三、 质粒DNA的提取和电泳鉴定
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实验三 质粒DNA的提取和酶切鉴定
实验目的
▪ 掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法
▪ 掌握质粒的酶切鉴定
实验原理
▪ 碱裂解法是利用
质粒DNA与染色
体DNA在变性与
复性中的差异来
达到分离的目的。
染色体DNA 质粒DNA
实验原理
当菌体在NaOH-SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA 会发生变性。加入中和液（乙酸钾）后，质粒DNA
试剂中的主要成分和作用
▪ NaOH-SDS溶液：
①NaOH：溶解细胞，破坏核酸碱基配对使氢键断裂从而让核酸变性。 ②SDS：裂解细胞，结合蛋白质，形成SDS-蛋白质复合物。
▪ 乙酸钾溶液：
①乙酸：中和NaOH，使质粒DNA复性为可溶性DNA。 ②钾离子：置换了SDS的钠离子形成不溶性的PDS，将基因组DNA和蛋白 质沉淀下来。
配制1%琼脂糖凝胶：1g琼脂糖粉末+100mlTAE缓冲+5ulGoldView/gelred 染料。上样24ul（10ul 质粒DNA+2ul 6×Loading Buffer），120V稳压 电泳鉴定质粒DNA.
4.结果分析
实验和作业要求
▪ 实验报告在下次实验课前由学习委员统一收齐上交。
▪ 实验报告：原理（不要照抄实验手册）
为反向重复序列 ）特征。
2. 质粒的酶切鉴定：
质粒DNA酶切反应体系 ▪ 10酶切buffer 1 l
▪ 质粒DNA
▪ EcoR1（10u/l）
5 l
1 l
▪ BamH1（ 10u/l ） 1 l
▪ ddH2O加至
10 l
▪ 37℃水浴保温1h；72 ℃水浴15min终止反应。
3.电泳检测目的基因片段
实验原理
1. DNA的限制性酶切反应的原理
▪ 限制性内切酶（restriction enzyme) 是一类识别DNA上特异核 苷酸序列并产生切割反应的核酸内切酶(endonμclease)的总称。 ▪ 它能够识别并结合双链DNA分子中特异的核苷酸序列，在该 序列内部水解核苷酸之间的3,5-磷酸二酯键，切断DNA双链结 构。 ▪ 限制性内切酶识别的DNA序列一般长度为4~6个核苷酸，具有 回文结构（双链DNA中含有的二个结构相同、方向相反的序列，或称
10%SDS+800μl 双蒸水）溶液，颠倒混匀10次，冰浴5min。动作轻
柔，同时控制好时间！
6. 加入 150μl 预冷的乙酸钾溶液，充分颠倒混匀，冰浴 5min。一定要
充分混匀！
实验步骤
7.
8. 9.
4℃，12000rpm离心5min，取上清300μl 转移至另一支新的EP 管中。
加等体积异丙醇，冰浴20min，12000rpm离心5min，弃上清 液。 缓慢加入70%乙醇0.5ml，轻轻上下颠倒， 12000rpm离心 1min，吸弃大部分上清，挥干剩余乙醇。注意不要吹打沉淀！
实验方法（可附加流程图） 结果（电泳鉴定需要附图） 讨论（实验失败要分析原因）
Thanks for yoμr attention
最后沉淀不要过于干燥！
10. 用10μl 含有RNase的TE溶液溶解沉淀的DNA，37 ℃ 水浴 10min，以降解RNA分子 。
试剂中的主要成分和作用
▪ GTE缓冲液：
①Tris-HCl溶液：调节pH。
②葡萄糖：使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部。
③EDTA：二价金属离子螯合剂，抑制DNase活性。
试剂中的主要成分和作用
▪ RNase溶液：水解上清中小分子RNA。 ▪ 异丙醇：快速沉淀质粒DNA，但难以挥发。 ▪ 70%乙醇：去除异丙醇，且易于挥发除去。 ▪ TE缓冲液：溶解质粒DNA沉淀，含有EDTA 能够使DNA保存时间更长。
注意事项
▪ NaOH-SDS溶液处理时间不能太长，且不能激烈震荡，否则会断 裂基因组DNA使之混入质粒DNA中。 ▪ 加入预冷乙酸钾后要充分颠倒混匀，以中和NaOH，沉淀蛋白质 和染色体DNA等。 ▪ 70%乙醇洗涤时不要吹打质粒DNA沉淀，否则DNA会溶解在水中。 同时DNA沉淀不能太过干燥，否则影响TE溶液溶解。
分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；
而染色体 DNA 、大分子 RNA 以Biblioteka Baidu蛋白质 -SDS 复合 物等形成沉淀，可通过离心去除。
实验步骤
1. 在含相应抗生素（ Amp ）的 LB 中接入一单菌落（白色），于 37℃ 剧 烈振摇下培养过夜。 2. 取1.5ml对数生长期的菌体于 Eppendorf 管中，8000rpm 离心1min， 收集菌体。 3. 4. 5. 弃上清液，将EP管倒置在吸水纸上，吸干溶液。 加入100μl GTE缓冲液，轻轻吹打重悬菌体，室温放置5min。 加 入 200μl 新 鲜 配 制 的 NaOH-SDS （ 100μl 2mol/L NaOH+100μl
实验目的
▪ 掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法
▪ 掌握质粒的酶切鉴定
实验原理
▪ 碱裂解法是利用
质粒DNA与染色
体DNA在变性与
复性中的差异来
达到分离的目的。
染色体DNA 质粒DNA
实验原理
当菌体在NaOH-SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA 会发生变性。加入中和液（乙酸钾）后，质粒DNA
试剂中的主要成分和作用
▪ NaOH-SDS溶液：
①NaOH：溶解细胞，破坏核酸碱基配对使氢键断裂从而让核酸变性。 ②SDS：裂解细胞，结合蛋白质，形成SDS-蛋白质复合物。
▪ 乙酸钾溶液：
①乙酸：中和NaOH，使质粒DNA复性为可溶性DNA。 ②钾离子：置换了SDS的钠离子形成不溶性的PDS，将基因组DNA和蛋白 质沉淀下来。
配制1%琼脂糖凝胶：1g琼脂糖粉末+100mlTAE缓冲+5ulGoldView/gelred 染料。上样24ul（10ul 质粒DNA+2ul 6×Loading Buffer），120V稳压 电泳鉴定质粒DNA.
4.结果分析
实验和作业要求
▪ 实验报告在下次实验课前由学习委员统一收齐上交。
▪ 实验报告：原理（不要照抄实验手册）
为反向重复序列 ）特征。
2. 质粒的酶切鉴定：
质粒DNA酶切反应体系 ▪ 10酶切buffer 1 l
▪ 质粒DNA
▪ EcoR1（10u/l）
5 l
1 l
▪ BamH1（ 10u/l ） 1 l
▪ ddH2O加至
10 l
▪ 37℃水浴保温1h；72 ℃水浴15min终止反应。
3.电泳检测目的基因片段
实验原理
1. DNA的限制性酶切反应的原理
▪ 限制性内切酶（restriction enzyme) 是一类识别DNA上特异核 苷酸序列并产生切割反应的核酸内切酶(endonμclease)的总称。 ▪ 它能够识别并结合双链DNA分子中特异的核苷酸序列，在该 序列内部水解核苷酸之间的3,5-磷酸二酯键，切断DNA双链结 构。 ▪ 限制性内切酶识别的DNA序列一般长度为4~6个核苷酸，具有 回文结构（双链DNA中含有的二个结构相同、方向相反的序列，或称
10%SDS+800μl 双蒸水）溶液，颠倒混匀10次，冰浴5min。动作轻
柔，同时控制好时间！
6. 加入 150μl 预冷的乙酸钾溶液，充分颠倒混匀，冰浴 5min。一定要
充分混匀！
实验步骤
7.
8. 9.
4℃，12000rpm离心5min，取上清300μl 转移至另一支新的EP 管中。
加等体积异丙醇，冰浴20min，12000rpm离心5min，弃上清 液。 缓慢加入70%乙醇0.5ml，轻轻上下颠倒， 12000rpm离心 1min，吸弃大部分上清，挥干剩余乙醇。注意不要吹打沉淀！
实验方法（可附加流程图） 结果（电泳鉴定需要附图） 讨论（实验失败要分析原因）
Thanks for yoμr attention
最后沉淀不要过于干燥！
10. 用10μl 含有RNase的TE溶液溶解沉淀的DNA，37 ℃ 水浴 10min，以降解RNA分子 。
试剂中的主要成分和作用
▪ GTE缓冲液：
①Tris-HCl溶液：调节pH。
②葡萄糖：使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部。
③EDTA：二价金属离子螯合剂，抑制DNase活性。
试剂中的主要成分和作用
▪ RNase溶液：水解上清中小分子RNA。 ▪ 异丙醇：快速沉淀质粒DNA，但难以挥发。 ▪ 70%乙醇：去除异丙醇，且易于挥发除去。 ▪ TE缓冲液：溶解质粒DNA沉淀，含有EDTA 能够使DNA保存时间更长。
注意事项
▪ NaOH-SDS溶液处理时间不能太长，且不能激烈震荡，否则会断 裂基因组DNA使之混入质粒DNA中。 ▪ 加入预冷乙酸钾后要充分颠倒混匀，以中和NaOH，沉淀蛋白质 和染色体DNA等。 ▪ 70%乙醇洗涤时不要吹打质粒DNA沉淀，否则DNA会溶解在水中。 同时DNA沉淀不能太过干燥，否则影响TE溶液溶解。
分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；
而染色体 DNA 、大分子 RNA 以Biblioteka Baidu蛋白质 -SDS 复合 物等形成沉淀，可通过离心去除。
实验步骤
1. 在含相应抗生素（ Amp ）的 LB 中接入一单菌落（白色），于 37℃ 剧 烈振摇下培养过夜。 2. 取1.5ml对数生长期的菌体于 Eppendorf 管中，8000rpm 离心1min， 收集菌体。 3. 4. 5. 弃上清液，将EP管倒置在吸水纸上，吸干溶液。 加入100μl GTE缓冲液，轻轻吹打重悬菌体，室温放置5min。 加 入 200μl 新 鲜 配 制 的 NaOH-SDS （ 100μl 2mol/L NaOH+100μl