结核病实验室诊断技术介绍
结核实验室检查项目
结核实验室检查项目包括痰涂片、痰培养、结核菌素试验和胸部X线检查等。
1. 痰涂片：通过显微镜观察痰液中的结核杆菌是否存在，是诊断结核病的常用方法之一。
2. 痰培养：将痰液置于培养基上进行培养，检测结核杆菌的生长情况，可以确定病原体的种类和药物敏感性。
3. 结核菌素试验：注射结核菌素后观察皮肤反应，判断是否感染了结核杆菌。
阳性结果需要进一步确认是否为活动性结核病。
4. 胸部X线检查：通过X光照射胸部，观察肺部是否有结核病变，如结节、空洞等。
对于早期病变或隐匿性病变的发现具有重要意义。
这些检查项目可以帮助医生确定患者是否患有结核病，并指导治疗方案的选择和调整。
同时，这些检查也有助于监测治疗效果和预防结核病的传播。
结核病实验室检查
结核病实验室检查结核病是一种严重的传染病，通常由结核分支杆菌引起。
这种病菌会侵入肺部并引起肺结核，而也可以通过血液传播到其他部位，如淋巴、骨髓和肝脾等。
在许多地方，特别是在发展中国家，结核病仍然是一种普遍的疾病，因此及早诊断和治疗至关重要。
结核病实验室检查是确诊结核病的一种重要方法。
结核病实验室检查通常涉及多种类型的检测，例如：1.酸杆菌检测结核分支杆菌是酸杆菌，因此酸杆菌检测是一种常用的实验室检查方法。
该方法不需要复杂的设备并且具有高度的特异性和灵敏度。
患者的样本可以是咳嗽的痰液、唾液或肺组织，也可以通过胃镜获得胃肠液。
如果酸杆菌检测呈阳性，则可以确诊结核病。
但是，该方法也存在一些局限性，例如在一些情况下不能检测出结核分支杆菌，如某些菌株可以耐受某些药物。
2. 结核抗体检测结核抗体检测是另一种可以用于诊断结核病的实验室检查方法。
该方法通常使用ELISA（酶联免疫吸附试验）或其他类似方法检测患者的血清中是否存在结核抗体，如果测试结果呈阳性，则表示患者可能感染了结核分支杆菌。
但是，结核抗体检测的结果可能会出现假阳性或假阴性的情况，这限制了其在临床实践中的应用。
3.结核病PCR检测PCR检测是检查抗原核酸序列的一种方法。
由于PCR技术可以扩增极微量的DNA，并且非常特异和灵敏，因此可以检测出非常小的感染量。
在结核病中，PCR检测可以用于检测结核分支杆菌的DNA，以确认病原体的存在。
但是，该方法对样本中的DNA污染非常敏感，因此必须进行严格的实验室操作和质量控制。
总之，结核病实验室检查是确诊结核病的一种重要方法。
这些测试方法都具有不同的优缺点，并且结果可能受到许多因素的影响。
因此，必须在临床实践中综合考虑这些方法的结果和临床表现，以取得最佳的诊断结果。
同时，实验室技术人员必须受过专业培训，严格遵守操作规程，以确保准确诊断和最佳治疗效果。
结核病实验室诊断技术介绍
1．结核分枝杆菌鉴定方法1. 1萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查目前萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查是我国结核病实验室使用最为普遍的方法，其操作简单快捷，特异性高，设备要求低，但是灵敏度较低，不能及时发现病人。
1.2 发光二极管荧光显微镜（LED荧光显微镜）发光二极管荧光显微镜管利用二极管光源，延长了显微镜使用寿命，不需要暗室，且价格低廉，可以提高涂片的阳性检出率。
目前在国内应用评估结果显示灵敏度较明场显微镜明显提高，已在部分区县开始使用。
1.3 交叉引物恒温扩增结核病诊断技术在恒定温度下，特殊的引物和特异性探针在酶的作用下，反应体系在一个密闭的反应管内反应。
扩增反应一般不超过一个小时，最短半小时。
目前应用玻璃化试剂，稳定性好，便于运输。
目前在国内区县级应用评估。
1.4 夹层杯结核病诊断方法将痰标本（或其它标本）用专用消化灭活液充分消化，完全暴露并保留抗酸杆菌，通过自动离心涂片机（或半自动制片染色机）对消化后的标本进行充分集菌。
直接在夹层杯装置中进行抗酸染色，取出基片或膜片置于普通显微镜进行观察。
夹层杯法操作方便快捷，便于标准化操作，通过消化灭活，安全性改善，阳性检出率也比直接涂片法大大提高。
夹层杯的装置有沉降式和虑过式，适用于不同工作量的医疗机构。
1.5 环介导等温扩增方法采用2对引物在等温条件下即可完成DNA的扩增，扩增结果通过肉眼观察荧光进行判定，诊断是否为结核病。
同时整个反应体系采用封闭系统减少了工作区域扩增子的污染，整个反应过程只需一个小时即可完成，通过肉眼观察荧光判读结果。
2．结核分枝杆菌培养方法2.1 固体培养培养是结核病诊断的精标准，也是获得分离菌株开展耐药检测的前提，我国结核病实验室最常用的是固体罗氏培养法，包括简单法和中和离心法。
虽然培养是诊断的精标准，但是花费时间长，需要4-8周时间。
2.2 液体培养液体培养通过添加生长刺激剂，改变检测方法提高检测灵敏度等方式缩短了阳性报告时间。
结核病实验室诊断技术
GenoType MTBDR and 诊断结核感染及对利福 MTBDRplus；INNO- 平和异烟肼药物敏感性 LiPA Rif.TB
Frane; LW Scientific; Zeiss
诊断结核患者
Cepheid GeneXpert
诊断结核感染及对利福 平的耐药性
WHO推荐的结核新诊断技术
方法 DNA微阵列芯片法
有前景的几种新技术
❖ 分子诊断技术:GeneXpert（Cepheid公司） ❖ 分子线性探针技术:INNO-LIPA（Innogenetics公司） ❖ 反向点杂交技术:GenoType MTBDR （Hain Lifescience）
分枝杆菌菌种鉴定试剂盒（亚能生物） ❖ 基因芯片技术：微阵列芯片法（博奥生物） ❖ 细胞免疫学技术：T-SPOT.TB（Oxford Immunotec公司）
目前诊断方法回顾
细菌学检测方法 ： 涂片、常规培养、快培 其他辅助检查方法：皮试、结核抗体
目前诊断方法的局限性
涂片的缺点： 敏感性低； 特异性差； 无法区别死菌与活菌
培养的缺点： 耗时久，一般需4~8周； 阳性率低，约30%~50%；特异性差， 无法区别MTB与NTM
皮试的缺点： 敏感性低特异性差 抗体检测缺点：敏感性低特异性差
新型诊断技术产品比较
企业 美国 Cepheid
比利时 Innogenetics 德国 Hain Lifescience 中国 亚能生物
中国 博奥生物
英国 Oxford Immunotec
方法
产品特点
GeneXpert
同时检测MTBC和判断利福平耐药； 快速；简便；安全
线性探针杂交法 （INNO-LIPA）
➢ 新的实验诊断技术可弥补传统方法的不足，提高诊 断的灵敏度和特异性，但各有缺点或不足，难以完 全满足临床检测需求，因此，新型结核杆菌诊断技 术及产品的研发势在必行。
结核病实验室诊断技术2017.10.13
• 绝对浓度法 • 比例法
• 液体培养法
基于固体培养基；时间：4周 多种药物
基于液体培养基，时间：4-12天 INH/RFP/SM/EMB/PZA
结核分枝杆菌药物敏感试验
不同药敏方法的差异
三者在临界药物浓度接种菌量、结果判读方法等方面都有一定差 别，导致结果有很少一部分不相符
比例法和绝对浓度法检测结果的一致率4 药均高达96 %以上,对于 结核分支杆菌,二种方法测试 SM INH RFP EMB的耐药率均无显著 性差异
涂片显微镜检查的敏感性
观察到的AFB
AFB估计数量 涂片阳性的可能性(%)
数量
( /ml)
• 0 in ≥100 fields
< 1,000
<10
• 1-2 in 300 fields 5,000 – 10,000
50
• 1-9 in 100 fields about 30,000
80
• 1-9 in 10 fields
结核分枝杆菌药敏试验-菌型鉴定
利用固体罗氏鉴别培养基的鉴别：
中性罗氏 培养基
+
噻吩-2-羧酸 肼TCH
+
对硝基苯 甲酸PNB
+
菌型鉴定 NTM
+
+
-
人型Mtb
+
-
-
牛型Mtb
结核分枝杆菌药敏试验-菌型鉴定
• 原理：硝基苯甲酸还原酶机制
绝大部分非结核分枝杆菌能将对硝基-苯甲酸（PNB ）还原为细菌能够利用的对氨基-苯甲酸（PABA），而 绝大部分（98%以上）MTBC缺乏对硝基-苯甲酸（PNB ）还原酶活性，为对氨基-苯甲酸（PABA）将对硝基苯甲酸（PNB）还原为细菌能够利用的对氨基-苯甲酸 （PABA） • 局限：鉴定周期长15天-30天，特异性不高
结核病实验室
实验室方法
阳性培养物经MPT64抗原检测以确定其是否属于 结核分枝杆菌菌属。 L-J培养基比例法药敏 /MIGT 快速药敏法。 常规的DNA核酸扩增 hain方法检测耐药
实验室方法
试剂分别按2:1和3:1加入未经处理的痰标本 和去污处理的痰标本中。 室温下手工晃动密闭痰盒，15分钟内2次， 然后取2ml灭活后的物质加入检测盒(其内含 相当于0.7ml未处理痰液或0.5ml已去污处理 的痰液)，检测盒放入检测平台。 MTB/RIF检测系统直接输出电子结果。
发光二极管荧光显微镜（LED）
镜下视野
发光二极管荧光显微镜（LED）
不需要加热玻片，步骤简单 视野比普通的显微镜大大2-4倍
• 对数目少的不必使用镜油
• 节省人力时间，时间为普通的 1/4 每天可检查至少 60 个涂
片
• 可帮助早期诊断肺结核 – 即使菌浓度较低 • 杆菌也有很高的灵敏度，与 ZN 相比阳性发现率平均增加
适用范围： 1、TB的诊断 2、一线抗结核药物耐药诊断 3、二线抗结核药物耐药的诊断 4、目前，利福平（rpoB基因） 、异烟肼（Kat基 因、inhA基因）耐药的诊断
所需仪器设备：生安柜、超声振荡仪、PCR扩增 仪、可调温振荡仪
原理：基于分子生物学扩增技术。 rpoB基因突变位点有：4个
重大专项：泰兴、江阴地区部分实验结果比较
阳性检出率 标本及性状 754份痰标本 脓性痰 非脓性痰 即时痰 夜间痰 液基法 23.50% 47.50% 13.50% 20.48% 25.6% 直涂法 16.80% 40.90% 4.66% 15.06% 17.01%
三、线性探针耐多药检测方法（HAIN）
结核病实验室诊断技术
细胞免疫学技术：T-SPOT.TB（Oxford Immunotec公司）
新型诊断技术产品比较
企业
美国 Cepheid
方法
GeneXpert
产品特点
同时检测MTBC和判断利福平耐药； 快速；简便；安全
比利时 Innogenetics
德国 Hain Lifescience
线性探针杂交法 （INNO-LIPA）
目前诊断方法回顾
细菌学检测方法 ： 涂片、常规培养、快培 其他辅助检查方法：皮试、结核抗体
目前诊断方法的局限性
涂片的缺点： 敏感性低；
特异性差；
无法区别死菌与活菌 培养的缺点： 耗时久，一般需4~8周； 阳性率低，约30%~50%；特异性差， 无法区别MTB与NTM
皮试的缺点： 敏感性低特异性差
抗体检测缺点：敏感性低特异性差
GenoType MTBDR and MTBDRplus；INNOLiPA Rif.TB Frane; LW Scientific; Zeiss 诊断结核感染及对利福 平和异烟肼药物敏感性 诊断结核患者
自动化检测和MDR筛 选实验（2010年）
Cepheid GeneXpert
诊断结核感染及对利福 平的耐药性
总结
目前结核病的实验室诊断主要依赖于常规的结核病 实验室诊断方法，可应用的方法有限，不能满足临 床需要。 新的实验诊断技术可弥补传统方法的不足，提高诊 断的灵敏度和特异性，但各有缺点或不足，难以完 全满足临床检测需求，因此，新型结核杆菌诊断技
术及产品的研发势在必行。
WHO推荐的结核新诊断技术
方法 DNA微阵列芯片法 商品 检测目的
生物结核分枝杆菌耐 诊断结核感染及对利 药基因检测试剂盒 福平和异烟肼的药物 敏感性 T-SPOT.TB; QFT 诊断结核感染
肺结核实验室诊断方法创新研究
肺结核实验室诊断方法创新研究肺结核是一种常见的传染病，严重影响了人们的健康和生活质量。
早期诊断和治疗对于疾病的控制和防治具有重要意义。
为了提高肺结核的诊断水平，不断创新和发展实验室诊断方法是非常必要的。
本文主要介绍肺结核实验室诊断方法创新研究的相关内容。
一、传统实验室诊断方法1.痰涂片法：痰涂片法是一种传统的肺结核诊断方法，其原理是通过显微镜观察痰样本中的结核分枝杆菌，从而诊断肺结核。
但是，该方法的缺点是需要高度技术人员，且存在较高的漏诊率和误诊率。
2.结核菌抗原检测：结核菌抗原检测是通过检测患者血清或痰液中的结核菌抗原来诊断肺结核，其优点是快速、简单、易于操作，但其准确性有待提高。
3.结核菌DNA检测：结核菌DNA检测是通过PCR技术检测痰中的结核菌DNA，因其快速、敏感、特异性高等优点，已经成为肺结核的重要检测手段之一，但该方法的局限性是对操作人员有较高的技术要求。
以上三种方法都有一定的缺陷，如漏诊、误诊等，所以需要不断创新和发展实验室诊断方法。
1.核酸纳米探针技术：该技术是基于纳米技术和核酸技术的结合，能够检测低浓度的结核分枝杆菌，具有快速、灵敏度高、特异性强等优点，是肺结核的新型检测手段。
2.蛋白质组学分析：蛋白质组学分析是一种全面研究生物体内蛋白质表达和调控的方法，可以发现新的生物标志物，从而提高肺结核的诊断准确性和鉴别诊断能力。
3.微流控技术：微流控技术是最近几年发展起来的一种新型技术，通过微小化、可控制的流体流动来实现生物分析的高通量和高灵敏度，可用于快速、准确地检测肺结核病原体。
4.支持向量机算法：支持向量机算法是一种人工智能算法，能够分类和预测数据，已被应用于医学领域，可以通过数据挖掘发现新的生物标志物，为肺结核的诊断和治疗提供更准确的数据支持。
三、结语随着生物技术的发展和人工智能算法的应用，肺结核的实验室诊断方法正不断创新和发展，其准确性和效率不断提高，为病人提供更好的医疗服务。
结核病的实验室诊断方法及评价
耐多药结核病的实验室诊断条件：因耐多药结核分枝杆菌的生物危险性，1）需P2及以上实验室，目前我院实验室条件基本具备即将投入运行，2）日常培养及涂片用的生物安全柜滤膜已超出使用年限，工作人员生物安全得不到保障，应定期予以更换。
耐多药结核分枝杆菌主要以结核分枝杆菌体外药物敏感性测定作为其诊断依据。
因此其基础是培养，只有培养出阳性结核分枝杆菌才能进一步通过结核分枝杆菌体外药物敏感性测定诊断是否为耐多药结核分枝杆菌。
1.已进人临床常规应用的测定方法:目前包括绝对浓度法、比例法及应用BACTEC460、BACTEC 960、BacT/ ALERT 3D、ESPII等仪器系统快速检测结核分枝杆菌的药物敏感性。
其中:绝对浓度法以最低抑菌浓度或以无生长为终点作为判断标准，是我国目前普遍采用的方法;比例法以是否能够抑制99%的细菌生长作为判断标准，是世界卫生组织推荐使用的方法;后四种仪器方法则是比例法的特化，其特点是以细菌的代谢过程指示细菌生长状况。
2.处于研究探索阶段的测定方法:此类方法很多，抗性比例法、Etests法、噬菌体生物扩增法、液体变色培养基测定法、荧光素酶测定法、硝酸盐还原试验等。
3分子生物学方法对结核分枝杆菌耐药性检测已有一些进入临床检测。
基因突变是引起抗结核药物耐药性的最主要的原因。
多种以PCR为基础的分子生物学技术用于检测与耐药相关基因的突变，作为快速耐药性检测方法在实验室或临床得到开展。
这些方法具体包括：主要是DNA序列分析法，聚合链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP），另外还包括基因芯片技术、异质性双链构象分析、变性梯度凝胶电泳、线性探针杂交技术、RNA/RNA错配检测技术和分子灯塔技术等。
由于结核分枝杆菌的耐药性与基因突变的确切关系未完全阐明，检测耐药相关基因的分子生物学方法虽然能快速准确地检测到耐药相关基因的突变，但由于判断药物敏感性时存在固有的缺陷，检测结核分枝杆菌耐药性的基因型鉴定法不能完全替代表型鉴定法。
结核病实验室检测新诊断技术
HAIN和目前常规药敏方法比较
比较项目 时间
生物安全级别要求 人员培训
操作简易程度 仪器设备
HAIN 1-2天 较低 2-3天 简单 性价比较高
常规药敏方法 2-3个月
二级实验室 2-3个月 复杂 --
对环境洁净度要求
较高，易出现 假阳性
较高
四、GENECHIP基因芯片耐多药 检测技术
适用范围： 1、TB复合群鉴定。 2、TB菌种鉴定。 3、利福平和异烟肼耐药检测 。 原理：多重PCR扩增和反向杂交来识别。
，
耐药检测基因芯片
基因芯片是基于特定基因位点突变与耐药性的相关性，通 过PCR扩增和核酸杂交技术，检测荧光信号的有无，判断 特定位点的突变情况和细菌耐药性的检测方法。
结核分枝杆菌耐药检测基因芯片基于rpoB/katG/inhA的基 因突变，快速检测分离株或者痰样本中结核杆菌耐药性 （利福平、异烟肼）。
发光二极管荧光显微镜（LED）
镜下视野
发光二极管荧光显微镜（LED）
不需要加热玻片，步骤简单 视野比普通的显微镜大大2-4倍 • 对数目少的不必使用镜油 • 节省人力时间，时间为普通的1/4每天可检查至少60个涂
片 • 可帮助早期诊断肺结核 – 即使菌浓度较低 • 杆菌也有很高的灵敏度，与ZN相比阳性发现率平均增加
适用范围：痰涂片镜检 十一五国家重大科技专项：泰兴、江阴 厂家：湖南天骑公司 原理：集菌法
流程图
痰标本消化灭活 基片的夹层杯
离心 细菌附着在基片
在夹层杯中
直接染色 取出基片
于载玻片上
镜检 自动阅片计算机报告系统。
所需仪器设备：普通的抗酸染色液、彭氏杯 （专利）、涂片机、KP21型快速干片机、抗 酸杆菌自动阅片计算机报告系统。
结核病的实验室诊断方法
结核病的实验室诊断方法结核病实验室检查主要有；涂片染色显微镜检查、分枝杆菌分离培养、分枝杆菌药物敏感性试验、分枝杆菌菌种鉴定、分枝杆菌基因分型、分枝杆菌血清学及核酸扩增检测等。
细菌学检查细菌学检验结果的准确性首先取决于标本的质量。
正确地采集、转送标本，是直接影响检验结果的重要因素和取得准确结果的前提。
各种标本(痰液、血液、伤口分泌物和各种感染等)采集时应充分考虑到选择恰当合理的时问，考虑到可能存在的病原菌的性质，按要求采集标本，这样可使标本包含细菌，并为后续检验步骤打下良好的基础。
合格的痰标本在低倍镜视野里上皮细胞应10个，白细胞数应25个。
涂片染色显微镜检查根据我国结核病防治规划的要求，对咳嗽、咳痰13周或有咯血或血痰的肺结核可疑症状者，应留取3份痰标本(夜间痰、清晨痰和即时痰)进行痰涂片抗酸染色检查。
即时痰为病人就诊时咳出的痰液：清晨痰为清晨深咳出的痰液；夜间痰为就诊前1天晚睡前咳出的痰液。
留取的痰液标本常规涂片后，进行要尔－尼尔逊氏染色法(ziehl-Neelsen)染色。
分枝杆菌分离培养结核分枝杆菌是兼性需氧菌，最适生长温度为37℃，最适pH为6.5～7.2。
分枝杆菌分离培养检查法，是结核病确诊最可靠的方法。
是获得纯培养物进行菌种鉴定、药物敏感性试验以及其他生物学研究的基础。
当前，我国普遍采用改良L-J(改良罗氏)培养基来分离培养结核分枝杆菌。
通常情况下，当每1ml标本中微生物含量达10<sup>2～3</sup> CFU(菌落形成单位)时，即可培养阳性。
分枝杆菌快速培养检查是使用分枝杆菌快速培养仪(MIGT、BacT/A1err、ESP)，通过测定细菌生长代谢检测分枝杆菌生长情况的方法。
在进行分枝杆菌快速培养检查时，标本接种前的祛污染处理，必须严格按照系统说明书中给定的方法进行。
孵育检测过程中系统报告阳性时，相应标本的培养液必须首先进行抗酸染色镜检，发现抗酸菌后方可发出阳性报告。
结核病的实验室诊断
灵敏度
Reference Jafari et al 2006 AJRCCM 174;9:1048-53 Ferrara et al Lancet 2006 376;1328-34* Lee et al Eur Respir J 2006 28;24-30* Goletti et al Clin Microbiol Infect 2006 12;6:544-50* Meier et al EJCMID 2005 24;529-536 Kang et al Chest. 2007 Sep;132(3):959-65* Janssens et al ERJ 2007 30(4):722-8 Clarke et al Clin Exp Immunol 2007 150(2):238-44. Detjen et al CID 2007 1;45(3):322-8* Ozekinci et al J Int Med Res 2007;35:696-703 Soysal et al IJTLD 2008 12(1):50-56* Dominguez et al Clin Vacc Immunol 2008 15(1);168-71* Chee et al J Clin Microbiol. 2008 Apr 9* Vincenti et al Clin Exp Immunol. 2007 Oct;150(1):91-8* Wang et al Emerging Infect Dis 2007 13;4:553-8 Losi et al Eur Respir J. 2007 Dec;30(6):1173-9 Kim et al Arch Intern Med 167;20:2255-2259 Connell et al PLoS ONE 2008. 3; 7:e2624* Kobashi et al. Scand J Infect Dis 2008. 40; 8: 629-34* Kobashi et al. J Infect. 2008 [Epub ahead of print].* Domí nguez et al. Diagn Microbiol Infect Dis. 2008.* [Epub ahead of print] Goletti et al. PLoS ONE. 2008. 3; 10: e3417.* Bosshard et al. Respir Med. 2008. [Epub ahead of print] Higuchi Med Microbiol Immunol. 2008. [Epub ahead of print]* TOTAL Sensitivity 100.0% (12/12) 83.3% (20/24) 96.6% (84/87) 91.3% (21/23) 95.9% (70/73) 92.2% (59/64) 98.3% (57/58) 90.0% (27/30) 92.9% (26/28) 92.9% (26/28) 80.8% (80/99) 85.7% (36/42) 94.1% (254/270) 84.6% (11/13) 87.2% (34/39) 100.0% (10/10) 100.0% (22/22) 100.0% (9/9) 87.5% (42/48) 90.0% (36/40) 84.2% (32/38) 89.9% (62/69) 98.4% (62/63) 95.9% (47/49) 92.0% (1139/1238)
结核病诊断技术
第2章实验室检验技术结核病实验室检查，特别是细菌学检查是结核病确诊和治疗的主要依据。
结核病细菌学检验主要包括4项基本技术，即涂片染色镜检、分枝杆菌分离培养、分枝杆菌药物敏感性试验、分枝杆菌菌种鉴定。
检验人员应依据临床医师检验申请要求并结合实验室的设备和技术条件，负责对标本进行检验，及时、准确地填写检验报告。
近年来，国内、外研究者在分子生物学、分子微生物学及免疫学领域建立了若干快速、敏感、特异的检测新技术，为可疑结核病患者的早期诊断与合理治疗带来了新的希望。
列入“规范”的结核杆菌临床基因扩增(PCR)检验技术、分枝杆菌快速培养及药物敏感性试验技术、免疫学检测技术，因有多种试剂盒(试剂)及分析仪器可供选择，目前尚难制定统一的技术操作规范，故暂定为辅助操作技术。
具备开展这些技术项目条件的实验室(或检验科)，须经有关主管部门批准后，严格按照相应技术所附的说明书与操作规程实施。
鉴于结核病实验室检查，特别是细菌学检查在结核病控制工作中的重要性，为保障相应检查项目结果的可靠性，要求相应的检查项目必须由经过培训并考核合格的专职人员完成，且开展相应检查的实验室应具备安全操作设施，制定实验室内部质量控制措施，同时接受专业结核病实验室的质量控制督导和培训。
第一节结核茵检验实验室安全操作规则结核病细菌学实验室必须具有与其服务级别相应的装备，其原则是能满足该级别实验室的需要，使实验室工作人员得到充分的防护，并避免造成环境污染。
1．实验室应有合理布局及合适的单向(外排)通风体系。
2．实验室应配备相应的防护设备，以保护工作人员的安全和实验工作的顺利进行。
分离培养、药物敏感性测定、菌种鉴定试验等操作应设有生物安全操作柜或接种间和通风橱等。
3．实验室工作人员应按正确方式进行技术操作，穿戴隔离衣、口罩和帽子等。
4．实验室所有带毒废弃物应灭菌及无害化处理。
5．建立清洁消毒制度，限制非工作人员进入室内，禁止在实验室饮食和吸烟等。
6．进行下列操作时应严格按照技术操作规范，防止产生细菌气溶胶：①涂片制作；②培养液的倾倒和转移；③高速混合含菌液体；④滴加、接种培养物；⑤吸管稀释和混合菌悬液；⑥取样器和振荡器的使用；⑦细菌细胞超声粉碎；⑧感染动物实验等。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1．结核分枝杆菌鉴定方法
1. 1萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查
目前萋尼氏抗酸染色痰涂片显微镜检查是我国结核病实验室使用最为普遍的方法，其操作简单快捷，特异性高，设备要求低，但是灵敏度较低，不能及时发现病人。
1.2 发光二极管荧光显微镜（LED荧光显微镜）
发光二极管荧光显微镜管利用二极管光源，延长了显微镜使用寿命，不需要暗室，且价格低廉，可以提高涂片的阳性检出率。
目前在国内应用评估结果显示灵敏度较明场显微镜明显提高，已在部分区县开始使用。
1.3 交叉引物恒温扩增结核病诊断技术
在恒定温度下，特殊的引物和特异性探针在酶的作用下，反应体系在一个密闭的反应管内反应。
扩增反应一般不超过一个小时，最短半小时。
目前应用玻璃化试剂，稳定性好，便于运输。
目前在国内区县级应用评估。
1.4 夹层杯结核病诊断方法
将痰标本（或其它标本）用专用消化灭活液充分消化，完全暴露并保留抗酸杆菌，通过自动离心涂片机（或半自动制片染色机）对消化后的标本进行充分集菌。
直接在夹层杯装置中进行抗酸染色，取出基片或膜片置于普通显微镜进行观察。
夹层杯法操作方便快捷，便于标准化操作，通过消化灭活，安全性改善，阳性检出率也比直接涂片法大大提高。
夹层杯的装置有沉降式和虑过式，适用于不同工作量的医疗机构。
1.5 环介导等温扩增
方法采用2对引物在等温条件下即可完成DNA的扩增，扩增结果通过肉眼观察荧光进行判定，诊断是否为结核病。
同时整个反应体系采用封闭系统减少了工作区域扩增子的污染，整个反应过程只需一个小时即可完成，通过肉眼观察荧光判读结果。
2．结核分枝杆菌培养方法
2.1 固体培养
培养是结核病诊断的精标准，也是获得分离菌株开展耐药检测的前提，我国结核病实验室最常用的是固体罗氏培养法，包括简单法和中和离心法。
虽然培养是诊断的精标准，但是花费时间长，需要4-8周时间。
2.2 液体培养
液体培养通过添加生长刺激剂，改变检测方法提高检测灵敏度等方式缩短了阳性报告时间。
目前应用的有BACTEC-快培、MGIT-快培和Alert 3D-快培法，虽然快速液体培养法缩短了报告时间，但是其价格昂贵且污染率高，限制了其广泛应用。
目前国内应用主要集中在结核病专科医院。
3．药物敏感性试验
3.1 固体药物敏感性试验
药物敏感性试验是耐药结核病诊断的主要依据，在规范化治疗治疗中起着重要作用，不仅有助于筛选有效的抗结核药物，还可以了解耐药菌株的流行情况，为抗结核药物的合理应用提供实验依据。
目前我们国家结核病实验室使用的药敏方法有直接法和间接法，间接法最常用的方法有绝对浓度法药敏试验和比例法药敏试验。
绝对浓度发药敏试验时60年代以来结核病实验室特别是医院的实验室用于结核分枝杆菌药敏试验的常用方法，其原理是接种同一浓度的菌液在两支不同浓度的含药中性改良罗氏培养基上，计数对照培养基和含药培养基上细菌生长菌落的数量，根据含药培养基上菌落生长的数量，确定测试菌株对该药的耐药性。
比例法药敏试验是1996年世界卫生组织在我国开展耐药监测以来广泛在结核病实验室用于耐药性检测的方法。
其原理是接种两种不同浓度的菌液在两支同一浓度的含药中性改良罗氏培养基上，计数对照培养基和含药培养基上细菌生长菌落的数量，计算耐药百分比，确定测试菌株对该药的耐药性。
无论是比例法还是绝对浓度法，都需要1个月时间报告药敏结果。
3.2 液体药物敏感性试验
液体药物敏感性试验通过对细菌培养代谢产物的检测，提高了检测灵敏度，缩短了报告时间。
常用的BACTEC系统和MGIT系统，一般在结核病专科医院应用。
快速培养均利用液体培养基，通过检测仪器来完成药敏试验，但所用仪器价格昂贵，需进口使用厂家的专利液体培养基，费用较高，且方法仍然建立在以细菌培养的基础之上，都要通过分枝杆菌的自然生长以积累菌量方能检出。
而分枝杆菌的生长相对缓慢，因而采用上述方法进行药敏试验都难以突破“慢”的限制。
3.3 最低抑菌浓度（MIC）测定
通过测定MIC，还可以分析菌株的耐药程度与耐药相关基因的突变的关系，为揭示耐药产生的机制提供信息。
4．分子生物学耐药检测方法
4. 1线性探针耐多药检测方法（LPA）
运用多重PCR扩增和反向杂交技术，通过检测RIF和INH耐药相关基因rpoB、KatG、inhA的突变，可以在1天内诊断结核分枝杆菌对RIF和INH的耐药性。
4. 2利福平耐药核酸扩增检测方法（Xpert MTB/RIF）
Xpert核酸扩增检测系统将样品准备、定量PCR扩增和荧光检测集于一身的核酸检测分析系统。
使用者只需要在独立的反应孔中加入待检测的生物样品，两个小时内便能快速检测出患者是否结核以及对利福平是否耐药。
4. 3 基因芯片耐多药检测方法（GeneChip）
基因芯片耐多药检测方法是一种可以快速检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性的分子生物学方法，它通过基于对利福平耐药基因rpoB及异烟肼耐药基因inhA和katG的扩增，将扩增产物与芯片上预先点制的探针进行杂交，以判断耐药基因的常见突变位点的突变情况，此外通过扩增16S rRNA进行菌种鉴定。
5．基因分型方法
5.1 MIRU基因分型方法
MIRU分型法是高等真核生物的基因分型中一种极有价值的研究方法。
这种方法基于所谓多态性的微卫星或小卫星区域中重复序列的数量,提供一种简单、准确的分型手段，是实验室常用的基因方法之一。
将基因组DNA分离，以每个位点的引物进行PCR扩增（包括H37Rv标准对照和空白对照），扩增产物用凝胶电泳或毛细管电泳分离，根据扩增片断的大小确定每一位点重复数目。
MIRU结果报告为数字，每个数字对应于按标准顺序列出的、不同MIRU位点对应的重复数。
在极少的情况下，重复数会大于9。
为避免使用两位数，在报告结果中采用以下表示法：10次重复=“a”；11次重复=“b”；12次重复=“c”；等等。
偶尔地，重复数为0。
MIRU分辨率高，与IS6110-RFL P 分型法结果高度相关。
快速、适合于所有结核菌分离株,包括IS6110拷贝数少的菌株,便于不同实验室结果比较。
5.2 spoligotyping 基因分型方法
Spoligotyping 是基于结核分枝杆菌基因组中直接重复区(DR)的多态性的分型方法。
基因组DNA分离，PCR方法扩增，包括阳性（H37Rv、BCG）和空白对照，扩增产物与固定在膜上的探针杂交，通过化学发光检测。
优点是简单、快速、适合临床标本，无需培养，结果数字化，便于比较。
缺点是分辨率低，尤其对于北京基因型菌株。
6．免疫学诊断技术
免疫学诊断技术是结核病细菌学诊断的重要补充，特别是对菌阴肺结核和肺外结核病患者。
TB-SA抗体检测法采用结核特异性抗原，TB-SA抗原具有极高的特异性，只存在于结核分枝杆菌和与其紧密相关的同类致病菌中。
TB-SA基因的表达，只有在结核杆菌侵入人体巨噬细胞内才发生，排除接种卡介苗的人群对实验结果的影响，有效控制假阳性。
TB-SA抗原蛋白是一种分泌性蛋白，容易被机体识别并引起免疫应答从而产生特异性抗体，在国内应用显示灵敏度可以达到80%以上。