微生物鉴定中常用的生理生化试验史倩
微生物的鉴定中常用地生理生化试验
一、实验目的1.证明不同微生物对各种有极大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。
2.掌握微生物大分子物质水解实验的原理和方法。
3.了解糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中重要作用。
4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。
5.了解IMViC的原理。
二、实验原理由于各种微生物具有不同的酶系统，所以他们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。
具体的原理如下：1.淀粉水解试验：在淀粉固体培养基上接种两种细菌（枯草杆菌，大肠杆菌），培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。
2.糖发酵试验：不同的细菌分解糖的能力不同，有些细菌能利用糖发酵产酸和产气，有些则不能。
酸在加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。
若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。
3.IMVC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。
（1）吲哚试验：在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。
本次不做该试验。
（2）甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙酸和乳酸等多种有机酸，是培养液PH值降至4.2以下，加入甲基红后溶液呈红色。
三、实验材料1.菌种大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球(Staphyloccocus aureus Rosenbach)，铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis Cohn），产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，普通变形杆菌（Proteus.vulgaris)。
细菌常用生理生化鉴定
细菌鉴定中常用的生理生化反应录入时间:2009-8-13 15:12:12 来源：中国生命科技论坛1、实验原理（1）细菌生化试验各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或少地各有区别，可供鉴别细菌之用。
用生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生化反应。
（2）糖（醇）类发酵试验不同的细菌含有发酵不同糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同。
其产生的代谢产物亦不相同，如有的产酸产气，有的产酸不产气。
酸的产生可利用指示剂来判定。
在配制培养基时预先加入溟甲酚紫［P HS . 2 （黄色）一6 . 8 （紫色）] ，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。
气体产生可由发酵管中倒置的杜氏小管中有无气泡来证明。
（3）甲基红（Methylred ）试验（该试验简称MR 试验）很多细菌，如大肠杆菌等分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH 降低到4 . 2 以下，这时若加甲基红指示剂呈现红色。
因甲基红指示剂变色范围是pH4 . 4 （红色）一pH6 . 2 （黄色）。
若某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，但很快将丙酮酸脱梭，转化成醇等物，则培养基的pH 仍在6 . 2 以上，故此时加入甲基红指示剂，呈现黄色。
（4）大分子物质代谢实验．靛基质（口引睬）试验某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的色氨酸，产生靛基质（叫睬），靛基质与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成玫瑰色靛基质（红色化合物）。
硫化氢试验某些细菌能分解含硫的氨基酸（肌氨酸、半肌氨酸等），产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铅盐或铁盐，形成黑色沉淀硫化铅或硫化铁。
为硫化氢试验阳性，可借以鉴别细菌。
明胶液化实验某些细菌具有胶原酶，使明胶被分解，失去凝固能力，呈现液体状态，是为阳性。
淀粉水解试验（在紫外诱变中做，本实验不做）细菌对大分子的淀粉不能直接利用，须靠产生的胞外酶（淀粉酶）将淀粉水解为小分子糊精或进一步水解为葡萄糖（或麦芽糖），再被细菌吸收利用，细菌水解淀粉的过程可通过底物的变化来证明，即用碘测定不再产生蓝色。
微生物鉴定中常用的生理生化实验
球菌。
3.将接种后的试管置于20度中培养3~5天。 4.观察明胶液化情况。
穿刺接种
1)手持试管。 2)旋松棉塞。 3)右手拿接种针在火焰上将针 端灼烧灭菌接着把在穿刺中可能伸入 试管的其他部位，也灼烧灭菌； 4)用右手的小指和手掌边拔出 棉塞。接种针先在培养基部分冷却， 再用接种针的针尖沾取少量菌种。 5)将接种过的试管直立于试管 架上，放在37℃或28℃恒温箱中培 养。24h后观察结果 注意：若具有运动能力的细菌， 它能沿着接种线向外运动而弥散， 故 形成的穿刺线较粗而散、反之则 细而密。
运输至细胞内。
如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精、双糖和单糖，这过程可
通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。
淀粉遇碘液会产生蓝色，在细菌水 解淀粉的区域，用碘液测定时不再 产生蓝色，表明细菌产生淀粉酶。
2.明胶液化试验：
明胶是由胶原蛋白水解产生的蛋白质，在25℃以下可维持凝胶状
态，以固体形式存在，而在25℃以上明胶会液化。
(三)、尿素实验
1.取2支尿素培养基斜面试管，用记号笔标明各管欲接种的菌名。 2. 分别接种普通变形杆菌和金黄色葡萄球菌。 3.将接种后的试管置于35°C中培养24~28小时。 4. 观察培养基颜色变化。
（四）、硫化氢试验
1.用接种针将大肠杆菌、产气肠杆菌分别穿刺接入2支醋酸铅培 养基中。 2.置于37度培养48小时后，观察有无黑色硫化铅的产生。
丙酮酸等，使pH升至大约6。因此大肠杆菌为阳性，产气肠杆菌为阴性。
6.柠檬酸盐试验：
柠檬酸盐试验是用来检测柠檬酸是否被利用。
有些细菌利用柠檬酸盐作为碳源；而另一些细菌不能利用柠
檬酸盐，如产气肠杆菌。
微生物大小与菌群数量的测定实验 史倩
微生物大小与菌群数量的测定实验一、实验目的1.学习并掌握微生物大小及菌落数量的测量方法2.了解血细胞计数板和显微镜测微尺的使用二、实验原理酵母菌（yeast）是一群单细胞的真核微生物。
这个词语为无分类学意义的普通名称，通常用于以裂殖或芽殖来进行无性繁殖的单细胞真菌，以与霉菌分开。
大多数酵母菌为单细胞，在光学显微镜下，一般呈卵圆形、圆形、圆柱形或柠檬形。
大小约为（1-5）μm╳（5-30）μm，最大可达100μm。
各种酵母菌有其一定的大小和形态，但也随菌龄和环境条件而异。
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是芽孢杆菌属的一种。
单个细胞0.7～0.8×2～3μm，着色均匀。
无荚膜，周生鞭毛，能运动。
革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5μm，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
显微测微尺包括镜台测微尺和目镜测微尺两部分。
镜台测微尺是中央部分刻有精确等分线的载玻片，一般将1mm等分为100格，每格长l0μm（即0.0lmm），是专门用来校正目镜测微尺的。
校正时，将镜台测微尺放在载物台上，由于镜台测微尺与细胞标本是处于同一位置，都要经过物镜和目镜的两次放大成象进入视野，因此从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以可求出目镜测微尺每格所代表的长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本片，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物大小。
目镜测微尺是一块可放在接目镜内的隔板上的圆形小玻片，其中央刻有精确的刻度，等分成100小格两种，每5小格间有一长线相隔。
由于所用接目镜放大倍数和接物镜放大倍数的不同，目镜测微尺每小格所代表的实际长度也就不同，因此，目镜测微尺不能直接用来测量微生物的大小，在使用前必须用镜台测微尺进行校正，以求得在一定放大倍数的接目镜和接物镜下该目镜测微尺每小格的相对值，然后才可用来测量微生物的大小。
镜台测微尺是一个特制载玻片中央封固的标准刻尺，其尺度总长为1mm，精确分为10个大格，每个大格又分为10个小格，共100个小格，每一个小格长度为0.01mm，即10μm。
细菌鉴定中常用的生理生化反应实验报告
细菌鉴定中常用的生理生化反应实验报告一、引言在微生物学中，鉴定细菌的方法有很多种，其中生理生化反应实验是最常用的一种方法之一。
生理生化反应实验可以通过观察细菌对不同物质的代谢情况来确定其种类和特性。
本报告将介绍细菌鉴定中常用的生理生化反应实验。
二、目的本报告旨在介绍常用的生理生化反应实验，包括试剂、操作步骤、结果解释等内容，以帮助读者更好地了解和掌握这些实验。
三、材料与方法1. 大肠杆菌（Escherichia coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）培养基；2. 硝酸盐还原试剂；3. 糖类试剂：葡萄糖、果糖、半乳糖；4. 氨基酸试剂：天冬氨酸、赖氨酸；5. 酶试剂：淀粉酶、蛋白酶；6. 无水硫酸铜溶液。
四、实验步骤及结果解释1. 硝酸盐还原试验步骤：（1）取一支细菌液体培养物，加入硝酸盐还原试剂；（2）观察液体颜色变化。
结果解释：若液体变为红色，则表示细菌能够还原硝酸盐为亚硝酸盐，是亚硝化菌。
若无颜色变化，则表示细菌不能还原硝酸盐。
2. 糖类代谢试验步骤：（1）取三个试管，分别加入葡萄糖、果糖、半乳糖；（2）加入相同量的细菌液体培养物；（3）观察试管内气泡产生情况。
结果解释：若在葡萄糖试管内产生了气泡，则表示该细菌能够利用葡萄糖进行发酵代谢；若在果糖或半乳糖试管内产生了气泡，则表示该细菌能够利用果糖或半乳糖进行发酵代谢。
3. 氨基酸代谢试验步骤：（1）取两个试管，分别加入天冬氨酸和赖氨酸；（2）加入相同量的细菌液体培养物；（3）观察试管内气泡产生情况。
结果解释：若在天冬氨酸试管内产生了气泡，则表示该细菌能够利用天冬氨酸进行代谢；若在赖氨酸试管内产生了气泡，则表示该细菌能够利用赖氨酸进行代谢。
4. 酶代谢试验步骤：（1）取两个试管，分别加入淀粉和蛋白质；（2）加入相同量的细菌液体培养物；（3）观察试管内颜色变化情况。
结果解释：若在淀粉试管内出现了透明带，则表示该细菌能够分泌淀粉酶；若在蛋白质试管内出现了变色，则表示该细菌能够分泌蛋白酶。
细菌鉴定中常用的生理生化反应实验报告再解读
细菌鉴定中常用的生理生化反应实验报告再解读知识专栏：细菌鉴定中常用的生理生化反应实验报告再解读封面图片：一位实验室技术人员在显微镜下观察细菌培养物导语：在细菌学研究领域，生理生化反应实验是常用的方法之一，它可以帮助我们了解细菌的特性、代谢途径以及与环境的相互作用。
本文将对细菌鉴定中常用的生理生化反应实验报告进行具体解读，帮助读者更深入地了解细菌的鉴定过程及意义。
一、实验背景和目的在细菌鉴定中，我们经常需要对待测的细菌进行分类和鉴定。
而生理生化反应实验是一种非常重要的手段，能够通过观察细菌对不同化学试剂的反应，以及产物的生成情况等特征，来判断细菌的性质。
本实验的目的即是通过几项常用的生理生化反应实验，进一步探究待测细菌的特性和代谢途径。
二、实验方法1. 大肠杆菌的蛋白酶试验（编号：1）在本实验中，我们采用的是凝固酶试纸。
观察到试剂的颜色发生变化，即从黄色转变为品红色，说明大肠杆菌在此试验中结果为阳性。
进一步解读：凝固酶是一种能够水解胶原蛋白的酶，大肠杆菌能够产生这种酶，因此在这一试验中呈阳性反应。
这可以帮助我们进一步确认待测菌株是大肠杆菌，从而对其进行鉴定分类工作。
2. 肺炎克雷伯氏菌的氧化/发酵试验（编号：2）我们使用菲斯氏培养基进行此实验，观察培养基颜色变化。
如果培养基由绿色变为黄色，表示菌株对葡萄糖的进行氧化反应，即为氧化阳性；如果培养基继续保持绿色，表示菌株对葡萄糖进行发酵，即为发酵阳性。
进一步解读：肺炎克雷伯氏菌对葡萄糖的氧化/发酵反应具有很重要的意义。
通过此实验，我们可以判断菌株的能量代谢途径是氧化还是发酵，并且可以辅助鉴定菌株的种类。
3. 金黄色葡萄球菌的氧化/发酵试验（编号：3）氧化/发酵试验在金黄色葡萄球菌的鉴定中也扮演着重要的角色。
在此实验中，当培养基由紫色变为黄色时，表示菌株对葡萄糖的进行氧化反应，即为氧化阳性；若培养基继续保持紫色，表示菌株对葡萄糖进行发酵，即为发酵阳性。
进一步解读：金黄色葡萄球菌的氧化/发酵反应结果也能帮助我们确定菌株的代谢途径，并对其分类鉴定提供重要依据。
细菌鉴定中常用的生理生化反应
实验原理
n 细菌生化试验
n 各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基 质的分解能力也不一样，因而代谢产物或多或 少地各有区别，可供鉴别细菌之用。用生化试 验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其 代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌 的生化反应。
实验原理－－细菌生化试验
n 糖(醇)类发酵试验
n 注意甲基红试剂不要加的太多，以免出现假阳性。
实验步骤
n 甲基红试验(MR试验)
n 将大肠杆菌和枯草杆菌分别接种到葡萄糖蛋白胨 水培养基中，37℃培养 48h，加甲基红指示剂2滴， 观察结果，呈现红色者为阳性，呈现黄色者为阴 性。
Methyl Red Test
V.P试验
n 测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末 端产物的能力，如丙酮酸。丙酮酸进行缩合、 脱羧生成乙酰甲基甲醇，该物质在碱性条件下 被空气中的氧气氧化成二乙酰，二乙酰与蛋白 胨中精氨酸中的胍基作用生成红色化合物。
n 靛基质(吲哚)试验
n 某些细菌，如大肠杆菌，能分解蛋白质中的色 氨酸，产生靛基质(吲哚)，靛基质与对二甲基 氨基苯甲醛结合，形成玫瑰色靛基质(红色化合 物)。
实验步骤
n 靛基质(吲哚)试验
n 将被检菌接种到胰蛋白胨水培养基中，37℃ 培养24h～48h后，加入10-20滴乙醚，振荡数 次，静置1－3分钟，沿试管壁滴加2滴吲哚试 剂（对二甲基氨基苯甲酸）于培养物液面， 观察结果。
铺满整个平板。如菌苔周围有无色透明圈出现，说明淀粉已被 水解。透明圈的大小，说明该菌水解淀粉能力的大小。
记录
1 2 34 5 678 Escherichia coli + + + + - - - Bacillus subtilis - - - - + + + +
微生物鉴定的生理生化反应汇总
微生物鉴定的生理生化反应汇总因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。
用生物可用来区别和鉴定细菌的种类。
利用生物化学方法来鉴别不同称为细菌的生物化学试验或称生化反应。
生物化学试验的方法很多，主要有以下几类。
一、碳水化合物的代谢试验．糖（醇、苷）类发酵试验（1）原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷）(2)方法：在基础培养基中（如酚红肉汤基础培养基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特多元醇和环醇等，见表6-4-1。
将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中，置35℃(3)结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变，产气的细菌可在小倒管（Durham小管）中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。
不(4)应用：糖（醇、苷）类发酵试验，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不不同的糖（醇、苷）类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃即便是两种细菌均可发酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，但前者仅产酸，而后者则产酸、产气，故可利用此表6-4-1 常用于细菌糖发酵试验的糖、醇类四碳糖：赤藓糖 , 五碳糖：核糖核酮糖木糖阿拉伯糖, 六碳糖：葡萄糖果半乳糖甘露糖蔗糖（葡萄糖＋果糖）乳糖（葡萄糖＋半乳糖）麦芽糖（两分子葡萄糖）棉子糖（葡萄糖＋果糖＋半乳糖）菊糖（多分子果糖）淀粉侧金盏花醇卫茅醇甘露醇山梨醇肌醇．葡萄糖代谢类型鉴别试验原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降不分解葡萄糖的细菌为产碱型。
发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分O/F或－Leifson，HL）试验，可用于区别细菌的代谢类型。
方法：挑取少许纯培养物（不要从选择性平板中挑取）接种2支HL培养管中，在其中一0.5cm的无菌液体石蜡以隔绝空气（作为密封管），另一管不加（作为开。
置35℃孵箱孵育48h以上。
(3)结果：两管培养基均不产酸（颜色不变）为阴性；两管都产酸（变黄）为发酵型；加(4)应用：主要用于肠杆菌科与其它非发酵菌的鉴别。
实验五 细菌鉴定中常见的生理生化反应
实验仪器：32度恒温培养箱、4度冰箱；
微生物材料：大肠杆菌、变形杆菌、枯草杆菌、产气杆菌、待鉴定的未知菌的平板单菌落；
试剂：甲基红试剂、V.P.试剂、吲哚试剂，KOH溶液；
实验用具：
试管：每个试验3根试验管，1根对照管，8个试验，共32管；
杜氏小管、接种环、接种针、酒精灯、火柴、试管架、记号笔。
红色
/
黄色
/
桔红色
淡黄色
伏-普试验
黄色
红色
红色
淡黄色
吲哚试验
玫瑰红色
/
玫瑰红色
/
无色
淡黄色
硫化氢试验
黄色
/
/
黑色从中间向外蔓延
黄色
ห้องสมุดไป่ตู้黄色
明胶液化试验
无液体
/
无液体
/
液体
无液体
柠檬酸盐利用试验
下蓝上黄
/
下黄上蓝
/
下蓝上黄
绿色
淀粉试验
紫色
紫色
紫色
黄色
紫色
紫色
表2. 各项生理生化实验现象及意义
阳性
阴性（对照）
硫化氢试验：变形杆菌、乙型副伤寒杆菌等能分解含硫氨基酸如胱氨酸、甲硫氨酸等，生成硫化氢。
3. 假设某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现怎样的结果？
不产酸，产气。有机酸将被转化为非酸性末端产物，培养基呈黄色。葡萄糖发酵实验中，培养基颜色由紫变黄，杜氏小管中气体超过10%。
4. 通过哪些生理生化反应可以区分大肠杆菌和变形杆菌？
图1 葡萄糖发酵（从左到右依次为对照、大肠杆菌、未知菌、变形杆菌）
图2 乳糖发酵（从左到右依次为对照、未知菌、变形杆菌、大肠杆菌）
微生物鉴定中常用的生理生化实验
微生物鉴定中常用的生理生化实验摘要：大分子物质水解试验中，将所要检测的菌种（枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）接种到淀粉培养基和油脂培养基上，培养一段时间后在淀粉培养基滴上碘液，通过比较透明圈来判断各微生物水解淀粉能力的强弱；观察油脂培养基上是否有红斑点产生来判断微生物是产生脂肪酶。
糖发酵试验中向葡萄糖发酵培养基试管和乳糖培养基试管中各接种大肠杆菌和变形杆菌，并留一空白培养基试管对照。
经过一段时间培养后对试管中的颜色变化和产气情况进行观察。
IMVIC 试验中向蛋白胨培养基和葡萄糖蛋白胨水培养基中各接种上大肠杆菌和产气杆菌，经过一段时间培养后，向葡萄糖培养基的培养物中滴上甲基红试剂，通过颜色变化来判断微生物生长代谢产物中是否有有机酸产生；向蛋白胨培养基中先加入适量的乙醚后再沿壁加入对二甲基氨基苯甲醛试剂，根据产生红色反应层与否来判断微生物生长代谢中是否有产生吲哚，进而来判断微生物对色氨酸是否有分解能力。
关键词接种无菌操作前言微生物必须依靠包外酶对大分子物质进行水解后才能被其加以利用，这些过程均可通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。
淀粉遇碘液时显蓝色，当滴有碘液后不显蓝色则说明细菌产生了淀粉酶；脂肪水解后会产生脂肪酸降低培养基的PH值，使培养基中含有的中性红试剂由淡红色转变为深红色，说明细胞外存在脂肪酶。
绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源，但是它们在分解糖类物质的能力上有很大的差异，有些细菌能分解某种糖产生的有机酸和气体，有些细菌只产酸不产气。
大肠杆菌能分解葡萄糖和乳糖并产酸产气；变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。
当发酵产酸时，培养基试管中的培养液会由紫色转变为黄色，当产气时，试管中的倒置德汉氏小管中会有气泡。
有些细菌能产生分解蛋白胨中色氨酸的色氨酸酶，分解产生吲哚和丙酮酸。
吲哚与对二甲基氨基苯甲醛结合，形成红色的玫瑰吲哚。
在细菌代谢糖产生酸时，培养基就会变使加入培养基中的甲基红指示剂变红。
微生物鉴定的生理生化反应汇总
微生物鉴定的生理生化反应各种细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。
用生物化学方法测定这些代谢产物，可用来区别和鉴定细菌的种类。
利用生物化学方法来鉴别不同细菌，称为细菌的生物化学试验或称生化反应。
生物化学试验的方法很多，主要有以下几类。
一、碳水化合物的代谢试验1．糖（醇、苷）类发酵试验（1）原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。
检查细菌对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。
(2)方法：在基础培养基中（如酚红肉汤基础培养基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特定糖（醇、苷）类。
所使用的糖（醇、苷）类有很多种，根据不同需要可选择单糖、多糖或低聚糖、多元醇和环醇等，见表6-4-1。
将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中，置35℃孵育箱内孵育数小时到两周（视方法及菌种而定）后，观察结果。
若用微量发酵管，或要求培养时间较长时，应注意保持其周围的湿度，以免培养基干燥。
(3)结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变为黄色），产气的细菌可在小倒管（Durham小管）中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。
不分解糖则无变化。
(4)应用：糖（醇、苷）类发酵试验，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不同细菌可发酵不同的糖（醇、苷）类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳糖。
即便是两种细菌均可发酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者则产酸、产气，故可利用此试验鉴别细菌。
表6-4-1 常用于细菌糖发酵试验的糖、醇类单糖四碳糖：赤藓糖, 五碳糖：核糖核酮糖木糖阿拉伯糖, 六碳糖：葡萄糖果糖半乳糖甘露糖双糖蔗糖（葡萄糖＋果糖）乳糖（葡萄糖＋半乳糖）麦芽糖（两分子葡萄糖）三糖棉子糖（葡萄糖＋果糖＋半乳糖）多糖菊糖（多分子果糖）淀粉醇类侧金盏花醇卫茅醇甘露醇山梨醇非糖类肌醇2．葡萄糖代谢类型鉴别试验(1)原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。
微生物鉴定中常用生理生化试验
微⽣物鉴定中常⽤⽣理⽣化试验微⽣物常规⽣理⽣化试验摘要利⽤⼤肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和⾦黄⾊葡萄球菌（Staphylococcus aureus）进⾏淀粉和油脂实验，证明不同微⽣物对各种有机⼤分⼦的⽔解能⼒的不同，从⽽说明不同微⽣物有着不同的酶系统，掌握进⾏微⽣物⼤分⼦⽔解实验的原理和⽅法；使⽤⼤肠杆菌（Escherichia coli）和普通变形杆菌（Proteus vulgaris）进⾏葡萄糖和乳糖发酵试验，了解糖发酵的原理和在肠道细菌鉴定中的重要作⽤，掌握通过糖发酵鉴别不同微⽣物的⽅法；利⽤⼤肠杆菌（Escherichia coli）、产⽓肠杆菌（Enterobacter aerogenes）进⾏吲哚试验和甲基红试验，了解两个实验的反应原理以及在肠道细菌鉴定中的意义和⽅法。
关键词⽣理⽣化⼤分⼦试验糖发酵试验吲哚试验甲基红试验前⾔微⽣物代谢与其他⽣物代谢有着许多相似之处，也有不同之处。
微⽣物代谢重要特征之⼀，就是代谢类型的多样性，因此使得微⽣物在⾃然界的物质循环中起着重要的作⽤，同时也为⼈类开发利⽤微⽣物资源提供更多的机会与途径。
⼈们在微⽣物的分类鉴定⼯作中，常利⽤其⽣理⽣化反应作⽤作为重要依据。
微⽣物对⼤分⼦淀粉、蛋⽩质和脂肪不能直接利⽤，必须靠产⽣的胞外酶将⼤分⼦物质分解才能被微⽣物吸收利⽤。
胞外酶主要为⽔解酶，通过加⽔裂解⼤的物质为较⼩的化合物，使其能被运输⾄细胞内，这些过程均可以通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。
糖发酵试验是常⽤的鉴别微⽣物的⽣化反应，在肠道细菌的鉴定上尤为重要。
绝⼤多数细菌都能利⽤糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖类物质的能⼒上有很⼤的差异。
不同的细菌含有发酵不同糖(醇)的酶，因⽽发酵糖(醇)的能⼒各不相同，其产⽣的代谢产物亦不相同，如有的产酸产⽓，有的产酸不产⽓。
实验五 细菌鉴定中的生理生化实验
四、实验方法
（一）生理生化实验
1、发酵实验 1）接种（商品糖发酵管） 接种（商品糖发酵管） 2）培养（E.C37℃，B.S28℃，开口朝下，培养两天） 培养（E.C37℃ B.S28℃ 开口朝下，培养两天） 3）观察结果 2、V.P实验 V.P实验 1）接种（葡萄糖蛋白胨水培养基） 接种（葡萄糖蛋白胨水培养基） 2）检查（培养2天后加入V.P试剂观察） 检查（培养2天后加入V.P试剂观察 试剂观察） 3、吲哚实验 1）接种（蛋白胨水培养基） 接种（蛋白胨水培养基） 2）检查（培养2天后加入吲哚试剂观察） 检查（培养2天后加入吲哚试剂观察）
一般在每个计数室中取5个中方格进行计数 一般在每个计数室中取 个中方格进行计数: 个中方格进行计数 1ml菌液中的总菌数 菌液中的总菌数=A/5×25×104×B =50000A×1 菌液中的总菌数 × × ×
三、实验材料
1、菌种：大肠杆菌、枯草杆菌、酵母悬液 菌种：大肠杆菌、枯草杆菌、 2、培养基：商品糖发酵管（乳糖、葡萄糖、蔗糖）各2支， 培养基：商品糖发酵管（乳糖、葡萄糖、蔗糖） 蛋白胨水培养基2 葡萄糖蛋白胨水培养基2 蛋白胨水培养基2支，葡萄糖蛋白胨水培养基2 淀粉培养基平板1 石蕊牛乳培养基2 支，淀粉培养基平板1只，石蕊牛乳培养基2支。 3、试剂：V.P试剂、吲哚试剂、碘液 试剂：V.P试剂 吲哚试剂、 试剂、 4、器材：血球计数板等 器材：
五、思考题
1、列表记录实验结果，并简述两种微生物的代谢特性。 列表记录实验结果，并简述两种微生物的代谢特性。
发酵实验
葡萄糖：
V.P实验 V.P实验
吲哚实验 淀粉水解实验 石蕊牛乳实验
E.C
蔗糖： 乳糖： 葡萄糖：
B.S
蔗糖： 乳糖：
微生物鉴定的生理生化反应汇总
微生物鉴定的生理生化反应各种细菌具有各自独特的酶系统，因而对底物的分解能力不同，其代谢产物也不同。
用生物化学方法测定这些代谢产物，可用来区别和鉴定细菌的种类。
利用生物化学方法来鉴别不同细菌，称为细菌的生物化学试验或称生化反应。
生物化学试验的方法很多，主要有以下几类。
一、碳水化合物的代谢试验1．糖（醇、苷）类发酵试验（1）原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。
检查细菌对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力，可用以鉴定细菌种类。
(2)方法：在基础培养基中（如酚红肉汤基础培养基pH7.4）加入0.5~1.0％（w/v）的特定糖（醇、苷）类。
所使用的糖（醇、苷）类有很多种，根据不同需要可选择单糖、多糖或低聚糖、多元醇和环醇等，见表6-4-1。
将待鉴定的纯培养细菌接种入试验培养基中，置35℃孵育箱内孵育数小时到两周（视方法及菌种而定）后，观察结果。
若用微量发酵管，或要求培养时间较长时，应注意保持其周围的湿度，以免培养基干燥。
(3)结果：能分解糖（醇、苷）产酸的细菌，培养基中的指示剂呈酸性反应（如酚红变为黄色），产气的细菌可在小倒管（Durham小管）中产生气泡，固体培养基则产生裂隙。
不分解糖则无变化。
(4)应用：糖（醇、苷）类发酵试验，是鉴定细菌的生化反应试验中最主要的试验，不同细菌可发酵不同的糖（醇、苷）类，如沙门菌可发酵葡萄糖，但不能发酵乳糖，大肠埃希菌则可发酵葡萄糖和乳糖。
即便是两种细菌均可发酵同一种糖类，其发酵结果也不尽相同，如志贺菌和大肠埃希菌均可发酵葡萄糖，但前者仅产酸，而后者则产酸、产气，故可利用此试验鉴别细菌。
表6-4-1 常用于细菌糖发酵试验的糖、醇类单糖四碳糖：赤藓糖, 五碳糖：核糖核酮糖木糖阿拉伯糖, 六碳糖：葡萄糖果糖半乳糖甘露糖双糖蔗糖（葡萄糖＋果糖）乳糖（葡萄糖＋半乳糖）麦芽糖（两分子葡萄糖）三糖棉子糖（葡萄糖＋果糖＋半乳糖）多糖菊糖（多分子果糖）淀粉醇类侧金盏花醇卫茅醇甘露醇山梨醇非糖类肌醇2．葡萄糖代谢类型鉴别试验(1)原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。
实验五--细菌鉴定中常见的生理生化反应
实验五细菌鉴定中常见的生理生化反应一、实验目的。
1)了解细菌生理生化反应原理，掌握细菌鉴定中常见的生理生化反应方法。
2)了解不同细菌对不同含碳、含氮化合物的分解利用情况。
3)了解细菌在不同培养基的不同生长现象及其代谢产物在鉴别细菌中的意义。
二、实验原理。
各种细菌所具有的酶系统不尽相同，对营养基质的分解能力也不一样，因而代谢产物存在差别。
以此用生理生化试验的方法检测细菌对各种基质的代谢作用及其代谢产物，从而鉴别细菌的种属，称之为细菌的生理生化反应。
1.糖（醇）类发酵试验不同的细菌含有发酵不同的糖（醇）的酶，因而发酵糖（醇）的能力各不相同，产生的代谢产物也不同：有的产酸产气，有的产酸不产气。
指示剂溴甲酚紫，pH5.2黄色—pH6.8紫色，当发酵产酸时，培养基将由紫变黄。
产气可由杜氏小管中有无气泡来证明。
2.甲基红试验（M.R试验）甲基红试验，pH4.4红色～pH6.2黄色，是用来检测由葡萄糖产生的有机酸，如甲酸、乙酸、乳酸等。
有些细菌分解糖类产生丙酮酸，丙酮酸进一步反应形成甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的pH降低到4.2以下。
有些细菌在培养的早期产生有机酸，但在后期将有有机酸转化为非酸性末端产物，如乙醇、丙酮酸等，使pH升至大约6。
3.Voges-Proskauer试验（伏-普试验，V.P. 试验）伏-普试验是用来测定某些细菌利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力。
某些细菌分解葡萄糖成丙酮酸，再将丙酮酸缩合脱羧成乙酰甲基甲醇。
乙酰甲基甲醇在碱性条件下，被氧化为二乙酰，二乙酰与培养基中所含的胍基作用，生成红色化合物为V.P.反应阳性。
4.靛基质试验某些细菌，如大肠杆菌，能产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸，产生靛基质，靛基质与对二甲基氨基苯甲酸结合，形成玫瑰色靛基质。
5.硫化氢试验某些细菌能分解含硫的氨基酸，产生硫化氢，硫化氢与培养基中的铁盐反应，形成黑色的硫化铁沉淀，为硫化氢试验阳性。
6.明胶液化实验明胶在25度以下可维持凝胶状态，以固体状态存在，而在25度以上时明胶就会液化。
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微生物鉴定中常用的生理生化试验
一、实验目的
1.证明不同微生物对各种有极大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统。
2.掌握微生物大分子物质水解实验的原理和方法。
3.了解糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中重要作用。
4.掌握通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。
5.了解IMViC的原理。
二、实验原理
由于各种微生物具有不同的酶系统，所以它们能利用的底物不同，或虽利用相同的底物但产生的代谢产物却不同，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别不同的细菌，尤其是在肠杆菌科细菌的鉴定中，生理生化试验占有重要的地位。
具体的原理如下：
1.淀粉水解试验：在淀粉固体培养基上接种四种细菌（枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌），培养两天以后，再往培养基中加碘液染色，若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围的淀粉，淡然在染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。
2.糖发酵试验：不同的细菌分解糖的能力不同，有些细菌能利用糖发酵产酸和产气，有些则不能。
酸在加入溴甲酚指示剂后会使溶液呈黄色，且德汉氏小管中会收集到一部分气体。
若细菌不能使糖产酸产气，则最后溶液为指示剂的紫色，且德汉氏小管中无气体。
3.IMVC实验主要用于快速鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌。
（1）吲哚试验：在蛋白胨培养基中，若细菌能产生色氨酸酶，则可将蛋白胨中的色氨酸分解为丙酮酸和吲哚，吲哚与对二甲基苯甲醛反应生成玫瑰色的玫瑰吲哚。
本次不做该试验。
（2）甲基红试验（MR）：某些细菌在糖代谢过程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者进而被分解产生甲酸，乙酸和乳酸等多种有机酸，是培养液PH值降至4.2以下，加入甲基红后溶液呈红色。
三、实验材料
1.菌种
大肠杆菌（Escherichia coli），金黄色葡萄球(Staphyloccocus aureus Rosenbach)，铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis Cohn），
产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，普通变形杆菌（Proteus.vulgaris)。
2.培养基
固体油脂培养基，固体淀粉培养基，葡萄糖发酵培养基（5支，附德汉式小管），乳糖发酵培养基（5支，附德汉式小管），蛋白胨水培养基，葡萄糖蛋白胨水培养基。
3.溶液和试剂
革兰氏染色用卢戈氏碘液，甲基红指示剂，乙醚和吲哚试剂，无菌水。
4.仪器和其他用品
平板，试管，接种环，试管架，电子天平，称量纸，玻璃棒，三角瓶，烧杯，药匙，标签纸，酒精灯，滴管。
表1相关培养基及其配制
培养基淀粉培养基油脂培养基蛋白胨水培
养基
糖发酵培养基葡萄糖蛋白胨水
培养基
配方蛋白胨2g，
NaCl1g，1g牛肉
膏，0.4g可溶性淀
粉，蒸馏水200ml，
琼脂3~4g
蛋白胨2g，牛肉膏
1g ，NaCl1g香油或
花生油2g，1.6%的中
性红0.2ml，蒸馏水
200ml，琼脂3~4g
蛋白胨2g，
NaCl1g，蒸馏
水200ml，
pH7.6
蛋白胨水培养基
1000ml，1.6%溴甲酚
紫乙醇溶液1~2ml，
pH7.6，另配制葡萄糖
（或乳糖）各10ml
蛋白胨5g，葡萄
糖5g，k
2
HPO
4
2g
蒸馏水1000ml ，
pH7.0~7.2
制备121℃灭菌20min 121℃灭菌20min 121℃灭菌
20min
见下面方法1.2.3.1 分装试管121℃
灭菌20min
四、实验步骤
1淀粉水解实验
1固体淀粉培养基融化后冷却至50℃左右，无菌制作平板。
平板底部划分为四部分。
2将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌分别在不同的部分划线接种，在平板的反面分别写上菌名。
将平板倒置在37℃温箱中培养48h。
3观察各种细菌的生长情况，打开平板的盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。
观察。
2油脂水解实验
1将熔化的固体油脂培养基冷却至50 ℃左右时，充分振荡，使油脂均匀分布，无菌操作倒平板，待凝。
用记号笔在平板底部划成四部分
2将枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌分别用无菌操作划十字接种于平板的相对应的部分的中心，分别标上菌名。
将平板倒置，于37 ℃温箱中培养48h。
3取出平板，观察菌苔颜色。
3糖酵解实验
1制作糖发酵培养基
1将上述含指示剂的蛋白胨水培养基分装于试管中，在每个试管中放一个倒置的德汉式小管，使充满培养液。
2将已分装好的蛋白胨水和20%的各种溶液分别灭菌，蛋白胨水121℃灭菌20min；糖溶液112℃灭菌30min。
3灭菌后，每管以无菌操作分别加入20%的无菌糖溶液0.5ml。
2用记号笔在各试管外壁中分别标明发酵培养基的名称和所接菌种的名称。
3取葡萄糖培养基试管5支，两只接入大肠杆菌、两只普通变形菌，第五只对照。
另取乳糖发酵培养基5支，做同样的处理。
37℃培养48h后观察。
4吲哚实验
1将大肠杆菌和产气肠杆菌分别接入2支蛋白胨水培养基，置于37℃培养48h。
2向培养基中加入3~4滴乙醚，摇动数次，静置1min，待乙醚上升后，沿试管壁徐徐加入2滴吲哚试剂。
在乙醚和培养物之间产生红色环状物为阳性。
5甲基红试验
1将大肠杆菌和产气肠杆菌分别接入2支葡萄糖蛋白胨水培养基，置于37℃培养48h。
2于葡糖糖蛋白胨水培养基的培养物内加甲基红试剂2滴。
培养基变黄为阴性，红为阳性。
五、实验结果
1结果记录
表2大分子水解实验结果记录
大肠杆菌枯草芽孢杆菌铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌淀粉水解- + - -
油脂水解- - + -
注：有水解圈产生为阳性（+），反之为阴性（-）。
表3糖酵解实验结果记录
糖发酵类型大肠杆菌普通变形杆菌对照
葡萄糖发酵+ + -
乳糖发酵没有结果没有结果没有结果
“+”产酸或产气，“-”不产酸或不产气
表4吲哚甲基红实验结果记录
大肠杆菌产气肠杆菌对照
甲基红实验+ - -
吲哚实验没有结果没有结果没有结果
实验失败原因（甲基红&吲哚）：
2
实验照片
结果分析
由大分子水解试验（图1和图2） 可以得出枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌能产生淀粉酶脂肪酶的结论，枯草芽孢杆菌菌落周围的透明圈较铜绿假单胞菌周围的透明圈大，可以大体判断前者较后者代谢利用淀粉的能力强。
大肠杆菌能产生脂肪酶。
通过糖酵解实验（图3和图4）可看出大肠杆菌和普通变形菌都能够分解葡萄糖，但是普通变形菌不能够分解乳糖。
在吲哚试验中，大肠杆菌和产气肠杆菌都能具有分解色氨酸产生吲哚的能力
六、思考题
1．你怎么样解释淀粉酶是胞外酶而非胞内酶？
答：菌苔周围产生水解圈，可知淀粉在细胞外被水解，应该是细菌将淀粉酶分泌到胞外所致，因此为胞外酶。
2．不利用碘液，你怎样证明淀粉水解的存在？
答：淀粉水解为葡萄糖才能被细胞利用，因此可以换用斐林试剂。
呈阳性者则说明产生了葡萄糖，淀粉被水解；阴性者说明淀粉未被水解。
3．假如某种微生物可以有氧代谢葡萄糖，发酵试验应该出现什么结果？
溶于水的量少且碳酸酸性若，因此颜色不变化，仍为紫色。
德汉氏答：由于产生的CO
2
小管中有气柱。
4．讨论IMViC试验在医学检验上的意义。
答：可以鉴别某些疾病是由大肠杆菌还是产气肠杆菌引起的。
5．解释在细菌培养中吲哚检测的化学原理，为什么在这个试验中用吲哚的存在作为色氨酸酶活性的指示剂，而不用丙酮酸？
答：某些细菌可产生色氨酸酶，分解蛋白胨中的色氨酸产生吲哚和丙酮酸。
对二甲基氨基苯甲醛遇吲哚形成玫瑰吲哚，是红色物质，便于观察。
七、实验小结
通过本次实验我们证实了不同微生物对各种有极大分子物质的水解能力不同，从而说明不同微生物有着不同的酶系统；了解了糖发酵的原理和在肠细菌鉴定中重要作用以及IMViC 的原理；并掌握了微生物大分子物质水解实验的原理和方法以及通过糖发酵鉴别不同微生物的方法。
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