发酵工程第四章无菌技术-课件
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发酵工程 第四章 无菌空气的制备精讲
旋风分离器
利用气流从切线方向 进入容器，在容器内形 成旋转运动时产生的离 心力场来分离重度较大 的微粒。
丝网分离器
利用填料的惯性拦截
三、空气过滤除菌工艺流程
两级冷却、加热除菌流程 冷热空气直接混合式空气除菌流程 高效前置过滤空气除菌流程 将空气冷却至露点以上的流程 利用热空气加热冷空气的流程 一次冷却和析水的空气过滤流程
4）超细玻璃纤维丝：利用高质量的无碱玻璃采用喷 制法制成的 1 – 1.5 m的细丝；
二、空气过滤除菌的介质
5）纸类过滤介质：玻璃纤维纸，多层使用 ； 6）微孔滤膜类过滤介质：直径小于0.5 m，甚至小 于0.1 m，能将空气中的细菌真正滤去，也是绝对 过滤。
常见过滤介质
三、介质过滤效率
常数K值与气流速度、纤维直径、介质填充密度 以及空气中颗粒大小等有关。K值可通过实验测得， 也可通过计算求得。
若令Ns=0，则 L = ∞，事实上也不可能；一般取 Ns = 0.001
过滤效率随滤层厚度的增加而增加。
四、影响过滤除菌效果的因素
在其他条件相同时，介质纤维直径越小， 1. 纤维直径 形成的网格越细密、层数越多，过滤效
一般设计时以含量为103~104个／m3进行计算。 空气中尘埃数（x/m3）与细菌数（y/m3）的关系：
y=0.003x-2.6
二、空气除菌的方法和要求
发酵工业应用的“无菌空气”是指通过除菌处理 使空气中含菌量降低在一个极低的百分数，从而 能控制发酵污染至极小机会。
无菌空气的标准一般是99.99% 热灭菌法
15.1 s 5.1 s 2.1 s 1.05 s
2. 辐射灭菌法
α射线、X射线、β射线、γ射线、紫外线、超声 波照射
4 微生物工程 第四章 发酵工业的无菌技术
泡沫中的空气形成隔热层，对灭菌极为不利。
（5）培养基中的微生物数量
微生物多（芽孢杆菌），灭菌时间长
（二）分批灭菌（实罐灭菌） 1.灭菌工艺过程
空气过滤器灭菌 并用空气吹干 取样管 通蒸汽 夹套或蛇管排冷水，开启排 气管阀，空气管通蒸汽，也 可夹套内通蒸汽
达70℃左右
放料管
120℃， 1×105pa
②先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀
杂菌分泌较多蛋白质杂质时，使水相和溶媒之
间极易发生乳化。
（二）杂菌污染的防治
1. 染菌的检查与判断
显微镜检查法
平板划线培养或斜面培养检查法
肉汤培养检查法
发酵过程的异常现象判断
溶解氧水平异常变化
pH异常变化
尾气中CO2异常变化
其他异常现象（黏度、泡沫、颜色等）
=20.34(min)
由于升温阶段就有部分菌被 杀灭，实际保温阶段时间 比计算值要短。
3.连续灭菌（连消）
工艺流程
喷淋冷却连续灭菌流程 喷射加热连续灭菌流程 薄板式换热器连续灭菌流程
灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt 的含菌数 t=2.303/k[lg(C0/Ct)]
式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后
采取哪些措施能够保持无菌发酵？
物料、培养基、中间补料都要灭菌；
发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发酵罐
进出口连接装置）和管道要灭菌彻底；
好氧发酵通入的空气要除菌；
种子无污染；接种无菌操作过关； 为了保持发酵的长期无菌状态，需维持一定的正压。
三、发酵工业的无菌技术——灭菌方法
4微生物工程第四章发酵工业的无菌技术
解：C0=2×105(个/ml) Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml) t=2.303/k[lg(C0/Ct)]=2.303/15×lg[(2×105)/(2.5×10-11)] =2.37 min
喷淋冷却连续灭菌流程
喷射加热连续灭菌流程
薄板式换热器连续 灭菌流程
丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝 大量自溶，发酵液粘度黏度增加，过滤困难 处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂； ②先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀
杂菌分泌较多蛋白质杂质时，使水相和溶媒之 间极易发生乳化。
（二）杂菌污染的防治
1. 染菌的检查与判断
显微镜检查法 平板划线培养或斜面培养检查法 肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断
三、发酵工业的无菌技术——灭菌方法
干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法 过滤除菌法 火焰灭菌法
四、发酵培养基及设备管道灭菌
（一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌） （三）连续灭菌（连消） （四）发酵培养基及设备管道灭菌技术
（一）湿热灭菌原理 1.微生物的热阻
灭菌后弃去
发酵前期染菌
应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分， 重新接种
发酵中期染菌
挽救困难，应早发现，应根据各种发酵的特 点和具体情况尽快处理 。
抗生素发酵
输入正常发酵的另一罐发酵液
柠檬酸发酵
a. 污染细菌：加大通风，加速产酸；加入盐 酸等条pH3.0以下，抑制细菌
b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制 酵母；通风加大，加速产酸。
3. 杂菌污染的途径及其预防
（1）种子带菌的防治
培养基及器具彻底灭菌 避免菌种在移接过程中受污染 避免菌种在培养及保藏过程中污染
喷淋冷却连续灭菌流程
喷射加热连续灭菌流程
薄板式换热器连续 灭菌流程
丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝 大量自溶，发酵液粘度黏度增加，过滤困难 处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂； ②先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀
杂菌分泌较多蛋白质杂质时，使水相和溶媒之 间极易发生乳化。
（二）杂菌污染的防治
1. 染菌的检查与判断
显微镜检查法 平板划线培养或斜面培养检查法 肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断
三、发酵工业的无菌技术——灭菌方法
干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法 过滤除菌法 火焰灭菌法
四、发酵培养基及设备管道灭菌
（一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌） （三）连续灭菌（连消） （四）发酵培养基及设备管道灭菌技术
（一）湿热灭菌原理 1.微生物的热阻
灭菌后弃去
发酵前期染菌
应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分， 重新接种
发酵中期染菌
挽救困难，应早发现，应根据各种发酵的特 点和具体情况尽快处理 。
抗生素发酵
输入正常发酵的另一罐发酵液
柠檬酸发酵
a. 污染细菌：加大通风，加速产酸；加入盐 酸等条pH3.0以下，抑制细菌
b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制 酵母；通风加大，加速产酸。
3. 杂菌污染的途径及其预防
（1）种子带菌的防治
培养基及器具彻底灭菌 避免菌种在移接过程中受污染 避免菌种在培养及保藏过程中污染
发酵工程 4 发酵工业无菌技术
不 同 产 品
放线菌由于生长的最适pH为7左右，因 此染细菌为多，而霉菌生长pH为5左右， 因此染酵母菌为多。 青霉素发酵染菌，绝大多数杂菌都能直 接产生青霉素酶，而另一些杂菌则可被 青霉素诱导而产生青霉素酶。不论在发 酵前期、中期或后期，染有能产生青霉 素酶的杂菌，都能使青霉素迅速破坏。
不 同 产 品
4
思考题
发酵工业的无菌技术
1、发酵工业中污染杂菌的危害及其预防措施
2、灭菌、消毒、除菌与防腐 3、灭菌的常用方法及其机理 4、湿热灭菌的理论计算 5、空气灭菌的常用方法
6、简述好氧发酵无菌空气制备的工艺流程与
要求。
什么是染菌？
发酵过程中除了生产菌以外，还有其它菌生长
繁殖。
一、发酵工业的无菌处理
由于化学试剂也会与培养基中的一些成分作用，而 且加入培养基后不易去除，它不能用于培养基的灭
菌，但染菌后的培养基可用化学药剂处理。
2．辐射灭菌：
（4）发酵后期染菌
发酵后期发酵液内已积累大量的产物，
特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀
灭能力。因此如果染菌不多，对生产影响
不大。如果染菌严重，又破坏性较大，可 以提前放罐。
4、杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响
1）发酵染菌对过滤的影响
染菌的发酵液一般发粘，菌体大多数自溶，
所以在发酵液过滤时不能或很难形成滤饼，导
链霉素、四环素、红霉素、卡那霉素等虽不 象青霉素发酵染菌那样一无所得，但也会造成 不同程度的危害。如杂菌大量消耗营养干扰生 产菌的正常代谢；改变pH，降低产量。 灰黄霉素、制霉菌素、克念菌素等抗生素抑 制霉菌，对细菌几乎没有抑制和杀灭作用。
对疫苗生产危害很大。现在疫苗多采用深层 培养，这是一类不加提纯而直接使用的产品， 在其深层培养过程中，一旦污染杂菌，不论死 菌、活菌或内外毒素，都应全部废弃。因此， 发酵罐容积越大，污染杂菌后的损失也越大。
项目四-发酵工业的无菌操作PPT课件
23
.
噬菌体是病毒的一种，是一种极微 小的生物，体积是细菌的1/1000左 右，它可以通过细菌过滤器，只有 在电子显微镜下才能看到。
24
. 25
.
26
消除潜在的污染隐患-1
▪ 涉及菌体相关的操作要尽可能在生物安全柜中进行；
▪ 在菌体培养过程中，尽量不要打开瓶口。如果实在需要打开瓶口的话，必需
从杂菌种类看：
➢耐热芽孢杆菌：与④有关
➢球菌、无芽孢杆菌：与① ② ③⑤有关
➢浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏
➢霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题
➢酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长
2021/3/20 .
57
从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染 菌，且所污染的是同一种杂菌，一般是空气 系统问题，若个别罐连续染菌，一般是设备 问题。
20
.
溶解氧水平异常变化显示染菌
溶氧浓度 污染噬菌体
正常发酵
溶氧浓度 正常发酵
污染嫌气性杂菌
发酵时间
污染好气性杂菌
发酵时间
21
.
CO2异常显示染菌
工艺一定，尾气中CO2量变化有一定规律 污染杂菌，糖耗加快，尾气中CO2量增加 污染噬菌体，糖耗减慢，尾气中CO2量减少
22
.
2.污染噬菌体的检测
噬菌体是什么？
46
.
常见的设备、管道“死角” 发酵罐的“死角”：不锈钢衬里破裂造成死角，
发酵罐罐底脓疱状积垢。
47
法兰连接不当造成的“死角”
2021/3/20 .
48
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法
2021/3/20 .
49
（4）设备渗漏染菌及防止 原因
.
噬菌体是病毒的一种，是一种极微 小的生物，体积是细菌的1/1000左 右，它可以通过细菌过滤器，只有 在电子显微镜下才能看到。
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消除潜在的污染隐患-1
▪ 涉及菌体相关的操作要尽可能在生物安全柜中进行；
▪ 在菌体培养过程中，尽量不要打开瓶口。如果实在需要打开瓶口的话，必需
从杂菌种类看：
➢耐热芽孢杆菌：与④有关
➢球菌、无芽孢杆菌：与① ② ③⑤有关
➢浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏
➢霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题
➢酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长
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从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染 菌，且所污染的是同一种杂菌，一般是空气 系统问题，若个别罐连续染菌，一般是设备 问题。
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溶解氧水平异常变化显示染菌
溶氧浓度 污染噬菌体
正常发酵
溶氧浓度 正常发酵
污染嫌气性杂菌
发酵时间
污染好气性杂菌
发酵时间
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CO2异常显示染菌
工艺一定，尾气中CO2量变化有一定规律 污染杂菌，糖耗加快，尾气中CO2量增加 污染噬菌体，糖耗减慢，尾气中CO2量减少
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2.污染噬菌体的检测
噬菌体是什么？
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常见的设备、管道“死角” 发酵罐的“死角”：不锈钢衬里破裂造成死角，
发酵罐罐底脓疱状积垢。
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法兰连接不当造成的“死角”
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灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法
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（4）设备渗漏染菌及防止 原因
发酵工业无菌技术演示教学
• 在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比 生产菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为 主；
• 杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难 • 杂菌会降解目的产物； • 杂菌会污染最终产品，杂菌会污染最终产品；
• 发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现 象。
4，培养基灭菌的要求 （1）达到要求的无菌程度（10-3） （2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中， 培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引 起的： 培养基中不同营养成分间的相互作用； 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。
4.5.3空气过滤除菌
（一）、空气过滤除菌流程
1、高空采风、两次冷却、两次分油水、 适当加热流程
• 特点 ：两次冷却、两次分油水、适当加热。 空气第一次冷却到30～35℃，第二级冷却 至20～25℃，经分水后加热到30～35℃， 因为温度升高，相对湿度下降。
2、冷热空气直接混合式空气除菌流程
第四章 发酵工业的无菌技术
• 4.1 灭菌与消毒的区别
灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中 所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和 孢子
消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、 器皿内外的病源微生物。
• 培养基灭菌的目的
• 1，在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的后果： • 生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力；
七、补料液的灭菌
在发酵过程中，往往要向发酵罐中补入各种不同的料液。这 些料液都必需经过灭菌。灭菌的方法则视料液的性质、体积和补 料速率而定。如果补料量较大，而具有连续性时，则采用连续灭 菌较为合适。也有利用过滤法对另补料液进行除菌。补料液的分 批灭菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。所有的附属 设备和管道都要经过灭菌。
缺点 –设备比较复杂，投资较大。
• 杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难 • 杂菌会降解目的产物； • 杂菌会污染最终产品，杂菌会污染最终产品；
• 发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现 象。
4，培养基灭菌的要求 （1）达到要求的无菌程度（10-3） （2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中， 培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引 起的： 培养基中不同营养成分间的相互作用； 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。
4.5.3空气过滤除菌
（一）、空气过滤除菌流程
1、高空采风、两次冷却、两次分油水、 适当加热流程
• 特点 ：两次冷却、两次分油水、适当加热。 空气第一次冷却到30～35℃，第二级冷却 至20～25℃，经分水后加热到30～35℃， 因为温度升高，相对湿度下降。
2、冷热空气直接混合式空气除菌流程
第四章 发酵工业的无菌技术
• 4.1 灭菌与消毒的区别
灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环境中 所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和 孢子
消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、 器皿内外的病源微生物。
• 培养基灭菌的目的
• 1，在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的后果： • 生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力；
七、补料液的灭菌
在发酵过程中，往往要向发酵罐中补入各种不同的料液。这 些料液都必需经过灭菌。灭菌的方法则视料液的性质、体积和补 料速率而定。如果补料量较大，而具有连续性时，则采用连续灭 菌较为合适。也有利用过滤法对另补料液进行除菌。补料液的分 批灭菌，通常是向盛有物料的容器中直接通入蒸汽。所有的附属 设备和管道都要经过灭菌。
缺点 –设备比较复杂，投资较大。
项目四 发酵工业的无菌操作 ppt课件
灭菌时
培养时
在培养时最好使用无菌的棉塞（不要使用铝箔覆盖培养瓶）；不 要使用潮湿或脏的瓶塞。
37
消除潜在的污染隐患-11
Stands
Centrifuge & it’s rotor
接触菌体频率高，空隙多容易隐匿菌体的器具要经常清洗消毒。
38
消除潜在的污染隐患-12
脏的移液器
反复使用的电击槽
与噬菌体污染的培养液 接触过的电极或buffer
设备渗漏或操作问题； ➢ 污染浅绿色菌落杂菌：冷却盘管渗漏引起； ➢ 污染霉菌：无菌室灭菌不彻底，或操作问题； ➢ 污染酵母菌：糖液灭菌不彻底。
42
（3）染菌的规模分析
大批量发酵罐染菌：种子、空气；
前期：种子带菌，灭菌问题； 中后期：空气带菌；
部分发酵罐染菌： 个别发酵罐连续染菌：设备渗漏
43
30
消除潜在的污染隐患-4
菌液培养时将盖拧紧
31
消除潜在的污染隐患-5
菌体相关垃圾处理：
▪ 生物安全柜或处理菌体的超净台应配备密封垃圾桶，以防止污染源外泄；
▪ 带有菌体的垃圾要做到当日灭菌；
▪ 如果当日不能灭菌，应使用垃圾袋密封后放置。
32
消除潜在的污染隐患-6
分光光度计周围： ▪ 菌体相关的废液建议收集到专门密闭容器，每日灭菌； ▪ 盛放过菌液的比色皿应注意清洗，清洗液同上处理。
这些噬菌体随风沙尘土和空气流动到处传播，有可能潜 入生产的各个环节，尤其是通过空气系统进入种子室、种子 罐、发酵罐。
55
噬菌体的防治
严禁活菌体排放，切断噬菌体的“根源”； 净化生产环境，消灭污染源； 保证纯种培养，严防种子本身带噬菌体，特别是溶源性
噬菌体；
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丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自 溶，发酵液粘度增加，过滤困难 处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂；②先加絮 凝剂使蛋白质凝聚后沉淀
杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采 用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间 极易发生乳化
1. 染菌的检查与判断
显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间
2. 污染原因分析
从污染时间看：早期污染可能与①②④⑤→接种操作 不当有关；后期污染可能与③⑤及中间补料有关。
从杂菌种类看： 耐热芽孢杆菌：与④有关 球菌、无芽孢杆菌：与① ② ③⑤有关 浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏 霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问 题 酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长
从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所 污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题，若个别 罐连续染菌，一般是设备问题。
3. 预防
种子带菌的防治 灭菌彻底 接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可 靠 保藏可靠
过滤空气带菌的防治 设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
“死角”
发酵罐的“死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌 轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支 撑件 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进 料管口 发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀
平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑
肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断
DO2水平异常变化 pH异常变化 尾气CO2异常变因： ① 种子带菌 ② 无菌空气带菌 ③ 设备渗漏 ④ 灭菌不彻底 ⑤操作失误 ⑥技术管理不善
发酵工程第四章无菌技术
精品jing
易水寒江雪敬奉
本章内容
一、概念 二、发酵工业污染的防治策略 三、发酵工业的无菌技术 四、培养基及设备灭菌 五、空气除菌
一、概念:灭菌、消毒、除菌、防腐
灭菌(sterilization):用化学或物理方法杀死物料或设备中所有有生命 物质的过程。 消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器 具表面的微生物。 除菌(degermation): 用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。 防腐(antisepsis): 用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖 。
操作不当造成染菌 噬菌体染菌及其防治
采取哪些措施能够保持无菌发酵？
物料、培养基、中间补料要灭菌； 发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发
酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌； 好气发酵通入的空气要除菌； 种子无污染；接种无菌操作过关； 为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。
三、发酵工业的无菌技术——灭菌方法
染杂菌，但噬菌体威胁大。 肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，
营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成 代谢产物。
（1）染菌对不同菌种发酵的影响
B. 霉菌 PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，
发酵一无所获。 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染
菌。 C. 酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌 D. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，
都应全部废弃。
（2）染菌种类对发酵的影响
青霉素：怕染细短产气杆菌 链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌 四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌 柠檬酸：怕染青霉菌 肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌 谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染
（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
种子扩大时期染菌: 灭菌后弃去 发酵前期染菌：
消毒与灭菌的区别 消毒与灭菌在发酵工业中的应用
二、发酵工业污染的防治策略
（一）污染的危害 （二）污染的防治
1.染菌的不良后果
消耗营养 合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难 改变pH 分解产物 噬菌体破坏极大
2.染菌危害的具体分析 （1）染菌对不同菌种发酵的影响
A．细菌 谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少
应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种
发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方 法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 ▪ 抗生素发酵 ▪ 柠檬酸发酵 a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制 细菌 b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母； 通风加大，加速产酸。
管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
污水
脓疱
罐底
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
法兰连接不当造成的“死角”
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
3. 预防
培养基与设备灭菌不彻底的防治 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变 死角
干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法 过滤除菌法 火焰灭菌法
四、培养基及设备灭菌
（一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌） （三）连续灭菌（连消） （四）分批灭菌与连续灭菌的比较
（一）湿热灭菌原理
1. 热阻 2. 微生物热死定律：对数残留定律 3.灭菌温度和时间的选择 4. 影响培养基灭菌的其它因素
1. 热阻
定义：微生物对热的抵抗力称为热阻，可用比死 亡速率常数k来表示 。
dN kN dt
ln Nt kt N0
k↓，热阻↑, t↑
1. 热阻
当温度T一定时，k随微生物不同而不同，具体 计算时，可取细菌芽孢的k值为标准。
（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
柠檬酸发酵
c.染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH下
降，黄曲霉自溶。 d.青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。
发酵后期污染 染菌量不太多，可继续发酵 污染严重，则提前放罐
杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本； 发现后加入，效果要具体评价
（4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响
杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采 用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间 极易发生乳化
1. 染菌的检查与判断
显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间
2. 污染原因分析
从污染时间看：早期污染可能与①②④⑤→接种操作 不当有关；后期污染可能与③⑤及中间补料有关。
从杂菌种类看： 耐热芽孢杆菌：与④有关 球菌、无芽孢杆菌：与① ② ③⑤有关 浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏 霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问 题 酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长
从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所 污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题，若个别 罐连续染菌，一般是设备问题。
3. 预防
种子带菌的防治 灭菌彻底 接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可 靠 保藏可靠
过滤空气带菌的防治 设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
“死角”
发酵罐的“死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌 轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支 撑件 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进 料管口 发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀
平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑
肉汤培养检查法 发酵过程的异常现象判断
DO2水平异常变化 pH异常变化 尾气CO2异常变因： ① 种子带菌 ② 无菌空气带菌 ③ 设备渗漏 ④ 灭菌不彻底 ⑤操作失误 ⑥技术管理不善
发酵工程第四章无菌技术
精品jing
易水寒江雪敬奉
本章内容
一、概念 二、发酵工业污染的防治策略 三、发酵工业的无菌技术 四、培养基及设备灭菌 五、空气除菌
一、概念:灭菌、消毒、除菌、防腐
灭菌(sterilization):用化学或物理方法杀死物料或设备中所有有生命 物质的过程。 消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器 具表面的微生物。 除菌(degermation): 用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。 防腐(antisepsis): 用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖 。
操作不当造成染菌 噬菌体染菌及其防治
采取哪些措施能够保持无菌发酵？
物料、培养基、中间补料要灭菌； 发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发
酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌； 好气发酵通入的空气要除菌； 种子无污染；接种无菌操作过关； 为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。
三、发酵工业的无菌技术——灭菌方法
染杂菌，但噬菌体威胁大。 肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，
营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成 代谢产物。
（1）染菌对不同菌种发酵的影响
B. 霉菌 PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，
发酵一无所获。 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染
菌。 C. 酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌 D. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，
都应全部废弃。
（2）染菌种类对发酵的影响
青霉素：怕染细短产气杆菌 链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌 四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌 柠檬酸：怕染青霉菌 肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌 谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染
（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
种子扩大时期染菌: 灭菌后弃去 发酵前期染菌：
消毒与灭菌的区别 消毒与灭菌在发酵工业中的应用
二、发酵工业污染的防治策略
（一）污染的危害 （二）污染的防治
1.染菌的不良后果
消耗营养 合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难 改变pH 分解产物 噬菌体破坏极大
2.染菌危害的具体分析 （1）染菌对不同菌种发酵的影响
A．细菌 谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少
应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种
发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方 法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 ▪ 抗生素发酵 ▪ 柠檬酸发酵 a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制 细菌 b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母； 通风加大，加速产酸。
管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
污水
脓疱
罐底
发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角”
法兰连接不当造成的“死角”
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
3. 预防
培养基与设备灭菌不彻底的防治 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 灭菌后期罐压骤变 死角
干热灭菌法 湿热灭菌法 射线灭菌法 化学药剂灭菌法 过滤除菌法 火焰灭菌法
四、培养基及设备灭菌
（一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌） （三）连续灭菌（连消） （四）分批灭菌与连续灭菌的比较
（一）湿热灭菌原理
1. 热阻 2. 微生物热死定律：对数残留定律 3.灭菌温度和时间的选择 4. 影响培养基灭菌的其它因素
1. 热阻
定义：微生物对热的抵抗力称为热阻，可用比死 亡速率常数k来表示 。
dN kN dt
ln Nt kt N0
k↓，热阻↑, t↑
1. 热阻
当温度T一定时，k随微生物不同而不同，具体 计算时，可取细菌芽孢的k值为标准。
（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响
柠檬酸发酵
c.染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH下
降，黄曲霉自溶。 d.青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。
发酵后期污染 染菌量不太多，可继续发酵 污染严重，则提前放罐
杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本； 发现后加入，效果要具体评价
（4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响