高效毛细管电泳
第二章 高效毛细管电泳
毛细管电泳的发展过程
六十年代中期：瑞典科学家Hjerten 首先提出了毛细管区 带电泳（CZE）的方法，被看作毛细管电泳的起点。
1979年：Mikkers等用200μmID的聚四氟乙烯管为分离通 道，获得了很高的分离效率。
1981年：Jorgenson和Lukacs 用75μmID的熔融毛细管做 CZE，在30KV电压下产生了4×105片/m的效率，成为毛细 管电泳发展史上的里程碑。
生物化学家蒂塞利乌斯
A.W.K.蒂塞利乌斯
Arne Wilhelm Kaurin Tiselius
(1902－1971）
蒂塞利乌斯1925年从事胶体溶液中悬浮蛋白质的电泳分离研究。 曾自制超速离心机测定蛋白质分子的大小和形状,并与斯韦德贝里 合作发表了第一篇论文,报道了测定蛋白质淌度的新方法。1930年他 进一步改进实验手段和装置,发表了关于色谱法和吸附的论文。1935 年改建原有电泳装置,发展了区带电泳法,大大提高了效率和分辨率。 1940年他用自己设计的新电泳装置成功地分离了血清中蛋白质的4 个组分,分别命名为:白蛋白α、β、γ和球蛋白。该法迅速应用于分离 和鉴定各种复杂蛋白质及其他天然物质的混合物的组成。他因对电 泳分析和吸附方法的研究,特别是发现了血清蛋白的组分而获得1948 年诺贝尔化学奖。
例1. SDS-PAGE测定蛋白质分子量
剥胶与染色 电泳结束后，关闭电源开关，从电泳槽中取
下凝胶板并卸下硅胶框，用带细长针头的注射器 吸满蒸馏水，将针头插入凝胶与玻板之间，沿玻 板缓缓移动，并缓缓将蒸馏水注人，最后注入少 量空气，取出针头，将两玻板轻轻揭开后即可取 出凝胶板，将之置培养皿中，冲洗胶面后，加入 染色液，染色5h或过夜。
光聚合：核黄素为催化剂(阳光,日光)，制大孔胶。
高效毛细管电泳法
2020/6/13
一、高效毛细管电泳基本原理
HPCE是离子或荷电粒子 以电场为驱动力，在毛细管 中按其淌度或/和分配系数 不同进行高效、快速分离的 一种电泳新技术。由于不同 离子所带电荷及性质的不同， 迁移速率不同可实现分离。 粒子在电场中的迁移速度， 除与电场强度和介电性质有 关外，与粒子的有效电荷及 其大小形状也有关。这些因 素构成了电泳分离的基础。
第七章
一、高效毛细管电泳
液相色谱分析法
基本原理
high performance liquid chromatograph
二、仪器装置 三、影响柱效的因素
第五节
高效毛细管电泳
及改进方法 四、主要特点和应用
（high-performance capillary electrophoresis, HPCE）
2020/6/13
（6）毛细管电色谱(CEC)
在毛细管壁上键合涂渍或填充HPLC固定相微粒 ，以试样和固定相之间的相互作用为分离机制，以电 渗流为流动相驱动力的色谱过程。兼具了HPLC和CE的 优点。
2020/6/13
二、仪器装置
• 电压：0～30KV。 • 紫外或激光诱导荧光检测器 （可检测到：10-19～10-21 mol/L）
电渗流控制：电渗流的 大小和方向依赖于毛细 管壁与溶液间电势的极 性和大小。
使用添加剂可以改变电渗流的大小和方向，如添加 NaCl和甲醇可降低电渗流；加入乙腈则可以增大电渗 流。加入反转剂。则可以改变电渗流的方向。
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四、主要特点和应用
•高分辨率：理论塔板数高达数百万块，甚至数千万块。 •高灵敏度：可检测出低至10-21 mol/L浓度的物质。 •高分析速度：可在3分钟内分离30种阴离子；1.7分钟分离 19种阳离子;4分钟可分离10种蛋白质. •试样用量少：仅需几nL（10-9 L）的试样 •仪器简单，操作成本低，操作简便： •分析一个试样仅需几毫升流动液，溶剂消耗少，环境污染 小。
高效毛细管电泳
5. 毛细管等速电泳（CITP）
是一种较早的模式, 采用先导电解质和后继电解质, 使溶
质按其电泳淌度不同得以分离, 常用于分离离子型物质, 目
前应用不多。
6. 毛细管电渗色谱（CEC）
将HPLC中众多的固定相微粒填充到毛细管中,
以样品与固定相之间的相互作用为分离机制, 以电
渗流为流动相驱动力的色谱过程,虽柱效有所下降,
分离过程
电场作用下，毛细管柱中出现：电泳现象和电渗流现象。
带电粒子的迁移速度=电泳+电渗流；两种速度的矢量和。
正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； 阴离子：两种效应的运动方向相反。ν电渗流 >ν电泳时,阴离子在负 极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离
DNA、RNA分析
抗生素、维生素、糖类、单细胞分析
阴离子的分析
阴离子电泳方向和电渗流方向相反、
速度接近，分析时间长、效率低；
质量小、电荷密度大的离子如：SO42-、 Cl-、F-等，电泳速率大于电渗流，阳极
端流出，在阴极端无法检测；
加入电渗流改性剂，十六烷基三甲基 溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向一 致，可在3.1min内分离36种阴离子；阴 极进样，阳极检测； 离子价态及存在形态分析。
毛细管电泳的几种分离模式
1.毛细管区带电泳（CZE）
带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。 正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出； 中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出； 阴离子：两种效应的运动方向相反；ν电渗流 >ν电泳时,阴离子在
负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于差
高效毛细管电泳
电泳中影响电渗流的因素很多，应设法控制 电渗流的恒定。
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三、HPCE中影响电渗流的因素
1.电场强度的影响
电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度 一定时，电渗流速度正比于工作电压。
2.毛细管材料的影响 酸度影响毛细管的表面 Si-OH基的电离，特别 是在pH4～7范围内，影 响更显著，此时溶液pH 值与EOF成近线性关系
FE qE
q: 溶质离子所带的有效电荷 E: 电场强度 带电粒子在溶液中运动时受到的阻力即摩擦力为
Ff fv ep
v ep
是电泳速度
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f为摩擦系数，其大小与带电粒子的大小、 形状以及介质粘度有关。对于球形离子，f = 6πηγ；对于棒状离子，f = 4πηγ。式中，γ是 溶质离子的动力学半径，η是电泳介质的粘度。 平衡时，电场力和摩擦力相等，即 qE = fvep 电泳速度为
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三、毛细管电泳的分类
按分离模式分类，常用的ＣＥ技术有六种：
毛细管区带电泳，胶束电动毛细管色谱， 毛细管凝胶电泳，毛细管等电聚焦， 毛细管等速电泳 ，毛细管电色谱 毛细管区带电泳是CE中最基本、应用最普遍 的一种模式。
第二节
基本原理
一、电泳和电泳淌度 1. 电泳与电泳速度
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在一定电场强度作用下，溶质带电粒子在 溶液中的定向移动（迁移），这种现象称为 电泳。带电粒子在电场中迁移时，所受的电 场力为
1
毛细管电泳（ capi1lary electrphoresis，CE）和传统电泳的根本区 别在于前者设法使电泳过程在散热效率极高的 毛细管内进行，从而确保引入高的电场强度， 全面改善分离质量。
20世纪30－40年代 蒂塞利乌斯 (A.W.K.Tiselius）建 立了移动界面电泳，将 电泳发展成分离技术 获得1948年诺贝尔化 学奖
高效毛细管电泳HPEC
青霉素发酵液的高效毛细管电泳图
1. 青霉素G钠 ；2. 6-氨基青霉烷酸； 3. 对羟基苯乙酸 ；4. 邻羟基苯乙酸 ；5. 苯乙酸
2. 中药成分分析 如：黄酮及其苷类分析
HPCE条件
毛细管40cm×50μm (Bio-Rad) 检测波长：UV275nm 进样：10psi × sec 操作压力：20KV(+)→(-) 柱温：20℃ 缓冲液：50mmol/L磷酸二氢钠-12.5mmol/L硼 砂(pH8.0)
北沙参供试品溶液的毛细管电泳图
1. 补骨脂素; 2. 花椒毒素; 3. 异茴芹内酯; 4. 佛手柑内酯; 5. 东莨菪内酯。
复方生脉散的毛细管电泳指纹 图谱研究
利用毛细管电泳(CE)方法建立中药复方 生脉散(红参、麦冬、五味子)的指纹图谱。
采用序贯式均匀设计的方法优化CE分离 条件，确定生脉散指纹图谱 电泳条件为:以pH为9.5、44 mmol/L硼砂、 34 mmol/L SDS为缓冲溶液体系， 运行电压25 kV，温度25℃， 压力进样50 mbar×100 s， 检测波长200 nm。
3. 毛细管凝胶电泳 凝胶的网络结构对溶质具 有分子筛的作用，可分离质荷 比相同但分子大小不同的组分。 在分子生物学和蛋白质化 学上有着十分广泛的应用。
4. 毛细管等电聚焦
根据蛋白质的等电点不同 而进行分离。
E B B F A B D A C F C A B A A E D D D E AE D C C E B B AA BB AA BB CC DD CC DD EE EE FF FF
低
pH梯度
高
毛细管电泳的操作
将运行缓冲液充满毛细管柱 移去进样端缓冲液池，用样品池代替 用电动或压力进样方式进样 将进样端缓冲液放回 毛细管两端加操作电压进行电泳分离 分离样品迁移至检测窗检测，数据记录 和处理
高效毛细管电泳技术简介
高效毛细管电泳技术简介
高效毛细管电泳又称高效毛细管区带电泳（又称毛细管区带电泳），它的分离根据是电场中毛细管内的溶质具有不同的迁移速率。
高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis, HPCE）是在传统的电泳基础上结合高效液相色谱技术发展起来的一种高效分离分析技术，由于其具有无与伦比的高效.准确和高灵敏性，这项技术广泛运用于有机离子.无机离子，氨基酸，多肽，蛋白质，核酸分子，对映异构体和临床医学分析，同时它在生物工程，药物，环保，食品检验等领域也显示了极其重要的运用前景。
毛细管电泳仪的结构和特点
毛细管电泳仪主要由5个部分组成，毛细管柱.进样系统，高压系统，检测系统和数据采集系统组成。
毛细管电泳的特点
（1）电泳在细径（25-75u m，内径）弹性石英毛细管中进行，其有限长度一般为50cm.
（2）高电压（10-30KV）加在毛细管两端以产生高电场强度（100-500V/cm）.
（3）分析时间短，数分钟至几十分钟可完成一次分析。
（4）多种分离模式，应用范围广(从生物大分子至小分子。
离子)
（5）样品需求量少，仪器自动化高。
现阶段取得的主要进展
P/ACE MDQ主要用于蛋白质的分析：
●毛细管等点聚焦●肽蛋白和糖蛋白的鉴别分析●纯度检测●免疫毛细管电泳检测
●SDS-分子量测定●肽谱分析。
化学分析中的高效毛细管电泳技术
化学分析中的高效毛细管电泳技术高效毛细管电泳技术（Capillary Electrophoresis, 简称CE）是一种目前被广泛应用于化学分析领域的分离技术，具有高分离能力、灵敏度和速度。
它可以同时进行多样品并行分析，适用于多种类型的样品，包括生物样品、环境样品、化学样品等。
毛细管电泳技术是基于电场作用下静电互斥效应对分子进行分离的一种方法。
输入狭小的管道（通常为毛细管）中，将溶液中分离物带电后，利用电场作用，将其向前驱动，从而实现品种之间的分离。
传统毛细管电泳技术所使用的电泳液通常是缓冲液，以静电作用之间的力为主导分离手段，运行时间长、分离精度低。
高效毛细管电泳则是一种改进后的技术，分离原理通过毛细管管壁与电泳液之间的热运动提高微分扩散率，导致选择性和分离速度快且准确，使传统毛细管电泳技术所不能完成的任务变得容易。
高效毛细管电泳技术是一种全自动的技术方案，成本较低、易于实验操作、重复性和稳定性优良（特别是借助于机器化和自动化实验流程）。
由于最小的检测体积与毛细管越小,假定其他条件一直不变（比如电泳液浓度、毛细管长度等），则分辨率就越高，尤其是在极小的机器装置中不失为一种非常适宜的选择。
高效毛细管电泳技术具有分离速度快、高分辨率、极高的检测灵敏度和线性范围广等优点，使得化学分析领域的许多应用成为可能，例如药物分析、毒物分析、食品检测、环境监测、生物学及基因研究等。
其中，高效毛细管电泳技术在药物研究领域中得到了普遍的应用。
例如，针对药物制剂快速筛选、有效成分定量分析、药物代谢产物的分析等这些方面，应用高效毛细管电泳技术已成为一种得到很好承认的分析和检测手段。
尽管高效毛细管电泳技术得到广泛的认同，并且得到了工业界和学术界的支持和投资，但是该技术在仪器精密度以及分离柱的可靠性方面仍有一定局限性。
因此，未来需要通过技术创新、展望未来科学发展进步等思想定力等途径不断拓展和改进高效毛细管电泳技术，使之广泛在许多领域得到应用，满足高速度、高分辨率、高灵敏度的需求。
高效毛细管电泳(WY)
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4.2 电渗流
1.电渗流现象
当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静 电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者 之间存在电位差。 当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种 液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。
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3.HPCE中电渗流的方向
电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质：
内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；
内表面带正电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极； 石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；
改变电渗流方向的方法：
（1）毛细管改性 表面键合阳离子基团；
（2）加电渗流反转剂
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4. 柱恒温系统
毛细管电泳操作中柱温的影响包括两个方面:
一是焦耳热上升,导致峰形、柱效及分离度恶化 二是温度波动导致分析结果重现性差 毛细管的温控方式一般有气体、液体和固体控温
三种,其装臵的复杂程度依次加大,但控温效果也 依次提高。
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1、气冷恒温
通常指通过空调控制环境温度或是在分离室内用风扇等来达到强制 对流散热效果，加速毛细管外壁的热交换，从而实现温度控制。气冷 控温系统容易实现，不影响分离操作，但控温效果不是十分理想。 2、液冷恒温 将毛细管臵于一恒温液体中，能实现比较精确的温度控制。一般选 用水、煤油或是氟代烷烃等作为冷却介质。冷却介质一般由专门的制 冷系统冷却或恒温，通过一定的路径进行循环。液冷控温方法对毛细 管和仪器设计的要求比较高，需要系统有很好的密封性、电绝缘性和 安全保护设计。 3、固体温控
色谱毛细管电泳法
第33页，共61页。
•测定方法
• 取约1.5g的内容物，精密称定，置于10ml量瓶中，用水 冲洗瓶内壁，洗液与样品合并，加水溶解并稀释至刻度， 混匀。用0.22m微孔滤膜过滤后，在上述电泳条件下进样， 记录维生素B12和D-生物素的峰面积
• 另精密量取上述样品溶液1.0ml,置于100 ml量瓶中，加 水稀释至刻度、摇匀，同法测定，记录VB1,VB6,VC、烟 酰氨、叶酸、核黄素磷酸钠、泛酸钠的峰面积，按外 标法计算样品含量
迁移速度（）可用下式表示：
= eE
（1）
–e为电泳淌度
–E为电场强度（V/L）——是外加电压和毛细
管长度的函数
4
第4页，共61页。
•电泳迁移原理
• 对于给定的离子和介质，淌度e为离子的特征 常数，其大小取决于分子所受的电场力FE和其 通过介质时的摩擦力FF的平衡：
FE = qE
（q为离子电量）
FF= －6r
的选择性 • 在分离中性物质时，所有溶质都在t0与tm之间流出。亲
水性溶质随EOF流出，被胶束完全保留的溶质随胶束流 出。控制条件，采用中等程度的EOF和高迁移率的胶束， 以扩大时间窗口，提高分离度
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•中性溶质的流出时间窗口示意图
时间窗口
溶质
EOF
胶束
t0
t0
tR1
tR2
tR3
色谱毛细管电泳法
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第1页，共61页。
概述
• 毛细管电泳又叫高效毛细管电泳 (HPCE)，是80年代初 发展起来的一种新型分离分析技术，它是电泳技术与层 析技术相结合的产物
• 广泛用于生物大分子，手性药物，生物体内的药物及 代谢物，中西药物及其制剂等的分析，在选择性上与 高效液相法有很大的互补性
高效毛细管电泳简介
离模式。
•毛细管凝胶电泳（CGE）：将聚丙烯酰胺在毛细管柱 内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用， 试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰 型尖锐，分离效率高。可分离测定蛋白质、DNA等。
• 毛细管胶束电动力学色谱（MECC）：
用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应 用范围。
二、仪器装置
• 电压：0～30KV。
• 分离柱不涂敷任何固定液；
• 紫外或激光诱导荧光检测器（10-19～10-21 mol/L）
三、主要特点和应用
☺高分辨率：理论n高达数百万块，甚至数千万块； ☺高灵敏度：可检测出低至10-21 mol/L浓度的物质； ☺高分析速度：可在3分钟内分离30种阴离子；1.7分 钟分离19种阳离子；4分钟可分离10种蛋白质； ☺试样用量少：仅需几nL（10-9 L）的试样； ☺仪器简单，操作成本低：分析一个试样仅需几毫升
第八节
高效毛细管电泳简介
一、基本原理
1、概述
在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在 电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷 相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由
于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率
不同可实现分离。
毛细管电泳是以高压电场为驱动力，以毛细
管为分离通道，依据试样中各组分之间淌度和分
流动液。
不足之处： ♣ 进样不够方便。应用范围相对较窄。 ♣ 分析阴离子时，由阴极进样，在阳极检测。但 电渗流方向与阴离子受电场力作用移动方向相反， 出峰时间较长。
配行为上的差异而实现分离、分析物质的一类液
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
相技术，是经典电泳和现代微柱分离的结合。
电渗流现象：石英玻璃表面存在硅羟基，pH>3时,
5.4 高效毛细管电泳
粒子在缓冲溶液中的迁移速度υep与电泳迁移μep（淌度）和 电场E成正比：
υep= μepE 淌度μep：单位电场强度下的平均电泳速度,取决于带电粒子 和介质两者的性质。
5. 带电粒子在CE中的迁移速率：
υ =（ υ电渗流+υ离子）
阳离子：和电渗方向一致，电泳速度与电渗速度之和。
一、毛细管区带电泳（CZE）
（一）分离原理
毛细管区带电泳也称为自由溶液溶液区带电泳, 这种 电泳模式的特征是整个系统都用同一种缓冲溶液充满，带 电粒子的迁移速度是电泳和电渗流速度的矢量和。
阳离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出。 中性粒子：无电泳现象，随电渗流同行，在阳离子后 流出。但不同结构的中性分子无法相互分离。 阴离子：两种效应的运动方向相反，ν电渗流 >ν电泳,阴 离子在负极最后流出。
十二烷基三甲基氯化铵（DTAC）
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十二烷基三甲基溴化铵（DTAB）
15
十四烷基三甲基溴化铵（TTAB）
3.5
十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）
0.92
•41
•42
三、毛细管凝胶电泳（CGE）
将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成一个细长的网状 多孔凝胶，其具有多孔性，类似分子筛的作用。电荷/质量 比相等但大小不同的分子，在电场力的作用下发生迁移，其 运动速度受到凝胶网状结构的阻碍。大分子受到的阻力大， 移动速度慢，小分子受到的阻力小，移动速度快，从而使它 们得以分离。
特点： （1）进样不均：淌度大的离子比淌度小的进样量大； （2）离子丢失：淌度大且与电渗流方向相反的离子可能进 不去； （3）特别适合粘度大的试样。
2. 压力进样
（1）进样端加压 （2）出口端抽真空 （3）虹吸进样
12.1高效毛细管电泳概述
Hale Waihona Puke 经典电泳分析及其分类• 电泳法：利用电泳现象对某些化学或生物物质进行 分离的方法。
• 按形状分类：U形管电泳、柱状电泳、板电泳。 • 按介质分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺、
自由电泳 • 按有无载体分类：自由界面电泳（无载体）和区带
电泳（有载体）
经典电泳分析的局限性
毛细管电泳的特点
高效：理论塔板数达10-100 万塔板数/米 高速：几十秒~十几分钟 低样品消耗：nL~pL 样品 分离对象极广：无机离子、有机分子、中性分子、
蛋白、核酸、单细胞等。 成本低：只需毛细管和少量运行缓冲溶液
毛细管电泳的缺陷
制备能力差； 光路太短：需要高灵敏度检测器（激光诱导荧光等）； 毛细管大的比表面积能吸附蛋白，导致蛋白分离效率
高效毛细管电泳（HPCE） High Performance Capillary Electrophoresis
毛细管电泳概述
HPCE定义
• 以毛细管为分离通道，以高压 直流电场为驱动力，依据各组 分之间淌度和分配行为上的差 异而实现分离的新型液相色谱 分离技术。
HPCE发展简史
• 1937年瑞典科学家A. Tiselius首次采用电泳技术从人血清中分离 白蛋白、、、球蛋白戏中蛋白。
下降； 样品吸附导致重现性下降； 凝胶毛细管电泳等需要与门的灌制技术。
• 技术改进 采用毛细管（几十微米） 采用高压（可达30 kV）
HPEC和HPLC比较
1. 分离过程类似：都是一种液相分离技术。 2. 分离原理丌同： HPEC基于组分在电场中发生定向移动，依据粒
子所带电荷数、形状、离解度等丌同所产生的差 速迁移而分离 ； HPLC基于组分在两相之间分配比系数丌同而分 离。 3. 应用方面相互补充
第6章- 高效毛细管电泳
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不同内径毛细管的管壁温度
及其轴心与管壁的温差
内半径（μm） 25 50 75 100 125 壁温度（K） 299.0 301.2 304.2 307.7 311.6 温差（K） 0.53 1.39 3.14 5.58 8.72
25
3. 扩散与吸附 扩散
纵向扩散：
2 2 DLd /u 2 Dtm
ห้องสมุดไป่ตู้
36
第四节 毛细管电泳仪
基本结构： 高压电源、进样、填灌/清洗、毛细管 温控、检测、记录/数据处理
毛细管电泳仪示意图
37
一、高压电源 包括：电源、电极、电极槽
0~±30kV,精度1%
6
（二）毛细管电泳的分类 按毛细管中填充物的性质分类： 自由溶液 毛细管内填充物为pH缓冲的电解质 溶液。如：毛细管区带电泳（CZE）。 非自由溶液 毛细管内填充物为凝胶或其他筛 分介质。如：毛细管凝胶电泳（CGE）。 按分理机制分类： 电泳型: 色谱型: CZE、CGE、NACE（非水） 胶束电动毛细管色谱（MECC） 微乳液电动毛细管色谱（MEECC） 电泳/色谱型:毛细管电色谱（CEC）
电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍；
各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：
ν+ =ν电渗流+ ν+ef 阳离子运动方向与电渗流一致；
ν- =ν电渗流- ν-ef 阴离子运动方向与电渗流相反；
ν0 =ν电渗流中性粒子运动方向与电渗流一致；
（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；
（1）溶液pH的影响 对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷 密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7， 达到最大； pH<3，完全被氢离子中和，表面电中性， 电渗流为零。分析时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。 （2）阴离子的影响 在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管 中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。 缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工 作电流，明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加， 电渗流下降。
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高效毛细管电泳Capillary Electrophoresis复旦大学化学教学实验中心雷杰Experimental Center for Chemical education, FDU成人与继续教育学院一、电泳(eletrophoresis)：带电粒子在电场中的定向移动。
•1937年，瑞典科学家蒂塞利乌斯（Tiselius）设计了世界上第一台电泳仪，建立了移界电泳法，并于1948年荣获诺贝尔化学奖。
多年以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以实现下列目标：1、提高分辨率及灵敏度。
2、简化操作，缩短电泳时间。
3、扩大应用范围。
•各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域。
Experimental Center for Chemical education, FDU成人与继续教育学院蒂塞利乌斯Arne Wilhelm Kaurin Tiselius（1902-1971）1902年8月10日生于斯德哥尔摩,1971年10月29日卒于同地。
他4岁时随家移居哥德堡。
1921年入乌普萨拉大学,就读于物理化学家T.斯韦德贝里。
1924年获化学、物理和数学三个硕士学位,1930年获博士学位。
后任乌普萨拉大学化学讲师、副教授。
在此期间曾先后两次赴美国威斯康星大学和普林斯顿大学从事研究和进修,1938年任教授。
蒂塞利乌斯1925年从事胶体溶液中悬浮蛋白质的电泳分离研究。
曾自制超速离心机测定蛋白质分子的大小和形状,并与斯韦德贝里合作发表了第一篇论文,报导了测定蛋白质淌度的新方法。
1930年他进一步改进实验手段和装置,发表了关于色谱法和吸附的论文。
1935年从美国回国后,重新改建原有电泳装置,发展了区带电泳法,大大提高了效率和分辨率。
1940年他用自已设计的新电泳装置成功地分离了血清中蛋白质的4个组分,分别命名为:白蛋白、α、β、和γ球蛋白。
该法迅速应用于分离和鉴定各种复杂蛋白质及其他天然物质的混合物的组成。
他因对电泳分析和吸附方法的研究,特别是发现了血清蛋白的组分而获得1948年诺贝尔化学奖。
Experimental Center for Chemical education, FDU成人与继续教育学院二、毛细管电泳(Capillary Electrophoresis)•毛细管电泳(CE)又称高效毛细管电泳(HPCE)，是指离子或带电粒子以毛细管为分离介质，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的液相分离分析技术。
由于毛细管内径小，表面积和体积的比值大，易于散热，因此毛细管电泳可以减少焦耳热的产生，这是CE和传统电泳技术的根本区别。
•采用了0.05 mm内径的毛细管；•采用了高达数千伏的电压。
Experimental Center for Chemical education, FDU成人与继续教育学院成人与继续教育学院Experimental Center for Chemical education, FDU （一）基本概念毛细管有效长度(l , cm) 毛细管的入口端到检测窗口的距离；迁移时间(t ,min) 带电粒子在电场作用下做定向移动的时间；电泳速度（v cm/s ）在单位时间内，带电粒子定向移动的距离；电场强度(E ,V/cm) 电场强度/毛细管总长度；电泳淌度（μcm 2/(V ·s) ）带电粒子在毛细管中定向移动的速度与所在电场强度之比；三、毛细管电泳基本原理毛细管总长度(L , cm)毛细管(内径50 μm , 外径375 μm )入口到检测窗总长（l）毛细管全长（L）Experimental Center for Chemical education, FDU成人与继续教育学院成人与继续教育学院Experimental Center for Chemical education, FDU 而笃志学问而近思博切当固体与液体接触时，固体表面带一种电荷，因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层。
当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种现象叫电渗现象。
电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmotic flow ，简称EOF ）。
（二）电渗现象与电渗流（electroosmosis and electroosmotic flow ）成人与继续教育学院Experimental Center for Chemical education, FDU 毛细管电泳中，溶液整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动，谱带展宽很小；液相色谱中的溶液流动为层流，抛物线流型，管壁处流速为零，管中心处的速度为平均速度的2倍，引起谱带展宽较大。
石英毛细管柱，内充液pH >3时，表面电离成-SiO -，管内壁带负电荷，形成双电层后，电渗流方向为由正极到负极。
电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的5～7倍；各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为：ν+=ν电渗流+ ν+ef阳离子运动方向与电渗流一致；ν-=ν电渗流-ν-ef阴离子运动方向与电渗流相反；ν0=ν电渗流中性粒子运动方向与电渗流一致；（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中的流速；（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；在HPCE中，控制电渗流非常重要。
成人与继续教育学院Experimental Center for Chemical education, FDUSi O Si SiOSi SiOSiOSiOOOOO+-Na+Cl-电渗电泳电泳迁移速度Na+Cl-矢量速度合速度成人与继续教育学院Experimental Center for Chemical education, FDU成人与继续教育学院Experimental Center for Chemical education, FDU电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。
不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；（三）影响电渗流的因素2.毛细管材料的影响1.电场强度的影响3.电解质溶液性质的影响（1）溶液pH的影响对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大，pH=7，达到最大；pH<3，完全被氢离子中和，表面电中性，电渗流为零。
分析时，采用缓冲溶液来保持pH稳定。
（2）阴离子的影响在其他条件相同，浓度相同而阴离子不同时，毛细管中的电流有较大差别，产生的焦耳热不同。
缓冲溶液离子强度，影响双电层的厚度、溶液黏度和工作电流，明显影响电渗流大小。
缓冲溶液离子强度增加，电渗流下降。
Experimental Center for Chemical education, FDU成人与继续教育学院4.温度的影响毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗流增大。
温度变化来自于“焦耳热”；焦耳热：毛细管溶液中有电流通过时，产生的热量；CE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。
温度每变化1，将引起背景电解质溶液黏度变化2%～3%；Experimental Center for Chemical education, FDU成人与继续教育学院5.添加剂的影响（1）加入浓度较大的中性盐，如KSO4，溶液离子强度增2大，使溶液的黏度增大，电渗流减小。
（2）加入表面活性剂，可改变电渗流的大小和方向；加入不同阳离子表面活性剂可控制电渗流。
加入阴离子表面活性剂，如十二烷基硫酸钠（SDS），可以使壁表面负电荷增加，zeta电势增大，电渗流增大；（3）加入有机溶剂如甲醇、乙腈，使电渗流减小。
Experimental Center for Chemical education, FDU成人与继续教育学院成人与继续教育学院Experimental Center for Chemical education, FDU而笃志学问而近思博切色谱过程热力学D e t e c t o r R e s p o n s eTimeABW WABI n j e c tt 0t R(A)t R(B)t = 保留时间t = 死时间R W = 峰底宽度0t R (B) -t R(A)W A + W BR = 2t R (B) -t R(A)W 1/2A + W 1/2B= 1.176K’=t R -t 0t 0容量因子分离度－定性和定量：保留时间和峰面积（峰高）（四）色谱参数成人与继续教育学院Experimental Center for Chemical education, FDU色谱过程动力学之塔板理论塔板高度H ＝L /n2R 2R )(16)(16bb W t W V n ==理论塔板数t R 为样品的保留时间；W b 为峰底宽；t R ‘为调整保留时间；L 色谱柱长度。
四、毛细管电泳分离模式•毛细管区带电泳(Capillary Zone Electrophoresis，CZE)•毛细管胶束电动色谱(Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography，MEKC，MECC)•毛细管凝胶电泳（Capillary Gel Electrophoresis，CGE）•毛细管等电聚焦（Capillary Isoelectric Focusing，CIEF）•毛细管等速电泳（Capillary Isotachorphoresis，CITP）•毛细管电动色谱（Capillary ElectrokineticChromatography，CEC）Experimental Center for Chemical education, FDU成人与继续教育学院Experimental Center for Chemical education, FDU成人与继续教育学院五、毛细管电泳仪器Experimental Center for Chemical education, FDU成人与继续教育学院（一）进样系统进样量：进样长度必须控制在毛细管总长度的1%~2%，否则将影响分离效率；纳升级；1. 流体力学进样方式（1）进样端加压（2）出口端抽真空（3）虹吸进样Experimental Center for Chemical education, FDU成人与继续教育学院2. 电动进样方式毛细管一端插入样品瓶，加电压；进样不均：电歧视现象，淌度大的离子比淌度小的进样量大；离子丢失：淌度大且与电渗流方向相反的离子可能进不去；特别适合黏度大的试样3. 扩散进样试样通过扩散作用进入分离柱端口处。