高效毛细管电泳法在药物分析中的应用

2） 毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族
多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压（6～8V）时，管内将建立一个 由阳极到阴极逐步升高的、稳定的、连续的、线性的 pH梯度； 3）氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在酸性溶液中 带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；
1、毛细管区带电泳(CZE)
2、毛细管凝胶电泳(CGE)
3、毛细管等速电泳(CITP)
4、毛细管等电聚焦(CIEF)
5、胶束电动毛细管色谱(MEKC或MECC) 6、毛细管电色谱 (CEC)
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1、毛细管区带电泳 CZE
将待分析溶液引入毛细管进样一端，施加直流电压后，各 组分按各自的电泳流和电渗流的矢量和流向毛细管出口端， 按阳离子、中性粒子和阴离子及其电荷大小的顺序通过检测 器。中性组分彼此不能分离。 正离子在负极最先流出；中性粒子：无电泳现象，受电渗 流影响，在阳离子后流出；阴离子在负极最后流出，在这种 情况下，不但可以按类分离，同种类离子由于差速迁移被相 互分离。 CZE最基本的操作模式，应用最广泛，是其它各种操作 模式的母体。用以分析带电溶质，如多种蛋白质、肽、氨
基酸的分析。
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2、毛细管凝胶电泳
CGE
将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。
其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有
效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。 蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，CZE模式很难分离，
采用CGE能获得良好分离，DAN排序的重要手段。
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电渗流的方向
电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质： 内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极； 内表面带正电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极； 粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗 流（EOF）两种速度的矢量和，正离子的运动方向和电渗流 一致，故最先流出；中性粒子的电泳流速度为“零”，故 其迁移速度相当于电渗流速度；负离子的运动方向和电渗 流方向相反，但因电渗流速度一般都大于电泳流速度，故 它将在中性粒子之后流出，从而因各种粒子迁移速度不同 而实现分离。
分离异构体等方面。
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6、毛细管电色谱
capillary electroosmostic chromatography ，CEC
是将细粒径固定相填充到毛细管中，或在毛细管内壁
涂覆固定相，以电渗流驱动操作缓冲溶液（流动相），使试 样组分在两相间进行分离的电动色谱过程。此模式兼具电泳 和液相色谱的模式。CEC可分为开管CEC（即管壁涂渍固定 相）和填充CEC。
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四、影响高效毛细管电泳分离的因素
1.缓冲溶液
CE中常用的缓冲试剂有：磷酸盐、硼砂或硼酸、醋酸盐 等。缓冲液浓度升高，离子强度增加，电渗流减小，分析效 率提高；同时，增强样品的富集现象，从而提高分析灵敏度。
2．pH值
pH能影响样品的解离能力，样品在极性强的介ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ中离 解度增大，电泳速度也随之增大，从而影响分离选择性和 分离灵敏度。
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1981年，Jorgenson和Luckas，用75μm内径石英毛 细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发 生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭 新的分离分析技术——高效毛细管电泳。 1988～1989年出现了第一批毛细管电泳商品仪器。 目前，在生命科学、药物分析、以及从小分子、离子 到单细胞分析的一系列领域得到了广泛的应用。
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3)中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性 强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长； 特点：1）可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管 电泳的应用范围；2)色谱与电泳分离模式的结合。
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5、毛细管等电聚焦
CIEF
1） 根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；
的溶剂。
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HPCE和普通电泳相比，由于其采用高电场，因此分离速度快；
检测器则除了未能和原子吸收及红外光谱连接以外，其它类型检测
器均已和HPCE实现了连接检测；一般电泳定量精度差，而HPCE和 HPLC相近；HPCE操作自动化程度比普通电泳要高，与传统的电泳相 比主要有四个特点，即高效、快速、微量和自动化。
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二、高效毛细管电泳法在药物分析中的应用
高效毛细管技术在药物分析中的应用大致可以分为两部

分： 一是原料药的定量、原料药中杂质的测定、药物制剂分析以 及对它们稳定性的评价等以药品质量控制为目的的测定方法。 二是对进入人体内的药物或代谢物的吸收、分布、代谢、排 泄等体内动态的研究，即临床药物分析。
特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。 毛细管凝胶电泳分凝胶和无胶筛分两类。无胶筛分技术：采用低粘
度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺,称为毛细管无胶筛分。
柱便宜、易制备。
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CGE 是毛细管自由溶液区带电泳派生出的一种电 泳方式 ，用多孔性的凝胶或其它筛分剂作介质，网状 结构，按分子的大小分离




进样：最常用的进样方式为流体力学方式和电动方式两种。 分离：分离部件主要包括毛细管、毛细管恒温系统和电源。 毛细管材料应具有化学和电学惰性、紫外可见光透光性、 柔韧性、强度高和便宜等特性。熔融石英是毛细管的首选 材料，最常用的是内径为25～75μm的毛细管。 检测：紫外可见光检测是最常用的检测方式，但是受到仪 器、单波长等因素的限制，目前应用最广泛的是二极管阵 列（PDA）检测器。 液体的处理：该系统包括自动进样装置、缓冲液更换系统 和缓冲液的水平系统等。
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3、毛细管等速电泳
capillary isotachophoresis ，CITP
1） 将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充
满毛细管)和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，
并以同一速度移动。 2）负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负 离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐 渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。
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一、高效毛细管电泳法的特点
高效毛细管电泳法是经典电泳技术和现代微柱分离相 结合的产物。
与高效液相色谱法（HPLC）相比，其相同处在于都是高效分离技术，
仪器操作均可自动化，且二者均有多种不同分离模式。二者之间的差异 在于：HPCE用迁移时间取代HPLC中的保留时间，HPCE与HPLC相比，分析
速度快；柱效高；所需样品量及流动相用量少；但HPCE仅能实现微量制
备，而HPLC可作常量制备；同时，HPCE没有泵输液系统，因此成本相对 较低，通过改变操作模式和缓冲液的成分，有很大的选择性，可以根据 不同分子性质（诸如大小、电荷数、疏水性等）对极广泛的对象进行有
效的分离。而HPLC为达到同样的目的，需要消耗价格昂贵的柱子和大量
2010年执业药师继续教育
高效毛细管电泳法 在药物分析中的应用
山东药品食品职业学院 任玉红
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该内容共分两部分进行介绍
第一部分 概述 第二部分 高效毛细管电泳技术的分离模式及应用
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第一部分 概述
高效毛细管电泳法(HPCE )又称毛细管电 泳法(capillary electrophoresis，CE）。 是以毛细管为分离通道，以高压电场为 驱动力，依据供试品中各组分之间淌度（单 位电场强度下的迁移速度）和（或）分配行 为上的差异而实现分离的新型液相分离分析 技术。
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4）聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下
迁移，分别到达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止
移动，形成窄溶质带而相互分离；
5）阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOH溶液； 6）加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测； 7）电渗流在CIEF中不利，应消除或减小。
毛细管等电聚焦电泳已经成功用于测定蛋白质等电点，
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1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液 放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自 由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混 合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白；
第一次的自由溶液电泳；

一台电泳仪;

Tiselius建立了移动界面电泳，将电泳发 展成分离技术。 1948年获得诺贝尔化学奖。
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二、毛细管电泳的基本装置与操作

毛细管电泳的基本装置由高压电源、毛细管、检测器、电解质贮液槽、 进样器、控制系统及数据处理系统组成。
1－温度控制系统；2－高压电源；3－高压电极槽；4－毛细管；5－检测器； 6－低压电极槽；7－铂丝电极；8－记录/数据处理检测器
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几个主要部分的特点:
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多数情况下，电渗流速度是电泳速度的5-7 倍。 因此，在毛细管电泳中利用电渗流可将正、负离子和 中性分子一起朝一个方向产生差速迁移，在一次CE 操作 中同时完成正、负离子的分离测定。由于电渗流的大小和 方向可以影响CE 分离的效率、选择性和分离度，所以成 为优化分离条件的重要参数。用来控制电渗流的方法主要 有改变缓冲溶液的成分和浓度；改变缓冲溶液的pH 值； 加入添加剂；毛细管内壁改性；外加径向电场；改变温度 等。
物质离子在电场中差速迁移是电泳分离的基础。
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电渗
高效毛细管电泳操作中一个基本组成部分是 电渗流（electroosmosis，EOF）。电渗流是毛 细管内壁表面电荷所引起的管内液体的整体流动， 来源于外加电场对管壁溶液双电层的作用。 CE所用的石英毛细管柱，在pH>3的情况下， 其内表面带负电，和溶液接触时形成双电层。在 高电压的作用下，双电层中的水合阳离子引起流 体整体向负极方向迁移的现象叫电渗。 电渗流是毛细管中的溶剂因轴向直流电场的 作用而发生的定向流动。
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3）不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同 (ν=μE)，淌度大的离子区带电场强度小，使溶质按其电泳 淌度不同得以分离。 4）特点：界面明显，富集、浓缩作用；常用于分离离子 型物质，目前应用不多。
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4、 胶束电动毛细管色谱（MECC，MEKC）
1)缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界 浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。 在电场力的作用下，胶束在柱中移动。被分离物质在 水和胶束相之间发生分配并随电渗流在毛细管内迁移，达 到分离。 2)电泳流和电渗流的方向相反，且ν电渗流 > ν电泳 ， 负电胶束以较慢的速度向负极移动；
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3. 分离电压
相对较高的分离电压会提高分离度和缩短分析时间，
但电压过高又会使谱带变宽而降低分离效率。
4. 温度的影响
毛细管内温度的升高，使溶液的黏度下降，电渗 流增大。
5. 添加剂的影响 6. 进样
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第二部分 高效毛细管法的分离模式及应用
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一、高效毛细管电泳的分离模式
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毛细管电泳技术兼有高压电泳及高效液相色谱 等优点，其突出特点是:
1.仪器简单、易自动化
电源、毛细管、检测器、溶液瓶 2.分析速度快、分离效率高
在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分 离了24种阳离子；分离柱效：105～107/m理论塔板数
3.操作模式多，开发分析方法容易 4.操作方便、消耗少 进样量极少，水介质中进行 5.应用范围极广
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完成典型的HPCE实验，一般包括以下 操作步骤：
移开进样端的电解质贮液槽，换上样品管 使用低压或电迁移方式进样
换电解质贮液槽
加上分离电压 样品分离，用检测器进行检测
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三、毛细管电泳法的基本理论
电泳
是指在电场作用下，溶液中的带电粒子作定向移动的现象。单
位电场下的电泳速度称为淌度或电迁移率。 离子所带电荷越多，解离度越大，体积越小，溶液粘度越小， 有效淌度就越大，其电泳速度就越快。这也是电泳分离及其条件选 择的根本依据之一。

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（一）HPCE在药品质量控制方面的研究应用

1．HPCE在中药分析中的应用 具有分离效率高、分析速度快、分析时间短、样品前 处理简便、进样量少、有机溶剂消耗少、操作简便、分析 成本低等优点。另外，HPCE在中药复方制剂复杂成分分析 中还具有以下优越性：(1)毛细管柱易于全面清洗，可保 持高柱效而使复杂成分较好分离；(2)分离模式多，适合 于中药制剂中各类化学成分的分析；(3)不同电泳技术之 间及HPCE与NMR、MS等多种技术联用可提高分析的精密度， 更可拓宽其应用范围。