括转录起始相关作用元件T A T A -b o x 和C A A T ㊁生长发育作用元件O 2-s i t e ㊁激素响应元件A B R E 以及光响应元件G -b o x 等,而MY C 元件可能参与调控花发育㊁花器官的形态发生和开花时间㊂2.8 燕麦A s P R R 基因表达分析短日照条件下,A s P R R 基因在g p 012和红旗2号的幼穗和叶片中不同时期的表达模式不同㊂红旗2号幼穗发育滞留在枝梗分化期,A s P R R 1和A s P R R 2在穗(图8a 和图8b )和叶(图8c 和图8d )的表达量均呈现升高趋势;g p 012可以完成整个穗分化过程,A s P R R 1和A s P R R 2在穗和叶的表达量均呈现先升高后降低再升高的趋势(图8a-d )㊂A s P R R 1和A s P R R 2在g p012的初生期幼穗中表达量与红旗2号差异不显著,在叶片中的表达量差异极显著;A s P R R 1和A s P R R 2在g p 012的伸长期幼穗中表达量与红旗2号差异极显著,叶片中A s P R R 1的表达量在两种材料的伸长期差异不显著,而A s P R R 2的表达量差异极显著㊂随着生长发育至枝梗分化期,A s P R R 1和A s P R R 2在g p 012穗中的表达量显著降低,叶片中A s P R R 1和A s P R R 2的表达量于伸长期就已经开始出现显著降低㊂A s P R R 2基因在g p 012的不同组织㊁不同时期中的表达量均高于A s P R R 1(图8f 和图8h ),A s P R R 2基因在红旗2号穗中的表达量高于A s P R R 1(图8e ),A s P R R 1和A s P R R 2在红旗2号叶中的表达量随着发育阶段的不同而不同(图8g )㊂以上结果表明,A s P R R 1和A s -P R R 2基因参与燕麦光周期途径,并发挥调控作用㊂图7 A s P R R 基因启动子区域的顺式作用元件分布F i g .7 C i s -a c t i n g e l e m e n t d i s t r i b u t i o n i n p r o m o t e r r e gi o no f A s P R R g e ne a 是A s P R R 1基因于穗部的表达量;b 是A s P R R 2基因于穗部的表达量;c 是A s P R R 1基因于叶片的表达量;d 是A s P R R 2基因叶片的表达量;e 是基因于红旗2号穗部的表达量;f 是基因于g p 012穗部的表达量;g 是基因于红旗2号叶片的表达量;h 是基因于g p 012叶片的表达量;A~G 分别为初生期㊁伸长期㊁枝梗分化期㊁小穗分化期㊁小花分化期㊁雌蕊分化期和四分体期;*和**分别表示0.05和0.01水平显著性a i s e x p r e s s i o n l e v e l s o f A s P R R 1i n s p i k e l e t ;b i s e x p r e s s i o n l e v e l s o f A s P R R 2i n s p i k e l e t ;c i s e x pr e s s i o n l e v e l s o f A s P R R 1i n l e a f ;d i s e x p r e s s i o n l e v e l s o f A s P R R 2i n l e a f ;e i s e x p r e s s i o n l e v e l s i n s p i k e l e t o fH o n g q i 2;f i s e x p r e s s i o n l e v e l s i n s p i k e l e t o f g p 012;g i s e x -p r e s s i o n l e v e l s i n l e a f o fH o n g q i 2;h i s e x p r e s s i o n l e v e l s i n l e a f o f g p 012;A-Ga r e t h e p r i m a r y s t a g e ,e l o n g a t i o n s t a ge ,b r a n c h d if f e r e n -t i a t i o ns t ag e ,s p i k e l e t d i f f e r e n t i a t i o n s t a g e ,f l o w e r d i f f e r e n t i a t i o n s t a g e ,p i s t i l d i f f e r e n t i a t i o n s t a g e ,a n d t e t r a d s t a g e ,r e s p e c t i v e l y ;*an d **r e p r e s e n t0.05a n d 0.01l e v e l s o f p r o b a b i l i t y ,r e s p e c t i v e l y.图8 A s P R R 基因于不同品种不同时期的穗与叶片的表达差异F i g .8 A s P R R g e n e e x pr e s s i o nd i f f e r e n c e i n p a n i c l e a n d l e a f o f d i f f e r e n t o a t v a r i e t i e s a t d i f f e r e n t p e r i o d s ㊃0041㊃麦类作物学报第43卷Copyright ©博看网. All Rights Reserved.3讨论3.1多物种P R R家族基因研究及其保守结构域伪应答蛋白调节家族(p s e u d o-r e s p o n s e r e g-u l a t o r s,P R R s)是生物钟核心振荡器成员,它在维持生物钟稳定的调控㊁开花时间的调控㊁光合作用和氧化应激反应等过程中发挥着非常重要的作用[23]㊂目前在拟南芥与水稻中P R R家族基因对光周期开花途径的调控机制研究成果较多,在大麦㊁小麦㊁高粱和大豆等也发现了P R R家族基因㊂P R R家族基因还可通过调控A B A等方式影响植物抗逆性[14],对植物生物量的积累有重要影响㊂目前,燕麦P R R基因家族的研究较少,其调控机制尚未明确,有待进一步研究㊂R E C结构域中的磷酸激酶磷酸化位点能识别来自双组分信号转到系统的信号,在生物应答调节方面发挥重要作用[15],C C T结构域能介导蛋白质之间的互作,能够响应环境的节律变化㊂拟南芥㊁大麦㊁小麦㊁水稻㊁高粱等植物中发现的P R R基因也是同时含有R E C与C C T结构域,有关保守结构域之间具体的互作关系尚未明确㊂3.2P R R基因在多个物种中参与生理调控在拟南芥中,P R R基因是生物钟的核心组分,参与生物钟循环,调控下游基因表达[25]㊂野生和栽培大豆杂交产生的重组近交种群中表征了两个生长期数量性状基因座G p11和G p12,携带它俩的品系往往具有更短的生长期和更高的G m F T2a和G m F T5a表达[25]㊂P R R5㊁P R R7和P R R9均可以通过C O N S T A N S依赖性途径控制开花时间[26],P R R7是通过抑制其他蛋白的表达来调控光周期开花的关键基因[27]㊂水稻中的P R R37在其开花过程中充当中央阻遏物㊂大麦的P p d-H1(H v P R R37)[28]在长日照下能调控H v-C O-l i k e基因的表达,而短日照无明显影响[29]㊂高粱中S b P R R37在长日照条件下会出现早上和晚上的表达峰并通过直接抑制S b E h d1的转录来抑制成花素F T(F L OW E R I N G L O C U ST)的表达,另一方面能够激活C O的表达来间接抑制F T 的表达,从而抑制高粱开花;在短日照条件下,S b-P R R37在晚上的表达峰消失,对高粱开花基因的抑制减弱㊂大豆中G m P R R37基因在短日照条件下对开花时间没有明显的影响,而在长日照条件下,G m P R R37下调促进开花F T同系物G m F T2a 和G m F T5a的表达,上调抑制开花的F T同系物G m F T1a的表达[30]㊂除影响开花外,P R R基因还有其他功能㊂例如,O s P R R73通过降低表达来响应水稻干旱胁迫[31]㊂冷胁迫会刺激水稻O s-P R R1的响应,促进O s P R R37㊁O s P R R73㊁O s-P R R59和O s P R R95基因的表达[23]㊂P R R5基因表达受A B A抑制,但p r r5突变体的种子发芽率显著高于野生型,且主根长于野生型[33]㊂小麦T a P R R37与小麦抽穗期和株高显著关联,O s-P R R37也可以参与控制水稻抽穗期㊁穗粒数和株高等性状[34]㊂燕麦P R R基因家族参与光周期途径,g p012在短日照条件下可以完成全生育期的发育过程, A s P R R1和A s P R R2基因在短日照条件下表达量下调,解除了对开花调控基因F T的抑制,促使g p012能够正常进入小穗分化期发育阶段㊂3.3P R R的短串联重复序列A s P R R基因在编码区域存在多处短串联重复序列㊂编码区域的大多数串联重复序列变异可能会引起错义突变㊁同义突变甚至移码突变,产生新型的蛋白质,从而引起基因功能的增加或者丢失㊂外显子区域的微卫星序列变异使外显子区域序列的多样化,可能会影响基因转录和翻译㊂植物中的串联重复序列在外显子区域密度较低,但它们的消失可能引起剪辑改变㊁外显子改组和点突变,从而改变基因表达进而极可能导致表型的改变[35]㊂基因间隔区域的串联重复序列变异通常不会直接影响基因表达,但可通过影响染色质组织结构来调控基因表达从而间接影响基因的功能[36],如在着丝粒区域产生折叠而形成特殊的二级结构或者更高的结构㊂4结论燕麦光周期敏感性与穗发育从枝梗分化期向小穗分化期的转化有关,短日照条件下,A s P R R 基因在小穗分化期的下调表达促进了g p012在开花;普通燕麦材料与光周期不敏感性材料的P R R 基因在U T R㊁外显子和内含子区域均存在差异㊂参考文献:[1]任长忠,胡跃高.中国燕麦学[M].北京:中国农业出版社, 2013:7-10.R E N CZ,HU YG.C h i n e s e o a t o l o g y[M].B e i j i n g:C h i n aA g-r i c u l t u r a l P r e s s,2013:7-10.[2]J I A O Y,L A U O S,D E N G X W.L i g h t-r e g u l a t e dt r a n s c r i p-t i o n a l n e t w o r k s i nh i g h e r p l a n t s[J].N a t u r eR e v i e w sG e n e t-㊃1041㊃第11期南金生等:燕麦P R R基因家族鉴定与表达分析Copyright©博看网. All Rights Reserved.i c s,2007,8(3):217.[3]E Z E RD,J U N GJ A E H,L A N H,e t a l.T h ee v e n i n g c o m p l e xc o o rd i n a te s e n v i r o n m e n t a la n de n d o g e n o u ss i g n a l s i n A r a b i-d o p s i s[J].N a t u r eP l a n t s,2017,3:17087.[4]H A RM E R S L,H O G E N E S C H JB,S T R A UM E M,e ta l. 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小麦miR164基因家族的生物信息学分析及靶基因预测

小麦miR164基因家族的生物信息学分析及靶基因预测武宁静;徐渴;曹慧雯;张树华;赵勇;杨学举【期刊名称】《中国科技论文在线精品论文》【年(卷),期】2024(17)1【摘要】miR164家族是植物中一类特有的保守小RNA分子,广泛参与植物的生长发育及各种逆境胁迫响应。

为了解小麦Tae-miR164基因家族成员的进化特征、表达模式及功能,对PmiREN数据库中Tae-miR164基因进行了生物信息学分析。

结果共鉴定到13个家族成员,成簇于小麦Chr1、Chr2和Chr6等3条染色体上。

序列比对发现Tae-miR164家族13个成员的成熟序列均为21 bp,且相似性较高,仅在5’端第21个核苷酸处存在差异,前体序列均能形成稳定的二级茎环结构,成熟的miRNA序列处于5’端臂上。

进化树分析表明,拟南芥、水稻、玉米、二穗短柄草、大麦、谷子、苜蓿、番茄和小麦中Tae-miR164家族成员主要分为4个分支。

靶基因预测表明,Tae-miR164基因家族成员对应的靶基因为NAC转录因子家族成员。

转录组数据分析表明,Tae-miR164a/b/c/d/e/f/g/h/i/m在小麦6个组织中均有表达,Tae-miR164j/k/l在花和籽粒中几乎不表达。

实时荧光定量PCR结果表明,低温(4℃)胁迫处理48 h的小麦茎基部中Tae-miR164家族成员呈明显上调的表达模式。

本研究为小麦Tae-miR164家族成员的功能鉴定奠定了理论基础。

【总页数】9页(P50-58)【作者】武宁静;徐渴;曹慧雯;张树华;赵勇;杨学举【作者单位】河北农业大学农学院【正文语种】中文【中图分类】S512【相关文献】1.油菜miR169基因家族的生物信息学分析及靶基因预测2.葡萄miR164家族生物信息学分析及靶基因预测3.植物发育相关miR828基因家族靶基因预测及生物信息学分析4.陆地棉miR156基因家族生物信息学分析及靶基因预测5.小麦中MIR160基因家族的生物信息学分析及靶基因鉴定因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

小麦miRNA_靶基因的体外实验验证

㊀山东农业科学㊀２０２４ꎬ５６(２):１~７ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２４.０２.００１收稿日期:２０２３－０２－２２基金项目:山东省自然科学基金项目(ＺＲ２０２０ＭＣ０９８)ꎻ国家自然科学基金项目(３２００１５４４)ꎻ小麦玉米国家工程实验室开放课题(２０１８ＬＹＺＷＳ０５)ꎻ山东省重点研发计划(重大科技创新工程)项目(２０２１ＬＺＧＣ００９)作者简介:房春豪(１９９７ )ꎬ男ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事小麦新品种培育工作ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｆａｎｇｃｈｕｎｈａｏ０２１３＠１６３.ｃｏｍ通信作者:韩冉(１９８２ )ꎬ女ꎬ博士ꎬ助理研究员ꎬ主要从事小麦新品种培育工作ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｈｒ０２２ｃｎ＠ａｌｉｙｕｎ.ｃｏｍ刘成(１９７９ )ꎬ男ꎬ博士ꎬ研究员ꎬ研究方向为小麦细胞遗传学ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｌｃｈ６６８８４０７＠１６３.ｃｏｍ小麦ｍｉＲＮＡ靶基因的体外实验验证房春豪１ꎬ陈志浩２ꎬ王开２ꎬ汪晓璐２ꎬ徐文竞２ꎬ祁广２ꎬ马朋涛１ꎬ韩冉２ꎬ刘成２(１.烟台大学生命科学学院ꎬ山东烟台㊀２６４０００ꎻ２.山东省农业科学院作物研究所/农业部黄淮北部小麦生物学与遗传育种重点实验室/小麦玉米国家工程实验室ꎬ山东济南㊀２５０１００)㊀㊀摘要:ｍｉＲＮＡ是一类内源非编码单链小ＲＮＡꎬ广泛存在于动植物中ꎬ主要通过切割靶基因或者抑制靶基因表达参与细胞分化㊁生长和发育等多种生物学调控ꎮ目前缺少一种快速简便验证ｍｉＲＮＡ靶基因的方法ꎮ本研究基于前期筛选到的小麦特有的ｍｉＲＮＡＴａｅ－ｍｉＲ９６６６ａꎬ合成其前体及前体突变体ꎬ并连接到表达载体上ꎬ构建含有ＧＦＰ(绿色荧光蛋白)标记的靶基因过表达载体ꎬ共转化烟草ꎬ通过观察ＧＦＰ的荧光亮度判断靶基因的切割情况ꎬ以此来验证ｍｉＲＮＡ与靶基因的相互作用ꎮ结果发现ꎬ共转ｍｉＲＮＡ前体的烟草叶片的荧光亮度较低ꎬ表明靶基因被ｍｉＲＮＡ切割ꎬ其后的ＧＦＰ无法正常表达ꎻ共转ｍｉＲＮＡ前体突变体的烟草叶片的荧光亮度与单转靶基因的相当ꎬ表明ｍｉＲＮＡ前体突变体未切割靶基因ꎬ导致ＧＦＰ正常表达ꎮ本实验有效证明了ｍｉＲＮＡ的靶基因切割情况ꎬ也表明利用烟草验证ｍｉＲＮＡ与靶基因相互作用是可行的ꎮ关键词:小麦ｍｉＲＮＡꎻ靶基因ꎻＴａｅ－ｍｉＲ９６６６ａꎻＧＦＰꎻ本氏烟草中图分类号:Ｓ５１２.１:Ｑ７８１㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２４)０２－０００１－０７ＶａｌｉｄａｔｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏｏｆｍｉＲＮＡＴａｒｇｅｔＧｅｎｅｓｉｎＷｈｅａｔＦａｎｇＣｈｕｎｈａｏ１ꎬＣｈｅｎＺｈｉｈａｏ２ꎬＷａｎｇＫａｉ２ꎬＷａｎｇＸｉａｏｌｕ２ꎬＸｕＷｅｎｊｉｎｇ２ꎬＱｉＧｕａｎｇ２ꎬＭａＰｅｎｇｔａｏ１ꎬＨａｎＲａｎ２ꎬＬｉｕＣｈｅｎｇ２(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＹａｎｔａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＹａｎｔａｉ２６４０００ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＣｒｏｐＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅꎬＳｈａｎｄｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ/ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＧｅｎｅｔｉｃｓＢｒｅｅｄｉｎｇｏｆＷｈｅａｔｉｎＮｏｒｔｈｅｒｎＨｕａｎｇ￣ＨｕａｉＲｅｇｉｏｎꎬＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ/ＮａｔｉｏｎａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＷｈｅａｔａｎｄＭａｉｚｅꎬＪｉｎａｎ２５０１００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀ｍｉＲＮＡｓａｒｅａｃｌａｓｓｏｆｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｎｏｎ￣ｃｏｄｉｎｇｓｍａｌｌｓｉｎｇｌｅ￣ｓｔｒａｎｄｅｄＲＮＡꎬｗｈｉｃｈａｒｅｗｉｄｅｌｙｆｏｕｎｄｉｎｔｈｅｐｌａｎｔｓａｎｄａｎｉｍａｌｓ.Ｔｈｅｙａｒｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｖａｒｉｏｕｓｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓｓｕｃｈａｓｃｅｌｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎꎬｇｒｏｗｔｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｍａｉｎｌｙｂｙｃｕｔｔｉｎｇｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓｏｒｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ.ＡｔｐｒｅｓｅｎｔꎬｉｔｉｓｓｈｏｒｔｏｆａｑｕｉｃｋａｎｄｓｉｍｐｌｅｍｅｔｈｏｄｆｏｒｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｉＲＮＡｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓ.Ｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｐｒｅ￣ｓｃｒｅｅｎｅｄｗｈｅａｔｓｐｅｃｉｆｉｃｍｉＲＮＡＴａｅ￣ｍｉＲ９６６６ａꎬｔｈｉｓｓｔｕｄｙｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄｔｏｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｉｔｓｐｒｅｃｕｒｓｏｒａｎｄｐｒｅｃｕｒｓｏｒｍｕｔａｎｔꎬｃｏｎｎｅｃｔｔｈｅｍｔｏｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒꎬｃｏｎｓｔｒｕｃｔｔｈｅｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｃｏｎｔａｉｎｉｎｇＧＦＰ(ｇｒｅｅｎｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ)ｌａｂｅｌａｎｄｃｏ￣ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｔｉｎｔｏｔｏｂａｃｃｏꎬａｎｄｖｅｒｉｆｙｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｍｉＲＮＡａｎｄｔｈｅｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｂｙｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｔｈｅｃｌｅａｖａｇｅｏｆｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｔｈｒｏｕｇｈｏｂｓｅｒｖｉｎｇｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓｏｆＧＦＰ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓｏｆｔｈｅｔｏｂａｃｃｏｌｅａｖｅｓｗｉｔｈｃｏ￣ｔｒａｎｓｍｕｔａｔｉｏｎｍｉＲＮＡｐｒｅｃｕｒ￣ｓｏｒｓｗａｓｌｏｗｅｒꎬｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｔｈｅｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｗａｓｃｕｔｂｙｍｉＲＮＡꎬａｎｄｔｈｅｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔＧＦＰｃｏｕｌｄｎｏｔｂｅｅｘ￣ｐｒｅｓｓｅｄｎｏｒｍａｌｌｙ.Ｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓｏｆｔｏｂａｃｃｏｌｅａｖｅｓｏｆｃｏ￣ｔｒａｎｓｍｕｔａｔｉｏｎｍｉＲＮＡｐｒｅｃｕｒｓｏｒｍｕｔａｎｔｓｗａｓｃｏｍｐａｒａｂｌｅｔｏｔｈａｔｏｆｓｉｎｇｌｅｔｒａｎｓｍｕｔａｔｉｏｎｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓꎬｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｔｈａｔｍｉＲＮＡｐｒｅｃｕｒｓｏｒｍｕｔａｎｔｓｄｉｄｎｏｔｃｕｔｔｈｅｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓꎬｒｅｓｕｌｔｉｎｇｉｎｎｏｒｍａｌＧＦＰｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ.ＴｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈｅｃｌｅａｖａｇｅｏｆｍｉＲＮＡｔａｒｇｅｔｇｅｎｅｓꎬａｎｄａｌｓｏｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｉｔｗａｓｆｅａｓｉｂｌｅｔｏｖｅｒｉｆｙｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｍｉＲＮＡａｎｄｔａｒ￣ｇｅｔｇｅｎｅｓｂｙｕｓｉｎｇＮｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＷｈｅａｔｍｉＲＮＡꎻＴａｒｇｅｔｇｅｎｅꎻＴａｅ￣ｍｉＲ９６６６ａꎻＧＦＰꎻＮｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ㊀㊀ｍｉＲＮＡ是一类内源非编码单链小ＲＮＡꎬ广泛存在于动植物体内ꎬ在转录和转录后水平实现对特定基因表达的调控ꎬ从而参与细胞分化㊁生长和发育等多种生物学调控[１－３]ꎮ在植物中ꎬｍｉＲＮＡ在ＲＮＡ聚合酶Ⅱ作用下转录形成较长的ｐｒｉ￣ｍｉＲＮＡꎬ随后在结合蛋白ＤＡＷＤＬＥ(ＤＤＬ)㊁锌指蛋白(ＳＥ)等作用下ꎬ形成双链ｍｉＲＮＡ(ｍｉＲＮＡʒｍｉＲＮＡ∗)ꎻ双链ｍｉＲＮＡ在ｍｉＲＮＡ甲基转移酶ＨＥＮＩ的作用下进行甲基化修饰ꎬ并被转运蛋白ＨＡＳＴＹ运送到细胞质中ꎻ成熟的ｍｉＲＮＡ通过与Ａｒｇｏｎａｕｔｅ(ＡＧＯ)蛋白结合形成ＲＮＡ诱导沉默复合体(ＲＮＡ￣ｉｎｄｕｃｅｄｓｉｌｅｎｃｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘꎬＲＩＳＣ)来发挥作用[４－５]ꎮｍｉＲＢａｓｅ数据库(Ｒｅｌｅａｓｅ２２.１ꎬＭａｒｃｈ２０１８ꎬｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｍｉｒｂａｓｅ.ｏｒｇ)中登记注册的重要作物ｍｉＲＮＡ共计２８６３条ꎬ其中小麦成熟的ｍｉＲ￣ＮＡ共有１２５条ꎬ由１２２个前体编码ꎮｍｉＲＮＡ控制靶基因的方式主要是通过切割靶基因或者是抑制靶基因表达[６]ꎮｍｉＲＮＡ切割目标基因是使与其互补配对区域的某两个核苷酸之间的磷酸二酯键发生断裂[７]ꎬ而磷酸二酯键的断裂主要由具有核酸内切酶活性的ＡＧＯ１蛋白介导[８]ꎮ识别ｍｉＲＮＡ的靶基因并判断两者之间相互作用的机制ꎬ有利于分析研究ｍｉＲＮＡ及其靶基因的功能ꎮ前期我们通过ｓＲＮＡ测序筛选到一条新ｍｉＲ￣ＮＡꎬ将其命名为Ｔａｅ－ｍｉＲ９６６６ａꎮ保守性分析发现该ｍｉＲＮＡ为小麦所特有的ꎬ仅在小麦籽粒中表达ꎬ且表达量随籽粒发育逐渐升高[９]ꎮ本研究团队利用大麦条斑花叶病毒对Ｔａｅ－ｍｉＲ９６６６ａ的功能进行研究ꎬ发现过表达此ｍｉＲＮＡ可使小麦籽粒大小发生变化ꎮ生物信息预测及降解组测序发现Ｔａｅ－ｍｉＲ９６６６ａ的靶基因为Ｒｐｂ１ꎬ该基因编码ＲＮＡ聚合酶Ⅱ的大亚基[１０]ꎮ本研究利用体外实验ꎬ通过合成Ｔａｅ－ｍｉＲ９６６６ａ前体及前体突变体ꎬ构建含有ＧＦＰ标记的Ｒｐｂ１过表达载体ꎬ并共转化烟草ꎬ通过观察ＧＦＰ的荧光亮度来判断靶基因的切割情况ꎬ以验证Ｔａｅ－ｍｉＲ９６６６ａ与靶基因Ｒｐｂ１的相互作用ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀实验材料小麦品种中国春(ＣｈｉｎｅｓｅＳｐｒｉｎｇꎬＣＳ)ꎬ表达载体ｐＢＩ２２１－ＧＦＰ㊁ｐＡＭＢＩ１３００ꎬ均由山东省农业科学院作物研究所小麦细胞遗传学实验室保存ꎮ１.２㊀实验方法１.２.１㊀Ｔａｅ－ｍｉＲ９６６６ａ靶基因切割位点的预测㊀利用在线软件ｐｓＲＮＡＴａｒｇｅｔ(ｈｔｔｐ://ｐｌａｎｔｇｒｎ.ｎｏ￣ｂｌｅ.ｏｒｇ/ｐｓＲＮＡＴａｒｇｅｔ/)对Ｔａｅ－ｍｉＲ９６６６ａ的靶基因切割位点进行预测ꎮ１.２.２㊀ｐｒｅ－ｍｉＲ９６６６和ｐｒｅ－ＴｍｉＲ９６６６的合成㊀ｍｉＲ９６６６的前体序列ｐｒｅ－ｍｉＲ９６６６及其改造后的ｐｒｅ－ＴｍｉＲ９６６６序列见图１ꎬ其中红色画线部分碱基为替换碱基ꎬ以使其形成的ｍｉＲＮＡ无法切割靶基因ꎮ这两条序列由北京擎科生物科技股份有限公司青岛分公司合成到ｐＡＭＢＩ１３００载体上ꎬ得到ｐＡＭＢＩ１３００－ｍｉＲ９６６６和ｐＡＭＢＩ１３００－ＴｍｉＲ９６６６ꎮ图１㊀ｐｒｅ￣ｍｉＲ９６６６及ｐｒｅ￣ＴｍｉＲ９６６６序列信息２山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀１.２.３㊀ＤＮＡ提取及基因克隆㊀利用快捷型植物基因组ＤＮＡ提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取中国春小麦基因组ＤＮＡꎬ提取方法参照文献[１１]ꎮ利用小麦基因组网站(ｈｔ￣ｔｐｓ://ｗｗｗ.ｗｈｅａｔｇｅｎｏｍｅ.ｏｒｇ/Ｔｏｏｌｓ￣ａｎｄ￣Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ/Ｗｈｅａｔ￣Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ￣Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ)对前期预测到的Ｔａｅ￣ｍｉＲ９６６６ａ的靶基因Ｒｐｂ１的部分序列进行克隆ꎬ方法参照文献[１２]ꎬ引物序列见表１ꎬ将鉴定为阳性的单克隆送至北京擎科生物科技股份有限公司青岛分公司进行测序ꎮ将测序正确的阳性菌株进行质粒提取ꎬ－２０ħ保存备用ꎮ１.２.４㊀过表达载体的构建㊀以提取的质粒为模板进行ＰＣＲ扩增ꎬ然后参考文献[１３]中的方法进行过表达载体构建ꎬ所需引物见表１ꎮ经菌落ＰＣＲ鉴定为阳性的单克隆菌液送至北京擎科生物科技股份有限公司青岛分公司检测ꎬ得到测序㊀㊀表１㊀基因克隆及过表达载体构建所需引物引物名称引物序列(５ᶄ－３ᶄ)引物作用Ｒｐｂ１－ＦＧＧＴＣＴＴＣＡＴＣＡＡＡＴＡＣＧＧＧＲｐｂ１－ＲＧＴＣＡＡＣＡＧＴＣＴＣＡＴＣＧＴＣＣ基因克隆Ｒｐｂ１－ＧＦＰＦａｃｇｇｇｇｇａｃｔｃｔａｇａｇｇａｔｃｃＡＴＧＣＴＴＧＡＴＡＣＡＧＡＡＧＧＴＧＴＲｐｂ１－ＧＦＰＲｃｇｇａｇｃｔｃｇａａｔｔｃｇｇａｔｃｃＧＡＡＡＣＡＡＴＧＧＴＧＡＴＴＡＴＣＡＡ过表达载体构建正确的表达载体ｐＢＩ２２１－ＧＦＰ－Ｒｐｂ１ꎮ１.２.５㊀烟草瞬时转化㊀在培养箱中种植小叶烟草(Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａꎬ俗称本氏烟草)ꎬ营养土盆栽ꎻ在光周期为１６ｈ光照/８ｈ黑暗㊁温度２３~２６ħ条件下培养约一个半月ꎬ选取浓绿㊁厚实的叶片用于瞬时表达实验ꎮ将ｐＡＭＢＩ１３００－ｍｉＲ９６６６㊁ｐＡＭＢＩ１３００－ＴｍｉＲ９６６６㊁ｐＢＩ２２１－ＧＦＰ－Ｒｐｂ１质粒转化至农杆菌中ꎬ在双抗板上生长３天后ꎬ使用一次性注射器把不同农杆菌菌液注射至小叶烟草叶肉内进行瞬时转化ꎬ具体方法参考文献[１４]ꎻ将转化后的烟苗继续在培养箱中培养两天ꎬ然后撕下注射部位的表皮ꎬ在激光共聚焦显微镜下观察并拍照记录ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀Ｔａｅ－ｍｉＲ９６６６ａ的靶基因切割位点预测结果预测发现Ｔａｅ￣ｍｉＲ９６６６ａ的靶基因为ＴｒａｅｓＣＳ７Ｄ０２Ｇ２９７１００ꎬ切割位点共有１１个(表２)ꎮ通过小麦基因组网站(ｈｔｔｐ://ｗｈｅａｔｏｍｉｃｓ.ｓｄａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ)对靶基因进行分析发现ꎬＴｒａｅｓＣＳ７Ｄ０２Ｇ２９７１００的基因组序列长度为８７７２ｂｐꎬ编码ＲＮＡ聚合酶Ⅱ的大亚基Ｒｐｂ１ꎬ共１８６０个ａａꎮＴａｅ－ｍｉＲ９６６６ａ的切割位点位于Ｒｐｂ１蛋白的Ｃ－端ꎮ㊀㊀表２㊀预测的Ｔａｅ－ｍｉＲ９６６６ａ的靶基因及其切割位点的详细信息靶基因期望值起点终点ｍｉＲＮＡ序列靶基因序列作用方式ＴｒａｅｓＣＳ７Ｄ０２Ｇ２９７１００.１４.５４９３６４９５７ＣＧＧＵＵＧＧＧＣＵＧＵＡＵＧＡＵＧＧＣＧＡＵＣＵＣＣＡＵＣＡＵＡＣＡＧＣＣＣＵＧＣＡＵＣｌｅａｖａｇｅＴｒａｅｓＣＳ７Ｄ０２Ｇ２９７１００.１３.５４９９９５０２０ＣＧＧＵＵＧＧＧＣＵＧＵＡＵＧＡＵＧＧＣＧＡＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＡＣＡＧＣＣＣＧＡＣＣＡＣｌｅａｖａｇｅＴｒａｅｓＣＳ７Ｄ０２Ｇ２９７１００.１４.０５１８８５２０９ＣＧＧＵＵＧＧＧＣＵＧＵＡＵＧＡＵＧＧＣＧＡＵＣＧＣＣＡＧＣＡＵＡＣＡＧＣＣＣＧＡＣＡＵＣｌｅａｖａｇｅＴｒａｅｓＣＳ７Ｄ０２Ｇ２９７１００.１３.５５２３０５２５１ＣＧＧＵＵＧＧＧＣＵＧＵＡＵＧＡＵＧＧＣＧＡＵＣＧＣＣＡＵＣＵＵＡＣＡＧＣＣＣＡＡＣＧＵＣｌｅａｖａｇｅＴｒａｅｓＣＳ７Ｄ０２Ｇ２９７１００.１３.０５２５１５２７２ＣＧＧＵＵＧＧＧＣＵＧＵＡＵＧＡＵＧＧＣＧＡＵＣＧＣＣＡＵＣＡＵＡＣＡＧＣＣＣＵＡＣＵＵＣｌｅａｖａｇｅＴｒａｅｓＣＳ７Ｄ０２Ｇ２９７１００.１４.０５２９３５３１４ＣＧＧＵＵＧＧＧＣＵＧＵＡＵＧＡＵＧＧＣＧＡＵＣＧＣＣＣＵＣＡＵＡＣＡＧＣＣＣＧＡＣＡＵＣｌｅａｖａｇｅＴｒａｅｓＣＳ７Ｄ０２Ｇ２９７１００.１５.０５３１４５３３５ＣＧＧＵＵＧＧＧＣＵＧＵＡＵＧＡＵＧＧＣＧＡＵＣＡＣＣＣＵＣＡＵＡＣＡＧＣＣＣＣＡＣＧＵＣｌｅａｖａｇｅＴｒａｅｓＣＳ７Ｄ０２Ｇ２９７１００.１５.０５３３５５３５６ＣＧＧＵＵＧＧＧＣＵＧＵＡＵＧＡＵＧＧＣＧＡＵＣＧＣＣＣＵＣＡＵＡＣＡＧＣＣＣＣＡＣＧＵＣｌｅａｖａｇｅＴｒａｅｓＣＳ７Ｄ０２Ｇ２９７１００.１３.５５３５６５３７７ＣＧＧＵＵＧＧＧＣＵＧＵＡＵＧＡＵＧＧＣＧＡＵＣＧＣＣＣＵＣＡＵＡＣＡＧＣＣＣＵＡＣＣＵＣｌｅａｖａｇｅＴｒａｅｓＣＳ７Ｄ０２Ｇ２９７１００.１５.０５３７７５３９８ＣＧＧＵＵＧＧＧＣＵＧＵＡＵＧＡＵＧＧＣＧＡＵＣＧＣＣＣＵＣＡＵＡＣＡＧＣＣＣＵＡＣＡＵＣｌｅａｖａｇｅＴｒａｅｓＣＳ７Ｄ０２Ｇ２９７１００.１３.５５７３６５７５７ＣＧＧＵＵＧＧＧＣＵＧＵＡＵＧＡＵＧＧＣＧＡＡＧＣＣＣＧＵＣＡＵＡＣＡＧＣＣＣＧＡＣＡＡＣｌｅａｖａｇｅ２.２㊀Ｒｐｂ１基因部分序列的克隆为了保证扩增的靶基因部分序列连接到表达载体上能正常翻译且不移码ꎬ我们将引物设计在含有ＡＴＧ的位置ꎬ然后利用中国春基因组进行ＰＣＲ扩增ꎬ扩增片段大小为１６５５ｂｐ(图２Ａ)ꎻ之后将扩增片段连接到克隆载体上ꎬ转化后菌落ＰＣＲ鉴定结果如图２Ｂ所示ꎮ将阳性菌落进行测序发现ꎬ所获得的序列与ＴｒａｅｓＣＳ７Ｄ０２Ｇ２９７１００的部分序列完全一致ꎬ包含了Ｔａｅ－ｍｉＲ９６６６ａ的所有结合位点(图３)ꎮ３㊀第２期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀房春豪ꎬ等:小麦ｍｉＲＮＡ靶基因的体外实验验证图Ａ为Ｒｐｂ１基因部分序列扩增结果ꎬ其中ꎬＭ为ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒꎬ１为目的条带ꎮ图Ｂ为单克隆菌落ＰＣＲ鉴定结果ꎬ其中ꎬＭ为ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒꎬ１为阳性对照ꎬ２５为挑取的４个单克隆菌落ꎮ图２㊀靶基因Ｒｐｂ１部分序列的克隆及单克隆菌落的ＰＣＲ鉴定结果横线标记处为起始密码子ＡＴＧꎻ红色标记部分为Ｔａｅ－ｍｉＲ９６６６ａ的结合位点ꎮ图３㊀克隆的Ｒｐｂ１基因部分序列的测序结果２.３㊀Ｒｐｂ１基因部分序列的表达载体ｐＢＩ２２１－ＧＦＰ－Ｒｐｂ１的构建将含有Ｒｐｂ１基因片段的质粒扩增后ꎬ利用重组酶连接到表达载体ｐＢＩ２２１－ＧＦＰ(图４)ꎬ获得ｐＢＩ２２１－ＧＦＰ－Ｒｐｂ１ꎮ为了检测连接产物的准确性ꎬ利用连接产物两侧的两个酶(ＢａｍＨⅠ和ＳａｌⅠ)对ｐＢＩ２２１－ＧＦＰ－Ｒｐｂ１进行双酶切ꎬ分别在４５００ｂｐ和２０００ｂｐ处出现两条带ꎬ与ｐＢＩ２２１－ＧＦＰ的大小(４５３０ｂｐ)和Ｒｐｂ１基因片段的大小(１６５５ｂｐ)一致ꎬ表明ｐＢＩ２２１－ＧＦＰ－Ｒｐｂ１载体构建成功ꎮ４山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀图４㊀ｐＢＩ２２１－ＧＦＰ表达载体２.４㊀转化烟草及荧光鉴定结果将构建的重组质粒以不同方式进行组合ꎬ即ｐＢＩ２２１－ＧＦＰ－Ｒｐｂ１(记为Ｒｐｂ１)与ｐＡＭＢＩ１３００－ｍｉＲ９６６６等量混合(记为Ｒｐｂ１＋ｍｉＲ９６６６)以及ｐＢＩ２２１－ＧＦＰ－Ｒｐｂ１与ｐＡＭＢＩ１３００－ＴｍｉＲ９６６６等量混合(记为Ｒｐｂ１＋ＴｍｉＲ９６６６)ꎮ以主叶脉为分界线将烟草叶片分为两部分ꎬ在第一片叶的两部分分别注射Ｒｐｂ１＋ｍｉＲ９６６６和Ｒｐｂ１ꎬ在第二片叶的两部分分别注射Ｒｐｂ１＋ＴｍｉＲ９６６６和Ｒｐｂ１(图５)ꎮ两天后在激光共聚焦显微镜下观察烟草转化结果(图６)ꎬ可见Ｒｐｂ１＋ｍｉＲ９６６６组合的荧光强度低ꎬ几乎无法检测到荧光信号ꎻＲｐｂ１＋ＴｍｉＲ９６６６组合与Ｒｐｂ１的荧光强度较高ꎬ且两者相近ꎬ表明ｍｉＲＮＡ前体的突变体未切割靶基因ꎬ导致ＧＦＰ正常表达ꎮ图５㊀培养室培育的小叶烟草及注射各种表达载体的位置图６㊀转化烟草的荧光鉴定结果３㊀讨论与结论ｍｉＲＮＡ在植物的生长发育和逆境胁迫应答等生物学过程和农艺性状控制上起着重要作用[１]ꎮ高通量测序技术的发展使ｍｉＲＮＡ的数目飞速增长ꎬ但是已知功能的ｍｉＲＮＡ数目却较少ꎮ小麦中已报道的ｍｉＲＮＡ为１２５条ꎬ但对其功能进行详细研究的却只有几条ꎬ如:ｍｉＲ１５６影响小麦的分蘖和小穗发育[１５]ꎻＴａｅ－ｍｉＲ４０８通过调控靶基因ＴａＴＯＣ来控制小麦的抽穗期[１６]ꎻｍｉＲ１７２可导致小麦穗的形态发生变化ꎬ其表达量降低导致小穗密集ꎬ而表达量升高则导致麦穗伸长ꎬ小穗之间的距离加大[１７]ꎻ过表达Ｔａｅ－ｍｉＲ４４４ａ可提高植物的生物量㊁Ｎ含量㊁光合效率及抗氧化酶活性[１８]ꎮ因此ꎬ还需加强对众多ｍｉＲＮＡ功能的研究ꎮｍｉＲＮＡ行使功能主要是通过切割靶基因或抑制靶基因表达进行[６]ꎮｍｉＲＮＡ靶基因的识别主要是通过计算机软件预测ꎬ目前预测ｍｉＲＮＡ靶基因的软件主要有ＴａｒｇｅｔＦｉｎｄｅｒ㊁ＰａｔＳｃａｎ㊁ｍｉＲＵ㊁ｐｓＲＮＡＴａｒｇｅｔ㊁ｍｉＲＧａｔｏｒ等[１９－２１]ꎮ这些预测软件的算法主要依赖于ｍｉＲＮＡ与靶基因的互补潜力进行预测ꎬ并强调种子序列的重要性ꎮ但由于预测过程中允许一定程度的错配㊁跳跃等情况ꎬ往往会导致许多错误的预测结果[２２－２４]ꎬ因此在实际研究中ꎬ需要对预测结果进行进一步分析和验证ꎮ５㊀第２期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀房春豪ꎬ等:小麦ｍｉＲＮＡ靶基因的体外实验验证目前应用最广泛的ｍｉＲＮＡ靶基因的验证方法包括ＲＮＡ连接酶介导的ｃＤＮＡ末端扩增技术㊁ＲＩＳＣ免疫共沉淀技术和降解组测序技术[２５]ꎬ但这些方法的实验操作繁琐ꎬ结果也不直观ꎬ缺少一种快速简便验证ｍｉＲＮＡ靶基因的方法ꎮ报告基因检测系统是新兴的验证ｍｉＲＮＡ与靶基因互作的研究手段ꎮ当ｍｉＲＮＡ与靶基因上的作用位点结合后ꎬ能有效抑制其翻译过程ꎻ然后将包含潜在结合位点的一部分或全部序列连接至报告基因ＣＤＳ(ｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅｓ)的下游ꎬ并将构建好的重组质粒导入细胞内进行表达ꎻ同时将ｍｉＲＮＡ的模拟物或表达载体共同转染至细胞中ꎬ经过一段时间后检测荧光强度或者荧光素酶的活性来判断ｍｉＲＮＡ与靶基因的互相作用ꎮ目前该方法在动物和昆虫相关研究中已经开展实施ꎬ但在小麦ｍｉＲＮＡ靶基因的研究中还未见有报道[２６－２７]ꎮ本研究通过合成小麦ｍｉＲＮＡ前体ｐｒｅ￣ｍｉＲ９６６６及前体突变体ｐｒｅ￣ＴｍｉＲ９６６６ꎬ连接到表达载体ｐＡＭＢＩ１３００上ꎬ并构建含有报告基因ＧＦＰ标记的靶基因过表达载体ｐＢＩ２２１－ＧＦＰ－Ｒｐｂ１ꎬ将两种载体共转化至本氏烟草叶片中ꎬ通过观察ＧＦＰ的荧光强度来判断靶基因的切割情况ꎬ从而验证ｍｉＲＮＡ与靶基因的相互作用ꎮ结果发现共转ｍｉＲＮＡ前体的烟草叶片的荧光强度较低ꎬ表明靶基因被ｍｉＲＮＡ切割ꎬ其后的ＧＦＰ无法进行较好的表达ꎻ共转ｍｉＲＮＡ前体突变体的烟草叶片与单转靶基因的叶片荧光亮度相当ꎬ表明ｍｉＲＮＡ前体的突变体未切割靶基因ꎬ导致ＧＦＰ正常表达ꎮ本实验有效证明了ｍｉＲＮＡ的靶基因切割情况ꎬ表明利用烟草验证ｍｉＲＮＡ与靶基因互作是可行的ꎮ该方法可为小麦ｍｉＲＮＡ功能研究提供技术支持ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀ＴａｎｇＪＹꎬＣｈｕＣＣ.ＭｉｃｒｏＲＮＡｓｉｎｃｒｏｐｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ:ｆｉｎｅ￣ｔｕｎ￣ｅｒｓｆｏｒｃｏｍｐｌｅｘｔｒａｉｔｓ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＰｌａｎｔｓꎬ２０１７ꎬ３(７):１７０７７. [２]㊀ＡｘｔｅｌｌＭＪ.ＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｓｍａｌｌＲＮＡｓｆｒｏｍｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１３ꎬ６４(１):１３７－１５９.[３]㊀ＲｏｇｅｒｓＫꎬＣｈｅｎＸＭ.ＢｉｏｇｅｎｅｓｉｓꎬｔｕｒｎｏｖｅｒꎬａｎｄｍｏｄｅｏｆａｃｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｍｉｃｒｏＲＮＡｓ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌꎬ２０１３ꎬ２５(７):２３８３－２３９９.[４]㊀ＹｕＹꎬＪｉａＴＲꎬＣｈｅｎＸＭꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｈｏｗａｎｄｗｈｅｒｅｏｆｐｌａｎｔｍｉｃｒｏＲＮＡｓ[Ｊ].ＴｈｅＮｅｗＰｈｙｔｏｌｏｇｉｓｔꎬ２０１７ꎬ２１６:１００２－１０１７.[５]㊀Ｊｏｎｅｓ￣ＲｈｏａｄｅｓＭＷ.Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅｉｎｐｌａｎｔｍｉ￣ｃｒｏＲＮＡｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１２ꎬ８０(１):３－１６. [６]㊀Ｊｏｎｅｓ￣ＲｈｏａｄｅｓＭＷꎬＢａｒｔｅｒｌＤＰꎬＢａｒｔｅｌＢ.ＭｉｃｒｏＲＮＡｓａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｒｏｌｅｓｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＰｌａｎｔＢｉ￣ｏｌｏｇｙꎬ２００６ꎬ５７:１９－５３.[７]㊀ＬｌａｖｅＣꎬＫａｓｓｃｈａｕＫＤꎬＲｅｃｔｏｒＭＡꎬｅｔａｌ.Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓａｎｄｓｉ￣ｌｅｎｃｉｎｇ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｓｍａｌｌＲＮＡｓｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌꎬ２００２ꎬ１４(７):１６０５－１６１９.[８]㊀ＱｉＹＪꎬＤｅｎｌｉＡＭꎬＨａｎｎｏｎＧＪꎬｅｔａｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｐｅｃｉａｌｉｚａ￣ｔｉｏｎｗｉｔｈｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＲＮＡｓｉｌｅｎｃｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓ[Ｊ].ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌꎬ２００５ꎬ１９(３):４２１－４２８.[９]㊀ＨａｎＲꎬＪｉａｎＣꎬＬｙｕＪＹꎬｅｔａｌ.Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ￣ｔｉｏｎｏｆｍｉｃｒｏＲＮＡｓｉｎｔｈｅｆｌａｇｌｅａｆａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｓｅｅｄｏｆｗｈｅａｔ(ＴｒｉｔｉｃｕｍａｅｓｔｉｖｕｍＬ.)[Ｊ].ＢＭＣＧｅｎｏｍｉｃｓꎬ２０１４ꎬ１５:２８９. [１０]ＬｉＴꎬＭａＬꎬＧｅｎｇＹＫꎬｅｔａｌ.ＳｍａｌｌＲＮＡａｎｄｄｅｇｒａｄｏｍｅｓｅ￣ｑｕｅｎｃｉｎｇｒｅｖｅａｌｃｏｍｐｌｅｘｒｏｌｅｓｏｆｍｉＲＮＡｓａｎｄｔｈｅｉｒｔａｒｇｅｔｓｉｎｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｗｈｅａｔｇｒａｉｎｓ[Ｊ].ＰＬｏＳＯＮＥꎬ２０１５ꎬ１０(１０):ｅ０１３９６５８.[１１]宫文萍ꎬ李凯ꎬ程敦公ꎬ等.ＰＬＵＧ引物和ＩＴ引物在顶芒山羊草分子标记建立中的通用性分析[Ｊ].山东农业科学ꎬ２０１９ꎬ５１(７):１０－１６.[１２]牛志伟ꎬ汪晓璐ꎬ徐文竞ꎬ等.小麦面筋蛋白基因克隆及序列分析[Ｊ].山东农业科学ꎬ２０２１ꎬ５３(５):１９－２４. [１３]李钢ꎬ淮瑞平ꎬ郭钰雯ꎬ等.杜仲ＥｕＲＥＦ１基因表达载体的构建及亚细胞定位方法[Ｊ].分子植物育种ꎬ２０２３ꎬ１２(７):１－９.[１４]王开.ＺｍｍｉＲ３９９在玉米适应低磷胁迫中的分子机制研究[Ｄ].北京:中国农业科学院ꎬ２０１７.[１５]ＬｉｕＪꎬＣｈｅｎｇＸＬꎬＬｉｕＰꎬｅｔａｌ.ｍｉＲ１５６￣ｔａｒｇｅｔｅｄＳＢＰ￣Ｂｏｘｔｒａｎ￣ｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｓｉｎｔｅｒａｃｔｗｉｔｈＤＷＡＲＦ５３ｔｏｒｅｇｕｌａｔｅＴＥＯＳＩＮＴＥＢＲＡＮＣＨＥＤ１ａｎｄＢＡＲＲＥＮＳＴＡＬＫ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｂｒｅａｄｗｈｅａｔ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ１７４(３):１９３１－１９４８. [１６]ＺｈａｏＸＹꎬＨｏｎｇＰꎬＷｕＪＹꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｔａｅ￣ｍｉＲ４０８￣ｍｅｄｉａｔｅｄｃｏｎｔｒｏｌｏｆＴａＴＯＣ１ｇｅｎｅｓｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｔｈｅｒｅｇｕｌａ￣ｔｉｏｎｏｆｈｅａｄｉｎｇｔｉｍｅｉｎｗｈｅａｔ[Ｊ].ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２０１６ꎬ１７０(３):１５７８－１５９４.[１７]ＬｉｕＰꎬＬｉｕＪꎬＤｏｎｇＨＸꎬｅｔａｌ.ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＱｂｙｍｉ￣ｃｒｏＲＮＡ１７２ａｎｄｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｃｏ￣ｒｅｐｒｅｓｓｏｒＴＯＰＬＥＳＳｉｎｃｏｎ￣ｔｒｏｌｌｉｎｇｂｒｅａｄｗｈｅａｔｓｐｉｋｅｌｅｔｄｅｎｓｉｔｙ[Ｊ].ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌꎬ２０１７ꎬ１６(２):４９５－５０６.[１８]ＳｉＧꎬＣｈｅｎｇＪＧꎬＹｏｎｇＳＺꎬｅｔａｌ.ＷｈｅａｔｍｉｃｒｏＲＮＡｍｅｍｂｅｒＴａＭＩＲ４４４ａｉｓｎｉｔｒｏｇｅｎｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ￣ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅａｎｄｉｎｖｏｌｖｅｓｐｌａｎｔａｄａｐｔａｔｉｏｎｔｏｔｈｅｎｉｔｒｏｇｅｎ￣ｓｔａｒｖａｔｉｏｎｓｔｒｅｓｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＭｏ￣ｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｐｏｒｔｅｒꎬ２０１６ꎬ３４(５):９３１－９４６.[１９]ＺｈａｎｇＢＨꎬＰａｎＸＰꎬＷａｎｇＱＬꎬｅｔａｌ.Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒ￣ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｎｅｗｐｌａｎｔｍｉｃｒｏＲＮＡｓｕｓｉｎｇＥＳＴａｎａｌｙｓｉｓ[Ｊ].６山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５６卷㊀ＣｅｌｌＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２００５ꎬ１５(５):３３６－３６０.[２０]韩冉.小麦不同器官/发育时期ｍｉＲＮＡ和ｔａｓｉＲＮＡ的鉴定及其时空表达特征分析[Ｄ].杨凌:西北农林科技大学ꎬ２０１４.[２１]ＳｈｉＲꎬＣｈｉａｎｇＶＬ.ＦａｃｉｌｅｍｅａｎｓｆｏｒｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇｍｉｃｒｏＲＮＡｅｘ￣ｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙｒｅａｌ￣ｔｉｍｅＰＣＲ[Ｊ].ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓꎬ２００５ꎬ３９(４):５１９－５２５.[２２]ＥｎｒｉｇｈｔＡＪꎬＪｏｈｎＢꎬＧａｕｌＵꎬｅｔａｌ.ＭｉｃｒｏＲＮＡｔａｒｇｅｔｓｉｎＤｒｏ￣ｓｏｐｈｉｌａ[Ｊ].ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌｏｇｙꎬ２００３ꎬ５(１):Ｒ１.[２３]ＳｔｉｌｌｅｒＪＷꎬＣｏｏｋＭＳ.ＦｕｎｃｔｉｏｎａｌｕｎｉｔｏｆｔｈｅＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅⅡＣ￣ｔｅｒｍｉｎａｌｄｏｍａｉｎｌｉｅｓｗｉｔｈｉｎｈｅｐｔａｐｅｐｔｉｄｅｐａｉｒｓ[Ｊ].Ｅｕ￣ｋａｒｙｏｔｉｃＣｅｌｌꎬ２００４ꎬ３(３):７３５－７４０.[２４]ＤａｉＸＢꎬＺｈａｏＰＸ.ＰｓＲＮＡＴａｒｇｅｔ:ａｐｌａｎｔｓｍａｌｌＲＮＡｔａｒｇｅｔａ￣ｎａｌｙｓｉｓｓｅｒｖｅｒ[Ｊ].ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈꎬ２０１１ꎬ３９(ＷｅｂＳｅｒｖｅｒｉｓｓｕｅ):Ｗ１５５－Ｗ１５９.[２５]ＷａｎｇＸＪꎬＲｅｙｅｓＪＬꎬＣｈｕａＮＨꎬｅｔａｌ.Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉ￣ｃａｔｉｏｎｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａｍｉｃｒｏＲＮＡｓａｎｄｔｈｅｉｒｍＲＮＡｔａｒ￣ｇｅｔｓ[Ｊ].ＧｅｎｏｍｅＢｉｏｌｏｇｙꎬ２００４ꎬ５(９):Ｒ６５.[２６]ＨｕａｎｇＬꎬＤｅｎｇＦＹꎬＬｅｉＳＦꎬｅｔａｌ.ＧｌｏｂａｌｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｆｏｒｍｉＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｓｉｎｈｕｍａｎｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｂｌｏｏｄｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｃｅｌｌｓ[Ｊ].ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０２０ꎬ４７(７):５２９５－５３０４.[２７]ＬｉＸꎬＺｈａｏＭＨꎬＴｉａｎＭＭꎬｅｔａｌ.ＡｎＩｎＲ/ｍｉｒ￣９ａ/ＮｌＵｂｘｒｅｇｕ￣ｌａｔｏｒｙｃａｓｃａｄｅｒｅｇｕｌａｔｅｓｗｉｎｇｄｉｐｈｅｎｉｓｍｉｎｂｒｏｗｎｐｌａｎｔｈｏｐｐｅｒｓ[Ｊ].ＩｎｓｅｃｔＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０２１ꎬ２８(５):１３００－１３１３.７㊀第２期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀房春豪ꎬ等:小麦ｍｉＲＮＡ靶基因的体外实验验证。

海大麦基因组

海大麦基因组
海大麦（Hordeum marinum）是一种大、小麦的野生近缘种，属于盐生植物，具有耐盐、耐渍等优异特性。

关于海大麦基因组的研究已经取得了一些进展。

有研究利用PacBio SMRT、Illumina PE、10×Genomics和Hi-C技术组装了一个3,816 Mb的染色体水平基因组，Contig和Super-scaffold N50值分别为6.83 Mb和524.47 Mb，96.8% (3.69 Gb) 的序列被定位到7条染色体上。

此外，研究人员还构建了海大麦的高效转化体系和基因编辑体系，遗传转化效率为28.7%；将HmSOS1的特异靶位点克隆至pUB-Cas9-TaU6-sgRNA载体利用上述体系进行转化，两次独立试验的转基因幼苗的靶点突变效率均为100%；海大麦sos1突变体表现盐敏感表型，其根部对Na+的吸收量显著高于野生型，揭示了HmSOS1基因调控海大麦耐盐性的重要作用。

总之，海大麦基因组研究对于深入了解其遗传机制和育种改良具有重要意义。

如需更多关于海大麦基因组研究的信息，可以查阅相关的学术文献。

基因组时代作物学研究新方法

基因组时代作物学研究新方法随着科学技术的不断进步，基因组时代已经成为现代生物学和农学领域的重要研究方向。

基因组时代作物学研究新方法是近年来农业科技领域的一个热门话题。

本文将介绍几种在基因组时代下用于作物学研究的新方法。

首先，转录组学是一项重要的基因组学研究方法，它可以揭示作物基因表达的全貌。

转录组学通过测定特定时间和地点的基因转录水平，可以帮助研究人员了解作物在各种生物学和环境条件下的基因表达变化。

这种方法的发展使科研人员能够对不同品种之间的转录差异进行研究，并在育种过程中选择出最有潜力的品种。

其次，基因敲除技术是基因组时代作物学研究中的另一种重要方法。

该技术通过人为干预和编辑作物基因组，以了解特定基因对作物性状和适应性的影响。

通过基因敲除，研究人员可以精确地确定与作物特定性状有关的基因，并进一步研究这些基因的功能。

这种方法为作物遗传改良提供了新的途径，使得育种过程更加高效和精确。

第三，全基因组关联分析（GWAS）是一种广泛应用于基因组时代作物学研究的方法。

GWAS 通过比较大量基因组变异和表型数据，来寻找与特定性状相关的位点或基因。

这项研究方法已经在识别作物性状相关基因和作物遗传多样性研究中发挥了重要作用。

GWAS技术的发展使得研究人员能够在不需了解候选基因的情况下，直接发现与作物性状相关的新基因。

最后，蛋白质组学是基因组时代下作物学研究的又一重要方法。

蛋白质组学通过鉴定和定量作物中所有蛋白质的表达情况，可以帮助研究人员深入了解作物生物学过程和代谢网络。

蛋白质组学在研究作物胁迫响应、代谢物积累和植物-微生物相互作用等方面具有广泛应用价值。

通过蛋白质组学研究，研究人员可以揭示作物生物学机制的复杂性，并为作物遗传改良和农业生产提供新的理论基础。

总结起来，基因组时代为作物学研究提供了许多新的方法。

通过转录组学、基因敲除技术、全基因组关联分析和蛋白质组学等新方法，研究人员可以更深入地了解作物的基因组信息、基因功能以及与作物性状相关的基因。

基因表达谱分析技术

基因表达谱分析技术1、微阵列技术(microarray)这是近年来发展起来的可用于大规模快速检测基因差别表达、基因组表达谱、DNA序列多态性、致病基因或疾病相尖基因的一项新的基因功能研究技术。

其原理基本是利用光导化学合成、照相平板印刷以及固相表面化学合成等技术，在固相表面合成成千上万个寡核昔酸探针” (CDNA、ESTs或基因特异的寡核昔酸)，并与放射性同位素或荧光物标记的来自不同细胞、组织或整个器官的DNA或mRNA反转录生成的第一链cDNA进行杂交，然后用特殊的检测系统对每个杂交点进行定量分析。

其优点是可以同时对大量基因，甚至整个基因组的基因表达进行对比分析。

包括cDNA芯片(cDNA microarray)和DNA 芯片(DNA chips)。

cDNA芯片使用的载体可以是尼龙膜，也可以是玻片。

当使用尼龙膜时，目前的技术水平可以将20000份材料点在一张12cmxi8cm的膜上。

尼龙膜上所点的一般是编好顺序的变性了的双链cDNA片段。

要得到基因表达情况的数据，只需要将未知的样品与其杂交即可。

杂交的结果表示这一样品中基因的表达模式，而比较两份不同样品的杂交结果就可以得到在不同样品中表达模式存在差异的基因。

杂交使用的探针一般为mRNA的反转录产物，标记探针使用32PdATP。

如果使用玻片为载体，点阵的密度要高于尼龙膜。

杂交时使用两种不同颜色的荧光标记不同的两份样品，然后将两份样品混合起来与一张芯片杂交。

洗去未杂交的探针以后，能够结合标记cDNA的点受到激发后会发出荧光。

通过扫描装置可以检测各个点发出荧光的强度。

对每一个点而言，所发出的两种不同荧光的强度的比值，就代表它在不同样品中的丰度。

一般来讲，显示出来的图像中，黄色的点表示在不同的样品中丰度的差异不大，红色和绿色的点代表在不同样品中其丰度各不相同。

使用尼龙膜为载体制作cDNA芯片进行研究的费用要比玻片低，因为尼龙膜可以重复杂交。

检测两种不同的组织或相同组织在不同条件下基因表达的差异，只需要使用少量的尼龙膜。

2021年江苏省新高考生物试卷和答案解析

2021年江苏省新高考生物试卷1. 核酸和蛋白质都是重要的生物大分子，下列相关叙述错误的是（）A. 组成元素都有C、H、O、NB. 细胞内合成新的分子时都需要模板C. 在细胞质和细胞核中都有分布D. 高温变性后降温都能缓慢复性2. 下列关于人体细胞生命历程的叙述正确的是（）A. 组织细胞的更新包括细胞分裂、分化等过程B. 造血干细胞是胚胎发育过程中未分化的细胞C. 细胞分化使各种细胞的遗传物质发生改变D. 凋亡细胞被吞噬细胞清除属于细胞免疫3. 细胞可运用不同的方式跨膜转运物质，下列相关叙述错误的是（）A. 物质自由扩散进出细胞的速度既与浓度梯度有关，也与分子大小有关B. 小肠上皮细胞摄入和运出葡萄糖与细胞质中各种溶质分子的浓度有关C. 神经细胞膜上运入K+的载体蛋白和运出K+的通道蛋白都具有特异性D. 肾小管上皮细胞通过主动运输方式重吸收氨基酸4. 如图表示人体胃肠激素的不同运输途径，相关叙述正确的是（）A. 胃肠激素都在内环境中发挥作用B. 内分泌腺细胞不可能是自身激素作用的靶细胞C. 图中组织液含有激素，淋巴因子、尿素等物质D. 不同胃肠激素的作用特异性主要取决于不同的运输途径5. 植物组织培养技术常用于商业化生产，其过程一般为：无菌培养物的建立→培养物增殖→生根培养→试管苗移栽及鉴定。

下列相关叙述错误的是（）A. 为获得无菌培养物，外植体要消毒处理后才可接种培养B. 组织培养过程中也可无明显愈伤组织形成，直接形成胚状体等结构C. 提高培养基中生长素和细胞分裂素的比值，有利于诱导生根D. 用同一植株体细胞离体培养获得的再生苗不会出现变异6. 在脊髓中央灰质区，神经元a、b、c通过两个突触传递信息；如图所示。

下列相关叙述正确的是（）A. a兴奋则会引起的人兴奋B. b兴奋使c内Na+快速外流产生动作电位C. a和b释放的递质均可改变突触后膜的离子通透性D. 失去脑的调控作用，脊髓反射活动无法完成7. A和a，B和b为一对同源染色体上的两对等位基因。

rna甲基化修饰检测技术

RNA甲基化修饰检测技术主要有以下几种：
1. MeRIP-seq技术：该技术利用m6A特异性抗体富集发生m6A修饰的RNA片段（包括mRNA、lncRNA
等），结合高通量测序，可以对RNA上的m6A修饰进行定位与定量。

此技术广泛应用于组织发育、干细胞自我更新和分化、热休克或DNA损伤应答、癌症发生与发展、药物应答等研究领域，并可用于动物、植物、细胞及组织的m6A检测。

2. miCLIP技术：该技术基于紫外交联免疫沉淀（CLIP）的原理，通过特定的抗体将RNA与蛋白质复合物
进行交联，然后分离和纯化交联的复合物，并通过高通量测序技术对复合物中的RNA进行测序。

此技术可以用于研究RNA甲基化修饰在转录后调控中的作用，并鉴定与甲基化修饰相关的蛋白质和RNA。

3. m6A-seq技术：该技术结合了甲基化特异性抗体和高通量测序技术，可以直接对RNA上的m6A修饰
进行测序分析。

此技术具有更高的灵敏度和特异性，能够准确地检测低丰度的m6A修饰，并提供单个碱基分辨率的甲基化图谱。

4. Me-RIP-qPCR技术：该技术结合了甲基化免疫共沉淀（Me-RIP）和实时荧光定量PCR（qPCR）技
术，可以用于检测特定基因或转录本的m6A修饰水平。

此技术具有高灵敏度和高特异性的优点，适用于对少量样本进行快速、准确的甲基化分析。

这些技术在揭示RNA甲基化修饰在生理和病理过程中的作用方面具有重要价值，并为相关疾病的研究和治疗提供了新的思路和方法。

大麦的基因组编辑和基因组学研究进展

大麦的基因组编辑和基因组学研究进展大麦是一种重要的农作物，广泛种植于世界各地。

随着基因编辑和基因组学技术的不断进步，大麦基因组编辑和基因组学的研究取得了很大的进展。

本文将就大麦基因组编辑和基因组学的研究进展展开讨论。

基因组编辑是通过人为介入改变生物体基因组的方法。

近年来，CRISPR-Cas9技术作为一种高效、精准、经济的基因组编辑工具被广泛应用于大麦研究中。

通过CRISPR-Cas9技术，研究人员可以准确地编辑大麦基因组中的特定基因，实现对大麦性状的改良和调控。

一方面，大麦基因组编辑的研究已经取得了一系列成功。

研究人员通过CRISPR-Cas9系统成功编辑了大麦中多个重要基因，如抗病性相关基因、耐逆性相关基因等。

通过基因编辑技术，可以快速地产生抗病性强、耐逆性好的大麦新品种，提高大麦的抗病性和适应性，从而增加其产量和质量。

另一方面，大麦基因组学的研究也取得了显著的进展。

基因组学研究主要关注大麦基因组结构、功能、表达以及调控机制的研究。

近年来，利用高通量测序技术，研究人员已经测序并解析了大麦的全基因组序列，并对其基因组进行了深入的分析和注释。

这些研究为深入理解大麦基因组的功能和调控机制奠定了基础。

大麦基因组学的研究不仅揭示了大麦基因组的基本特点，还以此为基础进行功能基因研究。

通过功能基因研究，研究人员可以深入探究大麦基因的功能，如参与光合作用、代谢调控、抗病性和适应性等方面的基因。

这些研究有助于揭示大麦的生长发育和抗逆机制，为大麦育种提供新的理论基础和遗传资源。

此外，大麦基因组编辑和基因组学的研究还涉及到转基因技术。

通过基因组编辑和基因组学的研究，研究人员可以开发出新的转基因大麦品种，如具有抗虫性、抗草甘膦性等特征的转基因大麦。

这些转基因大麦品种具有更好的抗性和适应性，可以提高大麦的产量和质量，满足日益增长的需求。

总结起来，大麦基因组编辑和基因组学的研究对于大麦的改良和进化具有重要意义。

基因组编辑技术为大麦的遗传改良提供了一种高效、精准的手段，而基因组学的研究则为深入了解大麦基因组的功能和调控机制提供了基础。

综述——精选推荐

综述综述-植物m6A甲基化酶功能进化及调控机制2019年5⽉，著名的⼩麦育种专家，来⾃西北农林科技⼤学作物遗传国家重点实验室的宋卫宁教授，在著名植物学期刊PBJ发表了植物m6A的最新综述。

这是迄今为⽌第⼀篇在植物⽅⾯最为完整的m6A综述，从甲基化酶的种类、基因的家族进化以及下游功能做了详细的描述。

联川⽣物将全⽂主要内容进⾏翻译，版权归宋教授团队所有，⽬的旨在于为植物⽅向进⾏m6A 甲基化研究的⽼师提供⼀些帮助。

摘要与总结N6‐methyladenosine也就是我们平时所说的m6A甲基化修饰，是RNA上⼀种⾮常重要的碱基修饰之⼀。

这种保守的转录后调控机制（post-tranion）可以调控许多真核⽣物的遗传信息。

近⼏年，植物中mRNA的m6A修饰是全球许多课题组关注的新热点。

与哺乳动物⼀样，植物中也存在m6A甲基化转移酶（writers）、去甲基化酶（erasers）和甲基化阅读蛋⽩（readers），这些蛋⽩的特征及功能是当前植物学研究中新的⽅向。

在可预见的未来，植物m6A的功能研究将迎来⼤爆发，这些基础研究的突破为作物性状改良提供强有⼒的理论⽀撑。

本⽂将系统分析总结近⼏年来，植物m6A相关甲基化酶结构与成分，以及这些酶在植物发育⽣物学、逆境胁迫应答等⽅⾯的⽣物学功能。

我们认为，从进化⾓度来看，不同植物中这些m6A 甲基化酶都⾼度保守。

前⾔RNA分⼦是所有⽣物的基本成分。

这些分⼦作为载体将遗传信息从DNA传递到蛋⽩质，并作为各种⽣物过程的调节器。

RNA转录物可能经历各种复杂的化学修饰，在过去的四⼗多年中⼈们已经在RNA中的各个阶段发现了160多种碱基修饰，如mRNA前体和成熟体阶，甚⾄在剪接过程发⽣之前都有存在RNA碱基修饰。

曾经由于受到仪器灵敏度以及⽅法学的限制，mRNA的化学修饰丰度较低导致RNA表观遗传学研究被整整滞后了⼏⼗年。

检测这种修饰的研究⽅法的局限性，导致⼈们忽略了这些修饰在mRNA表观遗传学中的重要性。

大麦种子萌发lncRNA-miRNA-mRNA差异表达分析及ceRNA调控网络构建

大麦种子萌发lncRNA-miRNA-mRNA差异表达分析及ceRNA调控网络构建张文英;高浩然;潘锐;常浩雯;徐乐【期刊名称】《长江大学学报:自然科学版》【年(卷),期】2022(19)6【摘要】为解析长链非编码RNA(lncRNA)、microRNA(miRNA)和mRNA如何在ceRNA互作模式下调控大麦种子萌发,揭示大麦(Hordeum vulgare L.)种子萌发转录水平分子调控机制,基于大麦种子萌发相关的RNA-Seq数据,共鉴定出6447个差异表达的mRNA,661个差异表达的lncRNA,310个差异表达的miRNA;对差异表达的mRNA和lncRNA进行加权基因共表达网络(WGCNA)分析,各鉴定到1个与大麦种子萌发高度相关的共表达模块。

模块内相关基因涉及水分响应、胚发育等生物学过程,以及MAPK信号转导、植物激素信号转导等信号通路。

通过对lncRNA/mRNA和miRNA进行靶基因预测,得到168个miRNA-mRNA靶基因对以及310个miRNA-lncRNA靶基因对,进而构建了包含2个子网络的ceRNA调控网络,发现有16个miRNA、38个lncRNA以及18个mRNA可能具有ceRNA功能。

最后,利用qRT-PCR验证了2个关系对:HORVU0Hr1G039470-miR2611-MSTRG.21252以及HORVU6Hr1G031480-miR1858-MSTRG.23227。

【总页数】9页(P94-102)【作者】张文英;高浩然;潘锐;常浩雯;徐乐【作者单位】长江大学作物抗逆技术研究中心【正文语种】中文【中图分类】Q786;S512.3【相关文献】1.胰腺癌特异性差异表达lncRNA相关的ceRNA调控网络的构建2.头颈鳞癌预后相关差异表达LncRNAs的筛选、ceRNA网络构建及生物学功能预测3.肾嫌色细胞癌ceRNA调控网络的构建与分析4.lncRNA HULC对肝癌细胞miRNA差异表达谱及ceRNA调控网络的影响5.乳腺浸润性导管癌中lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA网络的整合分析因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。