第十三章生化药物制造工艺酶类药物
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第四节酶类药物
一、酶类药物的原料来源 （一）原料选择 选料应注意以下几点： （1）不同酶的原料选择。 （ 2 ）注意不同生长发育情况及营养状况：微生物制 酶，故需测其活力来决定取酶阶段。要考虑动物年龄 及饲养条件等因素；
（3）从原料来源是否丰富考虑；
（4）从简化提纯步骤着手。 （ 5 ）如用动物组织作原料，则此动物宰杀后应立即 取材。 从动物或植物中提取酶受到原料的限制。
（1）干燥法
干燥方法很多，常见有空气干燥、真空干燥和冷冻 干燥三种。
（2）机械法
常用的方法有研磨法，组织匀浆法，超声波法， 高压匀浆法等。 （3）酶法处理 用得最多的是溶菌酶，也有用脱氧核糖核酸酶处理， 操作与溶菌酶同。
（二）酶的提取
一般在提取前，应通过调查研究，文献检索，详 细了解欲提取酶的性质。
3、表面活性剂法
表面活性剂分子具有亲水性的或疏水性的原子基 团。表面活性剂能与蛋白质结合而分散在溶液中，故 可用于提取结合酶，但此法用得较少。 （三）酶制剂的工业提取法 工业生产的酶有二种剂型——液体制剂和粉剂 1、发酵液的预处理及过滤 现在处理方法是，在发酵液中加絮凝剂或凝固剂。 微生物发酵液的分离，过滤，常采用的设备是转 鼓式真空吸滤机、离心沉降分离机和板框压滤机。
2、酶液的脱色
工业上廉价的脱色剂是活性炭，用量通常为 0 ． 1 ％～1．5％。
目前工业上大规模使用脱色树脂国内生产的几种 脱色树脂，效果都较好。
3、盐析法 盐析法的优点是在常温下不会造成酶的失活，若 分级沉淀应用得当，杂蛋白杂质也较少，适用于多种 酶沉淀。
4、有机溶剂法
用有机溶剂沉淀蛋白质及用分级沉淀法纯化蛋白 质。工业上通常采用乙醇作为沉淀剂。
（3）选择性变性法
利用蛋白质稳定性的不同，除去杂蛋白。甚至可 用2．5％三氯乙酸处理，这时其他杂蛋白都变性而沉 淀。
（4）核酸沉淀剂法
在用微生物制备酶时，常含有较多的核酸，为此， 可用核酸酶，将核酸降解成核苷酸。
也可用一些核酸沉淀剂如二甲基十六烷基溴化铵、 硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白和二氯化锰等：
本节重点讨论酶在纯化过程中遇到的一些技术难点。
1、杂质的除去
酶提取液中，除所需酶外，还含有大量的杂蛋白、 多糖、脂类和核酸等。
（1）pH和加热沉淀法
利用蛋白质酸碱变性性质的差别可以通过调 pH 和 等电点除去某些杂蛋白，也可利用不同蛋白质对热稳 定的差异，使杂蛋白变性而沉淀。 （2）蛋白质表面变性法 利用蛋白质表面变性性质的差别，也可除去杂蛋白。 例如：加入三氯甲烷和乙醇进行震荡，可以除去杂蛋 白。
提取方法主要有水溶液法，有机溶剂法和表面活 性剂法三种。
1、水溶液法
常用稀盐溶液或缓冲液提取。为了防止提取过程 中酶活力降低，一般在低温下操作。
2、有机溶剂法
某些结合酶如微粒体和线粒体膜的酶，由于和脂 质牢固结合，用水溶液很难提取，为此必须除去结合 的脂质，且不能使酶变性。 最常用的有机溶剂是丁醇。 丁醇具有下述性能： ① 亲脂性强，特别是亲磷脂的能力； ② 兼具亲水性，在0℃在水中的溶解度为10.5％； ③ 在脂与水分子间能起类似去垢剂的桥梁作用。
用微生物发酵法生产药用酶，不受季节、气候和 地域的限制，生产周期短，产量高，成本低，能大规 模生产。
来自百度文库
（二）微生物酶制剂高产菌株的选育
菌种是工业发酵生产酶制剂的重要条件。 目前，优良菌种的获得有三条途径： ①是从自然界分离筛选； ②是用物理或化学方法处理、诱变； ③是用基因重组与细胞融合技术。 微生物的分离筛选是一切工作的基础。
（三）微生物酶制剂生产的发酵技术
有了优良的生产菌株，只是酶生产的先决条件， 要有效地进行生产还必须探索菌株产酶的最适培养条 件。首先要合理选择培养方法、培养基、培养温度、 pH和通气量等。 在工业生产中还要摸索一系列工程和工艺条件， 如培养基的灭菌方式、种子培养条件、发酵罐的型式、 通气条件、搅拌速度、温度和pH调节控制等。 还要研究酶的分离提纯技术和制备工艺，这些条 件的综合结果将决定酶生产本身的经济效益。
二、酶类药物的提取和纯化
（一）生物材料的预处理 一般应避免剧烈处理，但如是结合酶，则必须进 行剧烈处理。 1、动物材料的预处理
（1）机械处理
用绞肉机绞，一般细胞并不破碎，而有的酶必须 细胞破碎后才能有效地提取，因此须采用特殊的匀浆 才行。
在实验室常用的是玻璃匀浆器和组织捣碎器。
工业上可用高压匀浆泵。 （2）反复冻融 由于细胞中冰晶的形成，及剩下液体中盐浓度的 增高，能使细胞中颗粒及整个细胞破碎，从而使某些 酶释放出来。
5、喷雾干燥直接制各粉末酶制剂
喷雾干燥有很大局限性，尤其药用酶制剂都很难过 温度这一关。 喷雾干燥用于菌体干燥，而药用酶常用冷冻干燥。 除上述方法外，工业上提取酶制剂的方法还有丹 宁沉淀法、白土活性氧化铝吸附法、pH或加热沉淀 法、蛋白质表面变性法等。
（四）酶的纯化
酶的纯化。评价主要看二个指标，一是酶比活， 二是总活力回收。
（3）丙酮粉
组织经丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉，不仅可减 少酶的变性，同时因细胞结构成分的破碎使蛋白质与 脂质结合的某些化学键打开，促使某些结合酶释放到 溶液中，真空干燥即得丙酮粉。 丙酮粉在低温下可保存数年。 2、微生物的预处理 要是酶是胞外酶，则可除去菌体后再直接从发酵 液中吸附提取酶。但对胞内酶则需将菌体细胞破壁， 制成无细胞的悬液后再行提取。
把酶提纯到一定纯度以后（通常纯度应达 50 ％以 上），可使其结晶，但伴随着结晶的形成，酶的纯度 经常有一定程度的提高。 酶的结晶既是提纯的结果，也是提纯的手段，此 外，为研究蛋白质空间结构提供Ⅹ射线衍射样品，也 是酶的结晶的重要目标之一。
（1）酶的结晶方法 酶的结晶方法主要是缓慢地改变酶蛋白的溶解度， 使其略处于过饱和状态。
（5）将酶与底物结合， 酶和底物结合或竞争性抑制剂结合后，稳定性大 大提高，这样就可用加热法除去杂蛋白。
2、脱盐和浓缩
（1）脱盐 酶的提纯以及酶的性质研究中，常常需要 脱盐。最常用的脱盐方法是透析和凝胶过滤。
（2）浓缩 酶的浓缩方法很多，有冷冻干燥、离子交 换、超滤、凝胶吸水、聚乙二醇吸水等。
3、酶的结晶
一、酶类药物的原料来源 （一）原料选择 选料应注意以下几点： （1）不同酶的原料选择。 （ 2 ）注意不同生长发育情况及营养状况：微生物制 酶，故需测其活力来决定取酶阶段。要考虑动物年龄 及饲养条件等因素；
（3）从原料来源是否丰富考虑；
（4）从简化提纯步骤着手。 （ 5 ）如用动物组织作原料，则此动物宰杀后应立即 取材。 从动物或植物中提取酶受到原料的限制。
（1）干燥法
干燥方法很多，常见有空气干燥、真空干燥和冷冻 干燥三种。
（2）机械法
常用的方法有研磨法，组织匀浆法，超声波法， 高压匀浆法等。 （3）酶法处理 用得最多的是溶菌酶，也有用脱氧核糖核酸酶处理， 操作与溶菌酶同。
（二）酶的提取
一般在提取前，应通过调查研究，文献检索，详 细了解欲提取酶的性质。
3、表面活性剂法
表面活性剂分子具有亲水性的或疏水性的原子基 团。表面活性剂能与蛋白质结合而分散在溶液中，故 可用于提取结合酶，但此法用得较少。 （三）酶制剂的工业提取法 工业生产的酶有二种剂型——液体制剂和粉剂 1、发酵液的预处理及过滤 现在处理方法是，在发酵液中加絮凝剂或凝固剂。 微生物发酵液的分离，过滤，常采用的设备是转 鼓式真空吸滤机、离心沉降分离机和板框压滤机。
2、酶液的脱色
工业上廉价的脱色剂是活性炭，用量通常为 0 ． 1 ％～1．5％。
目前工业上大规模使用脱色树脂国内生产的几种 脱色树脂，效果都较好。
3、盐析法 盐析法的优点是在常温下不会造成酶的失活，若 分级沉淀应用得当，杂蛋白杂质也较少，适用于多种 酶沉淀。
4、有机溶剂法
用有机溶剂沉淀蛋白质及用分级沉淀法纯化蛋白 质。工业上通常采用乙醇作为沉淀剂。
（3）选择性变性法
利用蛋白质稳定性的不同，除去杂蛋白。甚至可 用2．5％三氯乙酸处理，这时其他杂蛋白都变性而沉 淀。
（4）核酸沉淀剂法
在用微生物制备酶时，常含有较多的核酸，为此， 可用核酸酶，将核酸降解成核苷酸。
也可用一些核酸沉淀剂如二甲基十六烷基溴化铵、 硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白和二氯化锰等：
本节重点讨论酶在纯化过程中遇到的一些技术难点。
1、杂质的除去
酶提取液中，除所需酶外，还含有大量的杂蛋白、 多糖、脂类和核酸等。
（1）pH和加热沉淀法
利用蛋白质酸碱变性性质的差别可以通过调 pH 和 等电点除去某些杂蛋白，也可利用不同蛋白质对热稳 定的差异，使杂蛋白变性而沉淀。 （2）蛋白质表面变性法 利用蛋白质表面变性性质的差别，也可除去杂蛋白。 例如：加入三氯甲烷和乙醇进行震荡，可以除去杂蛋 白。
提取方法主要有水溶液法，有机溶剂法和表面活 性剂法三种。
1、水溶液法
常用稀盐溶液或缓冲液提取。为了防止提取过程 中酶活力降低，一般在低温下操作。
2、有机溶剂法
某些结合酶如微粒体和线粒体膜的酶，由于和脂 质牢固结合，用水溶液很难提取，为此必须除去结合 的脂质，且不能使酶变性。 最常用的有机溶剂是丁醇。 丁醇具有下述性能： ① 亲脂性强，特别是亲磷脂的能力； ② 兼具亲水性，在0℃在水中的溶解度为10.5％； ③ 在脂与水分子间能起类似去垢剂的桥梁作用。
用微生物发酵法生产药用酶，不受季节、气候和 地域的限制，生产周期短，产量高，成本低，能大规 模生产。
来自百度文库
（二）微生物酶制剂高产菌株的选育
菌种是工业发酵生产酶制剂的重要条件。 目前，优良菌种的获得有三条途径： ①是从自然界分离筛选； ②是用物理或化学方法处理、诱变； ③是用基因重组与细胞融合技术。 微生物的分离筛选是一切工作的基础。
（三）微生物酶制剂生产的发酵技术
有了优良的生产菌株，只是酶生产的先决条件， 要有效地进行生产还必须探索菌株产酶的最适培养条 件。首先要合理选择培养方法、培养基、培养温度、 pH和通气量等。 在工业生产中还要摸索一系列工程和工艺条件， 如培养基的灭菌方式、种子培养条件、发酵罐的型式、 通气条件、搅拌速度、温度和pH调节控制等。 还要研究酶的分离提纯技术和制备工艺，这些条 件的综合结果将决定酶生产本身的经济效益。
二、酶类药物的提取和纯化
（一）生物材料的预处理 一般应避免剧烈处理，但如是结合酶，则必须进 行剧烈处理。 1、动物材料的预处理
（1）机械处理
用绞肉机绞，一般细胞并不破碎，而有的酶必须 细胞破碎后才能有效地提取，因此须采用特殊的匀浆 才行。
在实验室常用的是玻璃匀浆器和组织捣碎器。
工业上可用高压匀浆泵。 （2）反复冻融 由于细胞中冰晶的形成，及剩下液体中盐浓度的 增高，能使细胞中颗粒及整个细胞破碎，从而使某些 酶释放出来。
5、喷雾干燥直接制各粉末酶制剂
喷雾干燥有很大局限性，尤其药用酶制剂都很难过 温度这一关。 喷雾干燥用于菌体干燥，而药用酶常用冷冻干燥。 除上述方法外，工业上提取酶制剂的方法还有丹 宁沉淀法、白土活性氧化铝吸附法、pH或加热沉淀 法、蛋白质表面变性法等。
（四）酶的纯化
酶的纯化。评价主要看二个指标，一是酶比活， 二是总活力回收。
（3）丙酮粉
组织经丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉，不仅可减 少酶的变性，同时因细胞结构成分的破碎使蛋白质与 脂质结合的某些化学键打开，促使某些结合酶释放到 溶液中，真空干燥即得丙酮粉。 丙酮粉在低温下可保存数年。 2、微生物的预处理 要是酶是胞外酶，则可除去菌体后再直接从发酵 液中吸附提取酶。但对胞内酶则需将菌体细胞破壁， 制成无细胞的悬液后再行提取。
把酶提纯到一定纯度以后（通常纯度应达 50 ％以 上），可使其结晶，但伴随着结晶的形成，酶的纯度 经常有一定程度的提高。 酶的结晶既是提纯的结果，也是提纯的手段，此 外，为研究蛋白质空间结构提供Ⅹ射线衍射样品，也 是酶的结晶的重要目标之一。
（1）酶的结晶方法 酶的结晶方法主要是缓慢地改变酶蛋白的溶解度， 使其略处于过饱和状态。
（5）将酶与底物结合， 酶和底物结合或竞争性抑制剂结合后，稳定性大 大提高，这样就可用加热法除去杂蛋白。
2、脱盐和浓缩
（1）脱盐 酶的提纯以及酶的性质研究中，常常需要 脱盐。最常用的脱盐方法是透析和凝胶过滤。
（2）浓缩 酶的浓缩方法很多，有冷冻干燥、离子交 换、超滤、凝胶吸水、聚乙二醇吸水等。
3、酶的结晶