(仅供参考)结核病的分子诊断技术进展
肺结核的分子诊断方法研究
肺结核的分子诊断方法研究肺结核是一种由结核菌引起的慢性感染疾病，其传染性强且易复发。
目前，传统的肺结核诊断方法常常受限于样本采集、检测时间和结果准确性等方面的问题。
因此，研究人员开展了许多研究来寻找更加快速、准确和便捷的肺结核分子诊断方法。
一、核酸检测方法的发展1. PCR技术的应用PCR（聚合酶链反应）是一种广泛应用的分子生物学技术，可以扩增微量的目标DNA序列。
在肺结核的分子诊断中，PCR技术被广泛应用于寻找结核菌的特征基因。
2. LAMP技术的突破LAMP（核酸等温扩增）技术是一种新型的DNA扩增技术，具有高度敏感性和特异性。
该技术可以通过特异性引物和DNA聚合酶，在等温条件下迅速扩增目标序列，并可通过肉眼观察结果。
二、蛋白质检测方法的发展1. 免疫学技术的应用免疫学技术在肺结核的分子诊断中发挥着重要作用。
例如，ELISA （酶联免疫吸附测定法）可以检测特定肺结核相关蛋白质的存在，并且具有较高的灵敏性和特异性。
2. 质谱技术的突破质谱技术在肺结核蛋白质检测中具有独特优势。
通过质谱分析，可以检测肺结核相关蛋白质的质量和结构，并获得高度准确的结果。
三、近年来的研究进展1. 基于核酸检测的新方法近年来，研究人员提出了一种新型的核酸检测方法，称为数字PCR。
它通过将DNA样本分成大量微小的反应区域，使得PCR扩增反应变得更加精确和稳定。
这一方法在肺结核的分子诊断中显示出了良好的应用前景。
2. 基于蛋白质检测的新方法除了传统的免疫学技术和质谱技术外，研究人员还提出了一种新型的蛋白质检测方法，称为光纤免疫传感技术。
该技术利用基于光纤的传感器检测血液中蛋白质的浓度，并且可以实时监测肺结核相关蛋白质的变化。
综上所述，随着科学技术的不断进步，肺结核的分子诊断方法得到了巨大的发展。
核酸检测方法和蛋白质检测方法的应用为肺结核的早期诊断和治疗提供了更好的手段。
未来，我们可以期待更多创新的肺结核分子诊断方法的出现，进一步提高肺结核的诊断效率和精确性，为肺结核的防治工作做出更大贡献。
结核病分子病理学诊断技术临床应用进展
结核病与胸部肿瘤2019年第1期Tuber&ThorTumor,Mar2019,No.l•73••综述•结核病分子病理学诊断技术临床应用进展宋妹车南颖结核病(tuberculosis,TB)已经存在数千年.仍然是全球十大死因之一，死亡率在传染性疾病中排名第一，严重威胁人类健康⑴。
病理学是诊断结核病的重要途径.尤其在痰菌阴性肺结核和肺外结核等疑难患者的诊断中发挥了重要作用⑵。
传统的结核病病理学诊断主要依靠常规病理学及抗酸染色，可与其他常见的肿瘤和感染性疾病进行鉴别⑴；但与其他一些肉芽肿性疾病，例如非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacteria,NTM)病的鉴别诊断中遇到很多困难。
随着分子生物学与病理学的相互交叉渗透，20世纪70年代利用分子生物学技术研究疾病病因、发病机制、形态变化及功能损伤规律的新分支学科——分子病理学诞生闵。
近年来，分子病理学技术发展迅速；在2017年发表的《中国结核病病理学诊断专家共识》中提出，分子病理学检测是病理学确诊结核病的主要依据。
分子病理学可以有效解决结核病与NTM病的鉴别诊断，以及耐药结核病的诊断等传统病理学所无法完成的难题I4)o 笔者从分子病理学诊断结核病、NTM病及耐药结核病等3个方面对近几年分子病理学诊断技术在临床中的应用进展做一简要综述。
1分子病理学诊断结核病TB的早期诊断是临床治疗的关键，分子病理学技术是诊断TB快速、有效的方法。
随着分子生物学技术的不断发展，新的PCR及其衍生技术的应用，进一步提高了TB病理学诊断的敏感度和特异度。
1.1常用PCR技术PCR是一种体外扩增特异DNA片段的技术，可在短时间内将一个或几个结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)DNA 拷贝扩增到百万数量级。
为了提高PCR诊断的敏感度和特异度，基于普通PCR的新型分子诊断技术大量涌现。
实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时监测实现对起始模板定性及定量的分析；巢式PCR通过设计“外侧”、“内侧”两对引物进行2次PCR扩增，提高了微量靶序列检岀的敏感度和特异度。
分子诊断技术的最新进展
分子诊断技术的最新进展分子诊断技术是当今医学领域中最为热门的研究方向，也是未来医疗发展的一个重要方向。
该技术可以通过检测和分析体内的分子物质，为疾病的早期诊断和治疗提供了可能。
在最近的几年里，分子诊断技术得到了快速发展，不断涌现出新的技术和方法，为我们开启了新的窗口。
本文将以该领域的最新进展为主题，并从多个角度介绍它的研究方向及未来趋势。
一、NGS技术+全基因组测序随着NGS技术的不断成熟，全基因组测序在分子诊断领域得到了广泛的应用。
在疾病的诊断和治疗中，全基因组测序可以快速而准确地确定患者的基因组序列，为分子诊断提供了更为精确的参考。
当前，在全基因组测序领域最为注目的是单细胞测序技术，它可以实现对单个细胞的基因组测序。
可用于检测早期肿瘤的突变，还可用于个体化医学，为不同患者提供不同的治疗方案。
二、CRISPR-Cas9CRISPR-Cas9技术是当前最具热门的基因编辑技术之一，是一种基于RNA的程序化核酸切割工具。
该技术可以快速而准确地定位并切割DNA序列，从而在基因水平上实现对疾病的治疗。
该技术可以用于修复有缺陷的基因，防止遗传疾病的传播，甚至在对抗癌症等方面具有潜力。
目前，CRISPR-Cas9技术正在经历着从实验室研究到临床试验的转变。
值得一提的是，文献报道了利用该技术可以将异常细胞的基因修正为正常细胞，从而制造一种自我改善的生物体。
三、芯片技术芯片技术是一种将分子生物学、电子技术和计算机技术相结合的技术，其主要功能是将分子物质固定在特制的微型管壁上，以实现分子的快速检测和分析。
芯片技术可以通过微型反应腔的灵活设计，将多个生物分子相互干扰的反应隔离开，以更加精确地检测和分析生物分子的性质。
四、蛋白质组学技术除了基因组学技术外，蛋白质组学技术也是目前研究最为活跃的分子诊断技术之一。
该技术以质谱为核心，通过检测和分析蛋白质的性质，从而探索其在疾病诊断和治疗中的应用。
可用于分离蛋白质，鉴定其分子量和特定的质量分子以获得蛋白质的序列信息，从而获得更多关于蛋白质功能和性质的研究。
结核病的诊断与治疗进展
结核病的诊断与治疗进展结核病是一种由结核分支杆菌引起的慢性传染病，一直以来都是全球公共卫生领域的重大挑战。
虽然在过去几十年中，取得了一定的进展，但结核病的诊断和治疗仍然存在许多挑战。
本文将介绍一些关于结核病诊断和治疗的新进展，并探讨其对临床实践的影响。
一、结核病的诊断进展近年来，结核病的诊断技术得到了不断改进和更新，以提高其准确性和敏感性。
以下是一些值得关注的进展：1. 分子诊断技术的应用分子诊断技术，如聚合酶链反应(PCR)和基因测序，已被广泛应用于结核病的诊断。
这些技术可以快速检测结核分支杆菌的DNA，从而提高了病原体的检出率。
此外，分子诊断技术还可以检测结核菌的耐药基因，帮助医生选择合适的抗结核药物治疗。
2. 图像学诊断技术的改进传统的结核病诊断主要依靠胸部X射线和CT扫描结果。
然而，这些技术在早期病例和病灶部位不典型的病例中存在一定的局限性。
近年来，随着磁共振成像(MRI)和正电子发射断层扫描(PET-CT)等图像学诊断技术的发展，结核病的早期诊断和病灶定位变得更加精确。
3. 快速诊断试剂的研发为了满足迅速、准确诊断结核病的需求，许多快速诊断试剂被研发出来并广泛应用。
这些试剂基于免疫学、生物化学和分子生物学原理，可以在短时间内检测结核分支杆菌、其代谢产物、抗结核药物和结核菌的抗药性。
二、结核病的治疗进展结核病的治疗主要依赖于药物治疗，但易感或耐药菌株的出现增加了治疗的复杂性。
针对这些挑战，研究人员取得了一些重要的进展，包括以下方面：1. 新型药物的研发近年来，一些新型抗结核药物被开发出来，并已经逐渐用于临床治疗。
例如，耐药结核病的治疗常常需要使用二线抗结核药物，但其疗效和耐受性有限。
而新型药物，如利福平和庆大霉素，对耐药菌株具有更好的治疗效果。
此外，还有一些正在研发中的新药物，被寄予了厚望。
2. 治疗方案的个体化结核病治疗的个体化成为了一个研究热点。
根据患者的耐药情况和疗效监测，制定更为科学的治疗方案。
结核病实验室诊断技术研发进展
结核杆 菌培养是诊 断结核病 的金标 准 ， 但传 统 的罗 氏培 养需要 ４～ ６周 的培养方能 检测 到结 核菌 的生长 。 目前 正在
推广 的液体培养系统 仅需 １ —３周 ， 更加敏 感 、 快速 。早 期 的
Ｂ Ｃ Ｅ －６ 由于具有 放射 性 而 限制 了其应 用 。Ｍ Ｉ Ａ Ｔ Ｃ４ ０法 Ｇ Ｔ为 ｍ ｃｂｃ ｒ ｌ ｒ ｔ ｉｄｃｔ ｂ ｙｏａｔ ｉ ｏ ｈ ｎ ｉ ｏ ｔ ｅ的简称 ， ｅａ ｇ ｗ ａ ｒｕ 其原 理是 Ｊ试 管 ： 底部的荧光复合物与氧气结 合时处 于淬灭状 态 ， 当结核 菌生 长时 ， 氧气逐渐减少 ， 荧光 复合 物就发出荧光 而被 检测 到。 自 动化的 ＭＧＴ还可 加入 临 界浓 度 的抗 结核 药物 进 行药 敏 分 Ｉ 析。Ｂ Ｄ公 司 推 出的 Ｂ Ｃ Ｅ － Ｉ ６ Ａ Ｔ Ｃ ＭＧＴ ９０全 自动分 枝杆 菌 培 养／ 鉴定／ 药敏系统操作简便 ； 阳性标本检出时间平均为 ９天 ；
诊断性能优于标准荧光显微镜。多项研究经 ｍ ｔ ｅ ａ分析显示 ： Ｌ Ｄ检查 的敏感 性 比传 统镜 检方法 高约 １ ％… 。同时具 备 Ｅ ０ 荧光染色的优点 ， 且花 费低 、 可实施性 强 ， 可更广泛 的常规 使 用。中国卫 生部 一 茨基金会 和中国卫 生部 一 国梅 里埃 基 盖 法 金会结核病防治项 目已准备将 Ｌ Ｄ显微 镜在 我 国基 层实 验 Ｅ
室推广。 二 、 枝 杆 菌 培 养 技 术 研 发 进 展 分
扩增反应在 等温条 件下进行 ， 不需 要专 门的 Ｐ Ｒ仪 ， Ｃ 只需一 个水浴 锅或 简单 的保 温桶 和温度计 ； 其结果可以肉眼读值 ： 通 过 生成 的焦磷 酸盐置换锰 离子 ， 使与之结 合的钙黄绿素 （ ａ— Ｃｌ ｃｉ） ｅ 游离 而发 出荧光 Ｊ也可通过 加人 核酸燃料 Ｓ Ｂ ｒｅ ｎ ， Ｙ ＲＧ ｅｎ Ｉ 或产生 白色混浊焦磷酸镁沉淀进行 肉眼观察或实时浊度计 观察 。其对于发展 中国家而言是一项分子检测结核杆菌的很 有前景 的方法 。 文献报 道 Ｌ ＭＰ的 总 特 异 性 为 ９ ％ Ｊ 总 敏 感 性 为 Ａ ９ ， ８ ．％ ， 中在痰涂 片 阴性 、 ８２ 其 培养 阳性 病 例 中 的敏 感性 只 有 ４ ． ％ ， 在 痰 涂 片 阳性 、 养 阳 性 病 例 中 的 敏 感 性 达 ８８ 但 培 ９ ． ％ 。中国卫生部 一盖茨基金会和 中国卫生部 一法 国梅里 ７７ 埃基金会结核病防治项 目已将 Ｌ Ｍ Ａ Ｐ列 入我国基层实验室推
结核病诊断技术新进展
结核病诊断技术新进展
摘要：结核病疫情亟需快速、有效的诊断方法,但长久以来其诊断一直依靠传统的结核分枝杆菌抗酸染色涂片和培养技术,并不能满足快速诊断的需要。
为解决这个全球性的问题,近年来出现了多种结核病新的诊断技术和方法,如新的影像学检查及计算机辅助技术、显微镜学诊断技术、结核分枝杆菌快速培养技术、免疫学诊断技术,以及结核分枝杆菌特异性核酸扩增技术。
本文主要介绍几种最有代表性的技术和方法,其中部分技术已获得世界卫生组织（World Health Organization,WHO）的推荐,部分正在进行大规模临床研究或验证,反映了近年来结核病诊断发展的新方向。
-HAIN技术刘三宝
主讲人：刘三宝 时间：2019年10月25日
结核病现有诊断技术
结核杆菌菌体 结核杆菌活菌 结核杆菌核酸 细胞免疫
痰涂片 镜检
培养
分子诊断
IGRA
敏感性低 不能区分 MTBC和
NTM
金标准 耗时长 操作繁琐
敏感快捷 但技术仪 器要求高
可检测耐药
不能区分 潜伏感染 和活动性
kat G katG WT katG MUT1 katG MUT2
inhA inhA WT1 inhA WT2 inhA MUT1 inhA MUT2 inhA MUT3A inhA MUT3B
TUB
r poB MUT k at G WT k at G MUT inhA WT inhA MUT
sensi t i ve
gyrA
DNA-Gyrase A
appr.80-90%
利福平：rpoB基因 编码结核分枝杆菌RNA聚合酶β亚单位 利福平耐药的90~95%由该基因突变引起 集中于509~533的利福平耐药决定区
常见突变位点及频率从高至低依次为： 531位、526位、516位、513位、533位
GenoType® MTBDRplus检测： 1.野生型位点: WT1~WT8 2.耐药突变位点: 531、526A、526B、516
异烟肼：katG和inhA基因 katG基因：编码触酶-过氧化物酶
40-100%异烟肼耐药是由该基因突变引起且为高水平耐药
inhA基因：编码NADH烯酰基ACP还原酶 25%异烟肼耐药是由该基因突变引起且为低水平耐药
MTBDRplus katG
野生探针 KatG WT
应斌武教授-结核病的分子诊断技术进展
结核感染T细胞检测 细胞检测
ELISA对全血中致敏T细胞再次 受到结核特异性抗原刺激后所释 放的IFN-γ水平进行检测。
IGRA
ELISPOT在结核菌特异性抗原刺 激下, 测定外周血单个核细胞中 能够释放IFN-γ的效应T细胞数量。
T-SPOT.TB
IFN-γ是参与结核病发病的一个细胞因子。效应T细胞被近期 暴露的抗原在体外再次刺激后会释放γ干扰素。
四、华西医院结核病诊断的临床应用及研究进展
我院的结核及耐药实验室检测流程
患者临床标本
直接检测 核酸
Ziehl-Neelsen 染色 显微镜检查
MGIT960 液体培养
IGRA
核酸提取 及纯化
AFB阴性
AFB阳性
培养阳性
培养阴性
阴性有排除结 核病的价值 阳性提示结核 感染或结核病
实时荧光 PCR 阴性 阳性
基于TB-DNA的MTB鉴定及分子药敏技术
1. Line probe assays线性探针测定法 Hain（LPA GenoType® MTBDRplus/Rsl）技术
2h
0.5 h
2.5-3 h
WHO建议使用Hain来检测 MDR-TB
基于TB-DNA的MTB鉴定及分子药敏技术 2. Xpert MTB/RIF
Xpert XDR
可以检测异烟肼，氟喹诺酮类药物和二线注射剂的耐药 测定正在开发中，尚未被WHO评估。 初步敏感性和特异性(与测序相比，尚未经同行评议): 异烟肼98.1%，100% 氟喹诺酮95.8%，100% 卡那霉素92.7%，100% 阿米卡星96.8%，100% 预计2018年面世
DNA作为分子诊断靶标的技术
2.环介导恒温扩增 LAMP 技术
结核诊断新进展：无需找到结核菌也能确诊，分子技术助力结核诊断
结核诊断新进展：无需找到结核菌也能确诊，分子技术助力结核诊断随着科技的进步，所有的临床疾病的诊断已经全面进入分子时代，所谓的分子时代是指利用分子生物技术，寻找疾病极其微量的分子层面的线索，尽量提高疾病的诊断准确性，同时又能增加敏感度，使原来无法诊断或者准确诊断的疾病得到诊断，或者提高准确度，是指得到更好的治疗，比如癌症的诊断已经利用基因检测相关技术进入了精准医疗时代，以前只能做放化疗的病人，如今可以通过基因检测获得靶向治疗等新治疗方法并成功延长生命的机会。
肺结核的诊断也进入了分子时代前天医院内举行了一次呼吸沙龙，与往届不同的是，此次和检验科以及结核科共同举办，会上著名的结核科诊治专家沙巍主任详细的介绍了结核领域诊断和治疗的新方法，重点强调了肺结核的诊治已经进入分子时代，新技术层出不穷，不但有结核的诊治技术进展，也有结核以及肺结核分枝杆菌菌型鉴定进展，部分肺结核患者无需发现完整的结核菌也可以确诊诊断，甚至能够通知得到该结核菌是否对抗结核药物耐药的信息。
X-pert技术助力结核分子诊断新的结核诊治共识中强调结核诊断已经可以通过分子技术获得确诊，如果患者有典型的结核CT表现，即使无法从临床收集到的标本中找到结核菌，也可以通过X-pert技术确诊结核，同时获得是否对利福平耐药的信息，这是一种什么技术呢，为什么如此神奇。
Xpert MTB/RIF检测是一种分子信标检测方法，可用于检测结核分枝杆菌和位于rpoB基因81-bp区域(密码子426-452)的利福平耐药突变，该区域被称为利福平耐药决定区(rifampicin resistance–determining region, RRDR)。
该检测可用于疑似或已接受抗分枝杆菌治疗少于3日的疑似肺结核成人的痰抗酸杆菌涂片阳性或阴性样本(直接或浓缩样本，可为自发产生或诱导)。
Xpert MTB/RIF检测在2011年得到了WHO的批准，并在2013年得到了美国FDA的批准。
结核病分子诊断研究进展
结核病分子诊断研究进展梅珍珍【期刊名称】《湖北科技学院学报（医学版）》【年(卷),期】2017(031)001【总页数】5页(P88-92)【关键词】结核病;分子诊断技术;进展【作者】梅珍珍【作者单位】咸宁市结核病院,湖北咸宁437000【正文语种】中文【中图分类】R521结核病是威胁人类健康的主要传染性疾病之一，自上世纪50年代抗生素疗法问世后，其发病率和死亡率已显著降低，然而，最近20多年来，结核病疫情大有卷土重来之势，全球的流行形势十分严峻[1]。
及时发现、治疗和隔离患者是控制结核病的有效手段，而结核病诊断是发现和治疗患者的前提。
近些年，分子诊断技术发展十分迅速，为结核病和耐药结核的快速诊断提供了重要手段。
现将目前结核病分子诊断进展介绍如下：Xpert Mtb/RIF是一项发展十分迅速的结核病及耐药结核病的全自动快速分子诊断方法，该技术具有操作简便，检测快，结果准等优点，手工操作部分仅需5min，而全过程只需90min即可完成Mtb特异核酸检测和利福平耐药基因rpoB突变的检测。
因此，该技术迅速得到认可及推广使用。
2010年12月，WHO批准了Xpert Mtb/RIF技术的应用。
2013年7月，Xpert Mtb/RIF技术通过了美国食品药品监督管理局(FDA)的认证。
Xpert Mtb/RIF可在2h内得到检测结果、敏感度高、潜力巨大，目前已在结核病患病率较高的67个国家推广实施[2]。
Xpert Mtb/RIF技术诊断结核病具有检测限低，灵敏度和特异度高的优点。
Van等[3]在研究中发现Xpert MTB/RIF检测法的检测低限可低至痰液中100个细菌/mL。
Chang等[4]的meta分析显示，Xpert Mtb/RIF法诊断肺结核总敏感度为90.4%，特异度为98.4%，而在肺外结核诊断中合并敏感度和特异度分别为80.4%和86.1%。
新加坡Teo等[5]对162份标本的诊断比较研究结果表明，与Mtb直接试验(MTD)检测(灵敏度97.3%、特异度87.1%)相比，运用Xpert Mtb/RIF技术(灵敏度90.9%、特异度89.0%)也可以准确诊断。
结核病分子生物学检测技术研究进展
基于上述研究 在检测涂片阳性肺结核 显示 和 B-J*++/
'PE1E`;EDC
结核病的诊断与抗结核治疗新进展
结核病的诊断与抗结核治疗新进展随着医学科技的不断进步和研究的不断深入，结核病的诊断与抗结核治疗也在不断取得新的进展。
在本文中，我们将探讨结核病的诊断方法和新的抗结核治疗方案。
一、结核病的诊断方法1. 临床症状与体征结核病的典型症状包括慢性咳嗽、咳痰、咯血、低热、乏力等。
体征方面，患者可能出现体重下降、纳差、肺部啰音等。
临床医生可以通过详细询问患者病史和进行体格检查来了解病情，但这些症状和体征并非特异性，因此需要结合其他方法进行诊断。
2. 结核菌素试验结核菌素试验是一种常用的结核病辅助诊断方法。
该试验通过皮内注射结核菌素（PPD），根据注射部位出现的硬结或红斑的大小和硬度来判断患者是否感染结核分枝杆菌。
然而，结核菌素试验的结果可能受到多种因素的影响，例如BCG疫苗接种、非结核分枝杆菌感染等，因此需要结合其他检测方法进行综合判断。
3. 结核病病原学检测近年来，分子生物学的进展使得结核病的病原学检测更加准确和迅速。
PCR（聚合酶链反应）技术可以检测结核分枝杆菌的核酸，其灵敏度和特异性高于传统的培养方法。
此外，还可通过基因测序等方法进行鉴定和鉴别。
4. 影像学检查胸部X线和CT扫描是常用的结核病影像学检查方法。
通过检查肺部的阴影、空洞、结节等变化，可以辅助诊断结核病。
此外，还可以利用PET-CT技术评估病变活动性，判断治疗效果。
二、抗结核治疗的新进展1. 药物疗法目前，抗结核治疗的首选药物包括异烟肼、利福平、吡嗪酰胺等。
然而，由于结核分枝杆菌的耐药性问题日益严重，传统的治疗方案逐渐无法满足临床需求。
因此，近年来针对耐药结核病的新一代抗结核药物不断涌现。
例如利福昔明、贝达替尼等药物，对多药耐药结核病和极耐药结核病显示出良好的疗效。
2. 联合治疗方案联合抗结核治疗是目前常用的治疗策略之一。
根据药物敏感性测试结果，将多种抗结核药物联合应用，以降低治疗失败和耐药的风险。
此外，联合抗病毒治疗也被用于治疗HIV与结核病共感染的患者，以防止疾病的恶化和复发。
结核病实验室诊断技术进展
结核病实验室诊断技术进展结核病是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，其发病规律和流行特点决定了在今后相当长的时期内其危害将持续存在。
结核病被列为我国重大传染病之一，是严重危害人民群众健康的呼吸道传染病。
世界卫生组织的统计资料显示，约三分之一的世界人口曾经感染结核菌，亚洲地区感染者占全世界的三分之二。
据WHO估计，2007年全球约有927万新发结核患者，175万人死于结核病，我国是全球22个结核病流行严重的国家之一，同时也是全球27个耐多药结核病流行严重的国家之一。
目前我国三分之一左右的人口已感染了结核菌，受感染人数超过4亿。
据研究，受结核菌感染的人群中，10%的人会发展为结核病。
我国现有肺结核病人约500万，主要集中在25岁及以上人群；每年约有13万人死于结核病，死亡平均年龄为55.2岁。
如果不采取有效的控制措施，在未来的10年，我国可能有近5000万的感染者发生结核病。
历年来全国结核病流行病学调查结果显示，全国肺结核患病率继续呈现下降趋势。
特别是传染性肺结核患病率下降尤为明显，由2000年的122/10万下降到66/10万，十年降幅近50%。
结核分枝杆菌从分类上看是分枝杆菌科、分枝杆菌属中引起人类患病最多的致病菌。
结核病实验室检查，尤其是细菌学检查是结核病诊断的最主要和最基本技术，也是选择治疗方案、考核疗效、评价防治效果的主要指标。
目前结核病实验室检查技术包括：全菌体为基础的病原微生物学检测、细菌核酸为靶标的分子生物学检测和机体免疫相关反应及其产物的检测。
一、全菌体为基础的病原微生物学检查技术与其它传染性疾病相同，从检测原理和临床检验目的上，结核病的病原微生物学检查，分为基于形态学的显微镜镜检、基于微生物表型的分离培养、药物敏感性实验和菌种鉴定实验。
1. 分枝杆菌形态学检查——抗酸染色镜检：是结核病临床诊断最基本的方法之一，简单快速，在不考虑生物安全防护的前提下，２-４小时即可发报告，对于结核病的诊断、指导和评价临床用药具有重要意义。
结核病实验室诊断技术新进展
染者全血或单个核 细胞体 外 ３ ℃ 孵育过 夜 ， 定致敏 Ｔ细 ７ 测
胞 受抗原刺激后 ＩＮ一 释放水平 ， 而判 定是否有 ＭＴ Ｆ 从 Ｂ感 染。Ｉ Ｒ Ｇ Ａ的刺激抗原分 为 Ｐ Ｄ和特 异 ＭＴ Ｐ Ｂ抗原 两类。前 者存在 的缺 点与 Ｔ相 同 ， 不能 区分 出 Ｍ Ｂ潜伏感 染者与 Ｔ
一
酸杆菌均可着色， 需进一 步试验才可确 定是否为结核 菌。此
方 法 由于检 测 原 理 的 限制 ， 不可 能 出现 突破 性 的进 展 。
１２ 痰结核 菌常规培 养法 是 鉴定死 茵活菌的 “ 标 准” ． 金 。
缺 点 是 时 间 长 ， ２—８周 才 能报 出 结 果 ， 敏 感 性 低 ， 片 需 且 涂
采用双重皮试法 ， Ｐ Ｄ引起 的反 应扣 除迟发致敏素 引起的 将 Ｐ 反应后作 出诊 断， 一定程度上提 高了Ｐ Ｄ的特性。 Ｐ ２ ２ ２ ＩＮ一 释放试验（Ｇ Ｕ） 即用 ＭＴ ．． Ｆ Ｉｒ Ｂ抗原与 可疑感
性水平。这项试验通 常在痰结核茵培养的基础上进行 ， 需 故
菌素（ Ｔ 和第二代 纯蛋 白衍 生物 （ Ｐ ， Ｐ Ｏ） Ｐ Ｄ） Ｐ Ｄ是 Ｏ Ｔ滤液的 沉淀物 ， Ｏ 比 Ｔ的效价更稳 定， 有更 高的敏感性和特异性 。近
一
个世纪来， ｓ Ｔ Ｔ一直是诊 断 Ｍ Ｂ感染 的传 统方 法之 一， Ｔ 常
用于辅助诊 断 Ｍ Ｂ感染、 Ｔ 筛选 Ｂ Ｇ接 种对 象、 Ｃ 了解接种效果、 作流行病 学调 查等。但 由于 Ｐ Ｄ 中的 大多数蛋 支 Ｔ 杆 菌感染及 Ｂ Ｇ接种方面还存在特异性差的问题 ， Ｃ 以及 １％ ０
１４ 分支杆菌菌种鉴定 利 用分子 生物 学技 术可精 确地鉴 ． 定分支杆菌的不同菌种， 操作复杂。 但 １５ 痰结核菌快速培养 系统 ２ ． ０世纪 ７ ０年代发展 的一种 新的结核病细菌学检查 方法。该 系统根 据分 支杆 菌生长 时
结核病的快速诊断与治疗进展
结核病的快速诊断与治疗进展结核病是一种由结核分枝杆菌引起的传染性疾病，长期以来一直对全球公共卫生构成严重威胁。
随着医学技术的不断进步，结核病的诊断和治疗方法也在不断发展和完善。
本文将探讨结核病的快速诊断与治疗进展，以期为结核病的防控提供有益的参考。
一、结核病的快速诊断方法1、涂片镜检涂片镜检是结核病诊断中最常用的方法之一。
通过对患者的痰液、脓液、脑脊液等标本进行涂片，然后用抗酸染色法染色，在显微镜下观察是否有抗酸杆菌。
这种方法简单、快速、成本低，但灵敏度较低，容易漏诊。
2、培养法结核菌培养是诊断结核病的“金标准”，但培养周期较长，通常需要2-8 周。
近年来，一些新型的培养技术如液体培养法和自动化培养系统的应用，大大缩短了培养时间，提高了检测的灵敏度和特异性。
3、分子生物学检测（1）聚合酶链反应（PCR）PCR 技术可以快速检测标本中结核分枝杆菌的 DNA，具有高灵敏度和特异性。
然而，PCR 技术容易出现假阳性和假阴性结果，需要严格的质量控制。
（2）核酸探针技术核酸探针技术是利用特异性的核酸探针与标本中的结核分枝杆菌DNA 或 RNA 杂交，从而检测结核分枝杆菌的存在。
该方法具有较高的特异性，但灵敏度相对较低。
（3）基因芯片技术基因芯片技术可以同时检测多个结核分枝杆菌的基因靶点，快速准确地诊断结核病，并能检测结核菌的耐药基因，为临床治疗提供指导。
4、免疫学检测（1）结核菌素试验（PPD 试验）PPD 试验是通过皮内注射结核菌素，观察局部皮肤反应来判断是否感染结核分枝杆菌。
但 PPD 试验存在一定的假阳性和假阴性，对于免疫功能低下的人群诊断价值有限。
（2）γ干扰素释放试验（IGRA）IGRA 是通过检测外周血中结核分枝杆菌特异性抗原刺激后释放的γ干扰素，来判断是否存在结核菌感染。
IGRA 具有较高的特异性和灵敏度，尤其适用于免疫功能低下的人群。
5、影像学检查胸部 X 线和 CT 检查对于肺结核的诊断具有重要意义。
结核病实验室诊断技术新进展52页PPT
DNA提取
10min ,100℃
1min ,2000g
Supernatant，capture DNA
基因扩增
LAMP amp4l0ifmicianti,o6n7℃
Reconstitute reaction mix
基因检出
＋－
1177
二、 新诊断技术和方法
（1）环介导等温扩增技术(Loop mediated isothermal amplification ，LAMP)
突变检测 胞壁成分检测 88
二、 新诊断技术和方法
1、细菌学检查 发光二极管（LED）荧光显微镜
光源寿命长（30,000h） 不需要预热 不需要暗室 可用现有的显微镜 可使用电池电源
与通常荧光显微镜的判定一 致率98.0%
99
二、 新诊断技术和方法
两种方法观察结果
Z-N染色镜检结果
LED镜检结果
77
二、 新诊断技术和方法
分类
新方法
细菌学检查 LED(发光二极管显微镜)
用途
涂片检查
免疫学方法 分子生物学
其他
-干扰素释放实验 LAMP( 等温扩增) LPA( 线性探针) Genechip(基因芯片) GeneXpert(多色巢式定量PCR) 分子分型技术
DNA 测序法 HPLC
潜伏感染者
涂阴\涂阳 MDR-TB, 鉴定 MDR-TB, 鉴定 耐RFP, 涂阴 指纹图谱分析
•对涂阴培阳病人具有非常高的敏感性和特异性 •密闭系统(没有污染的风险） •快速，两小时内即可得到检测结果， •肉眼观察
1166
二、 新诊断技术和方法
（1）环介导等温扩增技术(Loop mediated isothermal amplification ，LAMP)
结核病的诊断与治疗新进展
预防措施的推广和应用：将优化后的预防措施推广到实际应用中，提高结核病的预防 效果
THANK YOU
汇报人：XX
病变情况
3
结核病治疗方法的创新
药物治疗的进展
新型抗结核药物的研发
药物组合疗法的优化
药物剂量和疗程的调整
药物安全性和耐药性的研 究
手术治疗的进展
微创手术： 减少创伤， 缩短恢复时
间
机器人辅助 手术：提高 手术精确度， 减少并发症
3D打印技术： 个性化手术 方案，提高 手术成功率
免疫疗法： 增强患者免 疫系统，辅 助手术治疗
免疫诊断技术在结核病 诊断中的应用
免疫诊断技术的优缺点 和局限性
影像学诊断技术
X光检查：早期 发现结核病，但 容易漏诊
CT检查：更清晰 地显示结核病灶， 但辐射剂量较大
MRI检查：无辐射， 但价格较高，对 结核病诊断的敏 感性较低
超声检查：无辐 射，价格较低， 但对结核病诊断 的敏感性较低
核素扫描：敏感 性较高，但辐射 剂量较大，且价 格较高
1
添加章节标题
2
结核病诊断技术的进展
分子诊断技术
概念：通过检测病原体的基因或蛋白质来诊断结核病 优点：灵敏度高，特异性强，能够早期发现结核病 技术进展：PCR技术、基因测序技术、蛋白质芯片技术等 应用：在结核病的诊断、治疗和预防方面具有重要价值
免疫诊断技术
结核病免疫诊断技术的 发展历程
免疫诊断技术的原理和 特点
新型抗结核药物的研究现状
研究进展：新型抗结核药物的 研究取得了显著进展，多种药 物已经进入临床试验阶段。
药物类型：新型抗结核药物主要 包括抗生素、抗病毒药物、免疫 调节剂等。
结核病的分子生物学诊断技术研究进展
２ １２ 在 Ｐ Ｒ基 础上发展 的核酸 扩增 技术 ．． Ｃ
① Ｐ Ｒ 单链 Ｃ－
构象多态性分析 （ Ｃ ．Ｓ Ｐ 。是检测单碱 基突变 可靠而 简 Ｐ ＲＳ Ｃ ） 便的方法 。Ｐ Ｒ产 物为两条 互补单链 ， Ｃ 各单链 的碱基序列 不 同可形成不 同的空 间构 象 ， 凝胶 上显示 不 同 的带型 ， 确 在 可 定有 无突变 。 目前 采用 Ｐ Ｒ Ｓ Ｃ Ｃ —Ｓ Ｐ技术 分析 耐 多药结 核 杆 菌的耐药机理 已成为研究热点 ， 尤其是该法 直接 检测临床 标 本中结核杆菌耐药基 因的成功 ， 会对传统结核 药敏试验 产 将 生新的挑 战。Ｓ ｅｎ等 学者 检测 比嗪酰胺 的耐药基 因 ， ｈｅ 与
２ 结核病 的分 子生物学诊断技术 ２ １ 核酸扩增技术 ．
径。
基因突变 ， 分别 检 出突变基 因 １ 株 、９株 、４株 ， 该法 不 ６ １ ｌ 但
能确定突变部位和性质 ， 对操 作技 术要求 过 高 ， 响因素 较 影
多 ， 前 只在 条件 较好 的实 验 室 开展研 究 。② 序列 特 异 引 目
断， 缺点是无法 区别 死菌和活菌 。巢式 Ｐ Ｒ 半 巢式 Ｐ Ｒ采 Ｃ 、 Ｃ
近１ ０余年 来 ， 核病 发病呈 全球 持续 恶化 ，０７年 死 结 ２０ 于结 核病 的患者约 １７万 ｊ ７ 。结 核杆菌 是结 核病 的主要致 病菌 ， 可在人群 中传播 ， 对外界环境 的抵抗力强 ， 易产生耐 药
山东医药 ２ １ 年第 ５ Biblioteka 第 ３ 期 ０１ １ ｌ・
综述 与讲 座 ・
结 核 病 的分 子 生 物 学诊 断技 术 研 究 进 展
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国际上较为成熟的IGRAs有两种
结核感染T细胞免疫检测
全血检测
ELISA对全血中致敏T细胞再次 受到结核特异性抗原刺激后所释 放的IFN-γ水平进行检测。
均为结核菌 RD1区基因 编码的抗原
多肽，主要 包括ESAT-6 和CFP-10
结核感染T细胞检测
细胞检测
ELISPOT在结核菌特异性抗原刺 激下, 测定外周血单个核细胞中 能够释放IFN-γ的效应T细胞数量。
三、诊断技术发展的多元化
诊断技术便捷化 检测样本多样化 技术产品本土化 测序技术和数据平台
诊断技术便捷化
GeneXpert Omni
全自动分子诊断POCT系统，为患者提供真正的即时床旁检测 轻便易携带（高23cm,重1kg）,方便在全球范围内推广 采用电池供电，需联网使用，涉及数据所有权 单盒式测试，一次只能检测一个样本 2015年AACC会议上亮相，预计2017年第3季度正式发布
DNA作为分子诊断靶标的技术
2.环介导恒温扩增 LAMP 技术
原理
针对靶基因的6个区域设计4 条特异引物，利用链 置 换 DNA 聚 合 酶 在 等 温 条 件 (63-65℃) 下 30-60 min，即可完成核酸扩增
特点
不需双链DNA先变性成单链 扩增反应在等温下可持续进行 扩增效率高，15min-1h内实现109-1010倍的扩增 对 DNA 的扩增不需要热循环仪器。 当模板为RNA时，仅需加入逆转录酶即可与DNA一样扩增
Sanger 测序
① PCR扩增待测耐药基因，对产物纯化之后测序，与其标准株的 同一
片段比较异同 ② 作为耐药突变分子生物学检测技术的金标准，能确定突变碱基的位置、 类型性质 ③ 操作繁琐，费用昂贵，多用于评价其他检测方法
焦磷酸测序 Pyrosequencing
一种以检测DNA 合成过程中所产生的焦磷酸（PPi）为基础的实时DNA 测 序技术，操作简单，准确性高，一次完成96 个样品的检测
亚能MTB耐药突变检测
高通量：检测MTB5个耐药基因（rpoB、katG、inhA、embB、 rpsL）的13种突变，结果提示4种一线抗结核药物（利福平、异烟 肼、链霉素、乙胺丁醇）的耐药信息。 快速：检测全程仅需8小时 性能好：检测的特异性达98%，准确性达95%，重复性达99%
测序技术与数据平台
结核病的分子诊断技术进展
应斌武 四川大学华西医院 2017.12 广西南宁
01 结核的流行现状 02 结核的分子生物学诊断
03 诊断技术发展的多元化
04 华西医院的结核病诊断 的临床应用与研究进展
一、结核流行病学现状
预计未来20年将有3600万人死于结核病， 结核病为感染性疾病中的头号杀手。
传统检测方法
二、结核的分子生物学诊断
分子诊断
RNA 水平
扩增
杂交
SAT,TMA FISH, 探针
DNA 水平 恒温扩增 变温扩增
鉴定
LAMP, SDA
鉴定+耐药
RT-PCR, LPA, Xpert, HRM, 测序
蛋白质水平 IGRA, TST 等
RNA作为分子诊断靶标的技术 1. Gen Probe MTD （TMA技术）
原理：多重PCR扩增和反向杂交
菌种鉴定试剂盒同时快速检测包括结核 分枝杆菌在内的 17 种MTB
耐药试剂盒能快速检测分离株或者痰样 本的MDR-TB
灵敏度较好（103 CFU/反应），特异性 较好（防污染体系，对照严谨，自动判 读），快速（6h），价格昂贵
基于蛋白质层面的结核病诊断新技术
γ-干扰素释放试验（IGRA）
GeneXpert残留物进行其它耐药性分析
Xpert测定法处理的样品 残留物可用于PCR，以发 现与MDR和XDR-TB的 其他药物的抗性相关的突 变，无需培养或生物安全 基础设施，特别适合于不 可能进行表型药物敏感性 测试的环境
Newer iterations of GeneXpert
Xpert MTB/RIF Ultra
IGRA
T-SPOT.TB
IFN-γ是参与结核病发病的一个细胞因子。效应T细胞被近期 暴露的抗原在体外再次刺激后会释放γ干扰素。
QuantiFERON-TB Gold In-Tube (QFT)
结核潜伏感染
7505例受试者中，4455 例为γ-干扰素释放实验阳 性，6404例为TST阳性 （≥10mm），3354例 为双阳性。结果显示，随 访期间γ-干扰素释放实验 阳性、TST阳性和双阳性 的结核感染潜伏者进展为 活动性结核病的发生率分 别为0.87%、0.5%和 0.82%。研究结果表明， 中国农村的高风险人群， 应以干扰素γ释放试验作 为潜在感染筛查和治疗。
注射药物）
③ 亚能MTB耐药突变检 测（利福平、异烟肼、链霉
素、乙胺丁醇）
MTB药敏检测
① 14种一二线药物 ② 菌型鉴定
（MTBC、NTB、牛 型结核分枝杆菌）
阴性
阴性有排除结 核病的价值
阳性提示结核 感染或结核病
开展结核感染的宿主因素相关研究
01 SNP与结核易感性的关联研究 02 药物基因组学相关SNP与抗结核药物的不良反应 03 lncRNA在结核病中的诊断价值探讨及功能研究 04 结核病相关的表观遗传修饰改变（甲基化、miRNA）
基于TB-DNA的MTB鉴定及分子药敏技术
1. Line probe assays线性探针测定法 Hain（LPA GenoType® MTBDRplus/Rsl）技术
2h 0.5 h
2.5-3 h
WHO建议使用Hain来检测 MDR-TB
基于TB-DNA的MTB鉴定及分子药敏技术
2. Xpert MTB/RIF
异烟肼98.1%，100% 氟喹诺酮95.8%，100% 卡那霉素92.7%，100% 阿米卡星96.8%，100% 预计2018年面世
基于TB-DNA的MTB鉴定及分子药敏技术
3. DNA微阵列芯片
适用范围：MTBC鉴定，TB菌种鉴定， 利福平和异烟肼的耐药检测
分离株或者痰标本均可检测
敏感 耐药 利福平
Truenat MTB
基于芯片的核酸扩增试验，样本在Trueprep-MAG™（电 池供电设备）进行处理，加载到Truenat，在Truelab Uno™ 分析仪（手持式、电池供电式热循环仪）上进行实时PCR。 样本制备到最终报告：<1h Truenat具有防污染/防蒸发设计的反应口，实现核酸隔离 平台缺乏全面自动化 正在进行大规模的多中心评估，预计2017年底上市
对疑似肺外结核患者的肺外标本如脑脊液， 淋巴结和其它组织，推荐Xpert MTB/RIF 作 为检测方法。
对于痰涂片检测阴性的患者，推荐 Xpert MTB/RIF 作为后续检测方法。
截止到 2014 年末， GeneXpert 已累积生产了 17,883 组模块和 10,013,600 组标本盒，销往 145 个国家和 地区。
以半巢式实时定量 PCR 扩增技术为基础，能够自动抽提 DNA 并且 扩增 rpoB 基因。设计五个重叠的分子信标，检测81碱基 rpoB核心 区域所有可能的突变；用不同的荧光基团标记每个分子信标，仅在 一个反应中完成整个检测
2 小时内直接从病人痰液中检测是否有MTB及对利福平的耐药性 整个过程都在一密闭环境中进行，手动操作时间不超过 5 分钟，对
下一代测序 Next generation sequencing
利用高密度芯片，一次能完成数十亿个碱基的测序，代表平台有Illmina 的HiSeq/miSeq（合成测序法），Lifetech的ABI SOLiD（连接测序法）
ReSeqTB Data Platform
ReSeqTB对Mtb菌属的大量基因型、表现型以及相关数据进行编录，提供 标准化经验证的全基因序列（WGS）分析流程
建立结核病的生物样本库
结核生物样本库
结核菌株生物 库
信息相对应
宿主生物样本 库
结核病人信息库 （基本资料、实验 室检查、诊断、治 疗、预后、随访等）
生物样本（全血、 血清、DNA、 RNA等）
01 SNP与结核易感性的关联研究
1、研究对象：汉族、藏族
试验队列：1916例（汉），验证队列：930例（藏）； 进一步功能验证（细胞模型）
四、华西医院结核病诊断的临床应用及研究进展
我院的结核及耐药实验室检测流程
患者临床标本
直接检测 核酸
Ziehl-Neelsen染色 显微镜检查
MGIT960 液体培养
IGRA
核酸提取 及纯化
AFB阴性
AFB阳性
培养阳性 培养阴性
实时荧光 PCR
阴性
阳性
分子快速药敏检测
①GenoType® MTBDR plus（利福平、异烟肼） ② GenoType® MTBDR sl（乙胺丁醇、氟喹诺酮、可
操作者和周围环境安全
2010 年 12 月，WHO 首次发布官方文 件推荐 Xpert MTB/RIF 技术的使用
2013 年，WHO 又再次发文更新了对 XpertMTB/RIF 的推荐意见：
当成人和儿童患者怀疑 MDR-TB 感染或合 并 HIV 感染时，强烈推荐 Xpert MTB/RIF 作为首选检测方法，从而替代传统的涂片镜检， 培养和药物试验的方法。
评价
1.TB-DNA检测的限制步骤在于DNA的提取： 磁珠法提取DNA较煮沸裂解法和柱子法纯度 高 2. TB-DNA检测尤其适合于菌量少的体液标 本 3.血液标本除外，MTB检出率极低， et al. Molecular profile of drug resistance in tuberculous meningitis from southwest china. Clin Infect Dis. 2011 Dec;53(11):1067-73.