02质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析

质粒DNA的提取、酶切及其琼脂糖凝胶电泳实验报告

（2） TAE和TBE均为常用的缓冲液。

TBE比TAE有相对高的缓冲能力。

（3）加样染料溴酚蓝可与长度约为0.5 kb的DNA一起迁移，可用于指示迁移率最高的片段。

（4） DNA的迁移速率取决于以下因素:①DNA的分子大小—分子量越小，迁移越快。

②琼脂糖浓度—浓度越低，迁移越快。

③DNA的构象—环状的或带切口环状的DNA通常比线状的DNA迁移要快。

④两个电极之间单位厘米的电压——电压越高，迁移越快。

（5）如果DNA条带不够窄且不够均匀，可能是内以下原因所引起：①DNA过载②电压过高③加样孔破损④凝胶中有气泡（6）在紫外灯下观察凝胶电泳所得结果应该戴上防护眼镜，因为紫外线对眼睛有伤害作用；二．实验内容1．实验现象与结果：将电泳后的凝胶放在紫外灯的照射下观察到的和用凝胶电泳成像系统进行拍照得到的DNA电泳条带图如下所示意：图注：x’：代表经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带；x ：代表未经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带（x相同的互为对照组）；marker:DNA相对分子质量标准物。

pUC19质粒DNA标准参照条带图像：2．对实验现象、实验结果的分析及其结论：（1）对实验现象的分析及其结论：从上述所示的DNA电泳条带图可以看出：不管在DNA Sample中还是在经过酶切处理后的DNA样品中均具有电泳迁移速率处于中间的线性质粒DNA。

而在此次试验中出现线性质粒DNA是因为pUc质粒DNA在提取的过程中DNA双链在相对应的两条链上同时产生切口。

这说明质粒制备过程个出现线性DNA说明存在核酸酶污染或实验操作有问题。

可能在其中混有少量的蛋白质（图中，位置在marker组最后一电泳条带后方的很可能就是蛋白质组分），或者在实验的提取过程中加入溶液Ⅱ所经历的时间过长，在碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂，从而使提取的质粒DNA样品混入了基因组 DNA。

但是其中各组也存在超螺旋DNA（与marker组对照，电泳速率最快，跑在最前面的）。

质粒DNA的提取、酶切及其琼脂糖凝胶电泳实验报告

（2） TAE和TBE均为常用的缓冲液。

TBE比TAE有相对高的缓冲能力。

（3）加样染料溴酚蓝可与长度约为0.5 kb的DNA一起迁移，可用于指示迁移率最高的片段。

（4） DNA的迁移速率取决于以下因素:①DNA的分子大小—分子量越小，迁移越快。

②琼脂糖浓度—浓度越低，迁移越快。

③DNA的构象—环状的或带切口环状的DNA通常比线状的DNA迁移要快。

④两个电极之间单位厘米的电压——电压越高，迁移越快。

（5）如果DNA条带不够窄且不够均匀，可能是内以下原因所引起：①DNA过载②电压过高③加样孔破损④凝胶中有气泡（6）在紫外灯下观察凝胶电泳所得结果应该戴上防护眼镜，因为紫外线对眼睛有伤害作用；二．实验内容1．实验现象与结果：将电泳后的凝胶放在紫外灯的照射下观察到的和用凝胶电泳成像系统进行拍照得到的DNA电泳条带图如下所示意：图注：x’：代表经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带；x ：代表未经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带（x相同的互为对照组）；marker:DNA相对分子质量标准物。

pUC19质粒DNA标准参照条带图像：2．对实验现象、实验结果的分析及其结论：（1）对实验现象的分析及其结论：从上述所示的DNA电泳条带图可以看出：不管在DNA Sample中还是在经过酶切处理后的DNA样品中均具有电泳迁移速率处于中间的线性质粒DNA。

而在此次试验中出现线性质粒DNA是因为pUc质粒DNA在提取的过程中DNA双链在相对应的两条链上同时产生切口。

这说明质粒制备过程个出现线性DNA说明存在核酸酶污染或实验操作有问题。

可能在其中混有少量的蛋白质（图中，位置在marker组最后一电泳条带后方的很可能就是蛋白质组分），或者在实验的提取过程中加入溶液Ⅱ所经历的时间过长，在碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂，从而使提取的质粒DNA样品混入了基因组 DNA。

但是其中各组也存在超螺旋DNA（与marker组对照，电泳速率最快，跑在最前面的）。

质粒DNA的提取与琼脂糖凝胶电泳鉴定

实验题目质粒DNA的提取与琼脂糖凝胶电泳鉴定实验目的掌握质粒提取的原理与各种试剂的作用和琼脂糖凝胶电泳原理和操作实验原理质粒存在于细菌，线粒体等，独立于染色体之外，能够稳定遗传并自我复制，是一个双链环装DNA。

对数期大肠埃希菌含有质粒。

溶液一可使细菌充分重悬，溶液二使细菌裂解，释放质粒和基因组DNA.溶液三起到中和作用，使得质粒DNA迅速复性，而基因组DNA因为分子巨大，复性时间长。

离心后，质粒DNA留在上清液，而基因组DNA和细胞碎片沉淀在离心管。

琼脂糖凝胶电泳蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此泳动的速度不同，根据这个原理可将其分开。

电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。

常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。

用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至近50bp的DNA。

此外，直接用低浓度的核酸染料进行染色，可以确定DNA 在凝胶中的位置。

实验主要步骤质粒DNA提取1.取4ml细菌平均分两份加入离心管，以12000r/min离心1min，去除上清液2.加100ul用冰预冷溶液I，移液枪打散细菌沉淀使其成为悬浮液3.加入200ul溶液II，盖紧盖口，翻转五次，充分混合，避免振荡，置于冰上4.加入150ul冰预冷溶液III，盖紧盖口，翻转离心管5次，温和摇匀直到粘稠的细菌裂解物出现，放于冰上5min5.离心管以12000r/min离心5min6.取上清液加入等量的酚：氯仿混合液，轻轻摇匀，以12000r/min离心7min7.取上清液加入2倍体积100%乙醇沉淀DNA，轻轻摇匀，12000r/min离心5min，去除上清液，倒置在滤纸上干燥8.用1ml70%乙醇洗涤DNA沉淀，按照步骤7去除上清液，空气干燥10min9.用50ul无菌水溶解质粒DNA琼脂糖凝胶电泳：1.制胶。

将电泳缓冲液和琼脂糖在微波炉中熔化,混匀,冷却至55°℃,加入EB染料,倒入已封好的凝胶灌制平台上,插上样品梳。

质粒DNA的提取、酶切及其琼脂糖凝胶电泳实验报告

（2） TAE和TBE均为常用的缓冲液。

TBE比TAE有相对高的缓冲能力。

（3）加样染料溴酚蓝可与长度约为0.5 kb的DNA一起迁移，可用于指示迁移率最高的片段。

（4） DNA的迁移速率取决于以下因素:①DNA的分子大小—分子量越小，迁移越快。

②琼脂糖浓度—浓度越低，迁移越快。

③DNA的构象—环状的或带切口环状的DNA通常比线状的DNA迁移要快。

④两个电极之间单位厘米的电压——电压越高，迁移越快。

（5）如果DNA条带不够窄且不够均匀，可能是内以下原因所引起：①DNA过载②电压过高③加样孔破损④凝胶中有气泡（6）在紫外灯下观察凝胶电泳所得结果应该戴上防护眼镜，因为紫外线对眼睛有伤害作用；二．实验内容1．实验现象与结果：将电泳后的凝胶放在紫外灯的照射下观察到的和用凝胶电泳成像系统进行拍照得到的DNA电泳条带图如下所示意：图注：x’：代表经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带；x ：代表未经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带（x相同的互为对照组）；marker:DNA相对分子质量标准物。

pUC19质粒DNA标准参照条带图像：2．对实验现象、实验结果的分析及其结论：（1）对实验现象的分析及其结论：从上述所示的DNA电泳条带图可以看出：不管在DNA Sample中还是在经过酶切处理后的DNA样品中均具有电泳迁移速率处于中间的线性质粒DNA。

而在此次试验中出现线性质粒DNA是因为pUc质粒DNA在提取的过程中DNA双链在相对应的两条链上同时产生切口。

这说明质粒制备过程个出现线性DNA说明存在核酸酶污染或实验操作有问题。

可能在其中混有少量的蛋白质（图中，位置在marker组最后一电泳条带后方的很可能就是蛋白质组分），或者在实验的提取过程中加入溶液Ⅱ所经历的时间过长，在碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂，从而使提取的质粒DNA样品混入了基因组 DNA。

但是其中各组也存在超螺旋DNA（与marker组对照，电泳速率最快，跑在最前面的）。

02质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析

影响琼脂糖电泳迁移率的主要因素
♦ DNA的分子量的分子量 ♦ DNA的构象的构象* 的构象 ♦ 琼脂糖浓度 *
分子量Marker 分子量Marker
λDNA 100 bp Marker (EcoRI Hind III)
1kb Marker
不同构像质粒
质粒电泳图
pBSKSChiA
分离不同大小DNA片段的分离不同大小DNA片段的合适琼脂糖凝胶浓度
盖好电泳槽盖子， 7. 盖好电泳槽盖子，选择适当的电泳电压 5V/cm）及电泳方向(DNA (DNA阴极向阳（≤5V/cm）及电泳方向(DNA阴极向阳），开始电泳开始电泳。极），开始电泳。当溴酚兰带离开上样孔约2 3cm时 8. 当溴酚兰带离开上样孔约2－3cm时，停止电泳，样品在紫外灯下观察、成像。止电泳，样品在紫外灯下观察、NA的琼脂糖凝胶电泳分析
1、实验目的：
学习琼脂糖凝胶电泳的原理与方法, 学习琼脂糖凝胶电泳的原理与方法, 及利用琼脂糖凝胶电泳检测纯度，浓度并分析质粒构型。糖凝胶电泳检测纯度，浓度并分析质粒构型。
2、实验原理：实验原理：电泳检测技术质粒构型
电泳概念及种类 • 电泳：是指带电粒子在电场中向与其自身带电泳：
相反电荷的电极移动的现象
带负电粒子
正极
带正电粒子
负极
琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳一般都采用水平式电泳槽，琼脂糖凝胶电泳一般都采用水平式电泳槽，水平式电泳槽它具有灌胶、制板、点样等操作方便的优点；它具有灌胶、制板、点样等操作方便的优点；也可用于制备不同大小的凝胶；即使低浓度的琼脂可用于制备不同大小的凝胶；糖凝胶也不易碎裂；而且器材廉价耐用。糖凝胶也不易碎裂；而且器材廉价耐用。

质粒dna的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告及思考题

1．实验目的：（1）通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒；（2）通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术；2．实验材料及用品（1）实验仪器（apparatus）：恒温培养箱（Constant temperature incubator）、恒温摇床（Constant temperature shaking table）、高速离心机（High speed centrifuge）、漩涡振荡器（V ortex mixer）、超净工作台（Bechtop）、高压灭菌锅（Autoclave）、微量加样器（Pipettes）、烧杯（beaker）、量筒（graduated cylinder）、玻璃棒（stir bar）、微波炉（microwave）、天平（Pan balance）、电泳梳子（comb）、电泳槽（electrophoresis tank）、电泳器（Electro-phoresis System）、紫外灯（Ultraviolet transilluminator ）3）、材料与试剂（Reagents）：①溶液I（Solution Ⅰ）：50mmol/L 葡萄糖；25mmol/L 三羟基甲基氨基甲烷（Tris）Tris-HCl（pH8.0）；10mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）pH8.0溶液I可成批配制，每瓶约100ml，10磅高压蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。

②溶液Ⅱ（Solution Ⅱ）：新鲜配制，等体积混合0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）；1% SDS （可用10％贮存液稀释配制）注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。

③溶液III （Solution Ⅲ，100mL)：加上后混匀会形成絮状沉淀60mL 5mol/L KAc，11.5mL 冰醋酸，28.5mL H2O （该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L）④TE液缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）；1 mmol/L EDTA（pH8.0）⑤70% 乙醇；⑥平衡酚：氯仿1：1：将量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入24 ml 氯仿和1 ml 异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。

质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定

琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，应选用电泳纯的，琼脂糖此级产品筛除了抑制物和核酸酶，而且用溴化乙锭染色后荧光背景最小。

（1）琼脂糖凝胶电泳装置
由于琼脂糖凝胶电泳既要求不高，而适应性又强，在过去15 年里已成功地设计了形形色色及大大小小的电泳槽。

对这些装置的选择主要是依据个人的喜恶。

使用最普遍的装置是Walter Schaffner 发明的水平板凝胶。

水平板凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。

在有些装置中，则可将凝胶直接铺在平台上。

凝胶恰好浸在缓冲液液面下进行电泳。

凝胶的电阻几乎与缓冲液的电阻相同，所以有相当一部分的电流将通过凝胶的全长。

（2）琼脂糖凝胶的制备
琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。

然后将熔化液倒入胶模中，令其固化。

凝固后，琼脂糖形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。

通贯凝胶的电场接通后，在中性pH 值下带负电荷的DNA 向阳极迁移。

（3）琼脂糖凝胶的染色
电泳完毕，将琼脂糖凝胶转移入含EB 的染液中，染色10 分钟，取出紫外灯下观察。

原文地址:/biotech/exp/molbio/DNA/2010/k820116114.html。

琼脂糖凝胶电泳检测质粒

琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA
一、实验原理琼脂糖凝胶电泳：是常用的用于分离、鉴定及纯化DNA分子标准方法，这种电泳方法以琼脂糖凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。
• 实验仪器：电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等 • 实验试剂：琼脂糖，TAE电泳缓冲液，溴化乙锭（EB），上样缓冲液
电泳结束后，在紫外观测仪上进行观察
结果分析
Thanks
将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在3—5mm之间，凝固约30min。
在凝胶完全凝固之后，小心移去梳子，将胶床放在电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极（黑极）。向电泳槽中注入适量的TAE缓冲液，通常缓冲液高于胶面1cm。
将适量的质粒样品与加样缓冲液混合,用移液枪将样品加入加样孔。
正确连接电泳槽和电源，设定稳压为3-5V/cm。
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小Tris—乙酸（TAE） 2. Tris—硼酸（TBE） 3. Tris—磷酸（TPE） PH为7.5—8.0,这些缓冲液均含有EDTA。
溴化乙锭（EB） • 溴化乙锭（EB）是一种吖啶类染料，它在紫外灯照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的 DNA。
迁移方向 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷 DNA迁移方向？点样孔朝向？
影响DNA迁移率的因素 • DNA分子大小 • DNA分子的构象
DNA分子大小 • 线形的双链DNA分子在凝胶中迁移的速率与其碱基数的对数成反比。 • 分子越大，迁移越慢。一是摩擦阻力越大，二是大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。

dna的琼脂糖凝胶电泳实验原理和操作步骤

一、实验目的琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。

二、实验原理琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。

DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。

在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。

DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。

不同构型的DNA分子的迁移速度不同。

如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。

这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。

不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。

在中性或碱性时，单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。

影响核酸分子泳动率的因素主要是：1、样品的物理性状即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。

一般而言，电荷密度愈大，泳动率越大。

但是不同核酸分子的电荷密度大致相同，所以对泳动率的影响不明显。

对线形分子来说，分子量的常用对数与泳动率成反比，用此标准样品电泳并测定其泳动率，然后进行DNA分子长度（bp）的负对数——泳动距离作标准曲线图，可以用于测定未知分子的长度大小。

DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：cDNA ＞IDNA＞ocDNA但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。

质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳分析

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电泳分类
♦ 按支持物的物理性状不同，区带电泳可分为：按支持物的物理性状不同，区带电泳可分为：
1) 滤纸及其他纤维（如醋酸纤维、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维）薄膜电泳； 2) 粉末电泳（如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳） 3) 凝胶电泳（如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶等） 4) 丝线电泳（如尼龙丝、人造丝电泳）
分子量Marker 分子量
λDNA 100 bp Marker (EcoRI Hind III)
1kb Marker
不同构像质粒
♦ 按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为：按支持物的装置形式不同，区带电泳可分为： ♦ 1) 平板式电泳（支持物水平放置，是最常用的电
泳方式） ♦ 2) 垂直板式电泳（聚丙烯酰胺凝胶常做成垂直板式电泳） ♦ 3) 垂直柱式电泳（聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳即属于此类） ♦ 4) 连续液动电泳（应用于纸电泳，将滤纸垂直竖立，两边各放一电极，溶液自顶端向下流，与电泳方向垂直。后来有用淀粉、纤维素粉、玻璃粉等代替滤纸来分离血清蛋白质，分离量最大）
思考题
♦ 为何选琼脂糖做电泳介质，琼脂糖与琼脂区别？为何选琼脂糖做电泳介质，琼脂糖与琼脂区别？ ♦ 实验中为何要加入，使用要注意哪些问题？实验中为何要加入EB，使用要注意哪些问题？ ♦ 上样缓冲液由哪些成分组成，有何异同？上样缓冲液由哪些成分组成，有何异同？
质粒电泳图
pBSKSChiA
完毕
会使制胶板变形。会使制胶板变形。胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向胶一定要凝固好才能拔梳子，上，以免弄坏样点。以免弄坏样点。点样时枪头下伸，以免产生气泡、弄坏点样孔。点样时枪头下伸，以免产生气泡、弄坏点样孔。溴化乙锭见光易分解，溴化乙锭见光易分解，应存于棕色瓶中低温保存在紫外灯光下放置过长荧光会猝灭。，在紫外灯光下放置过长荧光会猝灭。溴化乙锭是强致突变剂，切勿接触人体，溴化乙锭是强致突变剂，切勿接触人体，手套操作。

质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳实验报告

质粒DNA的小量提取及DNA琼脂糖凝胶电泳一、前言质粒质粒是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子(即细胞附殖粒、又胞附殖粒)。

大部分的质粒虽然都是环状构型，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物（多为原核生物）中，乃至于植物的线粒体等胞器中。

然而，1984年，在Streptomyces coelicoler(天蓝色链霉菌)等放线菌以及在Borrelia hermsii(赫氏蜱疏螺旋体)等原核生物中，又相继发现线形质粒。

天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。

质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。

质粒的套数在细胞里从单一到数千都有可能。

有时有些质粒含有某种抗药基因(如大肠杆菌中就有含有抗四环素基因的质粒)。

有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代谢能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。

一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。

它是基因工程最常见的运载体。

质粒在细胞内的复制一般有两种类型:紧密控制型和松弛控制型。

前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有一个或几个质粒分子，如F因子。

后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有许多拷贝，一般在20个以上，如Col E1质粒。

在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时，细胞内蛋白质合成、染色体DNA复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而松弛型质粒继续复制，质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个，此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。

把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体。

细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。

质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构。

质粒还带有某些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状。

质粒DNA的提取、酶切及其琼脂糖凝胶电泳实验报告

（2） TAE和TBE均为常用的缓冲液。

TBE比TAE有相对高的缓冲能力。

（3）加样染料溴酚蓝可与长度约为0.5 kb的DNA一起迁移，可用于指示迁移率最高的片段。

（4） DNA的迁移速率取决于以下因素:①DNA的分子大小—分子量越小，迁移越快。

②琼脂糖浓度—浓度越低，迁移越快。

③DNA的构象—环状的或带切口环状的DNA通常比线状的DNA迁移要快。

④两个电极之间单位厘米的电压——电压越高，迁移越快。

（5）如果DNA条带不够窄且不够均匀，可能是内以下原因所引起：①DNA过载②电压过高③加样孔破损④凝胶中有气泡（6）在紫外灯下观察凝胶电泳所得结果应该戴上防护眼镜，因为紫外线对眼睛有伤害作用；二．实验内容1．实验现象与结果：将电泳后的凝胶放在紫外灯的照射下观察到的和用凝胶电泳成像系统进行拍照得到的DNA电泳条带图如下所示意：图注：x’：代表经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带；x ：代表未经过酶切的质粒DNA样品的电泳条带（x相同的互为对照组）；marker:DNA相对分子质量标准物。

pUC19质粒DNA标准参照条带图像：2．对实验现象、实验结果的分析及其结论：（1）对实验现象的分析及其结论：从上述所示的DNA电泳条带图可以看出：不管在DNA Sample中还是在经过酶切处理后的DNA样品中均具有电泳迁移速率处于中间的线性质粒DNA。

而在此次试验中出现线性质粒DNA是因为pUc质粒DNA在提取的过程中DNA双链在相对应的两条链上同时产生切口。

这说明质粒制备过程个出现线性DNA说明存在核酸酶污染或实验操作有问题。

可能在其中混有少量的蛋白质（图中，位置在marker组最后一电泳条带后方的很可能就是蛋白质组分），或者在实验的提取过程中加入溶液Ⅱ所经历的时间过长，在碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂，从而使提取的质粒DNA样品混入了基因组 DNA。

但是其中各组也存在超螺旋DNA（与marker组对照，电泳速率最快，跑在最前面的）。

质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳

（3）胶浓度（4）电场强度：根据需要选择合适电压。
为了尽快得到实验结果，所用电场强度约为5V/cm，但分辨率不高。精确测定DNA分子大小时，电压1V/cm。（5）溴化乙锭简称EB，电泳中的染色剂。
具有扁平结构，能嵌入到DNA碱基对间，对线状分子与开环分子影响较小而对超螺旋态的分子影响较大。
（6）电泳缓冲液常用DNA电泳缓冲液（1000ml) TAE （50×） 242gTris 57.1ml 冰乙酸 100ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0)
TBE（5×） 54gTris 27.5硼酸 20ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0)
TPE （10×） 108g Tris 15.5ml 磷酸 (85%，1.679g/ml) 40ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0)
（2）荧光染料 GoldViewTM核酸染料
三、实验操作步骤
• 琼脂糖凝胶的制备（浓度依照质粒大小确定）. • 凝胶板的制备 • 加样（加样体积在10~30ul） • 电泳 • 结果观察
1234
1：DNA Marker2； 2～3：Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ双酶切的pET/dhaT质粒； 4：pET-28a-c(＋)空质粒
3、DNA电泳上样缓冲液主要作用如下：（1）螯合Mg2＋，防止电泳过程中DNA被降解（2）增加样品密度以保证DNA沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。大片段电泳中采用Ficoll（聚蔗糖），可减少DNA条带的弯曲和托尾现象。（3）指示剂监测电泳的行进过程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿，它的速率约与 300bp的线状双链DNA相同。
DNA的琼脂糖凝胶电泳

质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告

一、实验名称：质粒DNA的提取与纯化，DNA琼脂糖凝胶电泳二、实验原理：1.质粒DNA的提取：质粒是一类存在于几乎所有细菌等微生物中染色体之外（细胞质中）呈游离状态的双链、闭环的DNA分子，能够自主复制和稳定遗传，以超螺旋形式存在，是最常用的基因克隆载体。

除质粒外，大肠杆菌中还含有基因组DNA、各种RNA、蛋白质和脂质等物质，因此需要裂解细胞并除去蛋白质和染色体DNA等物质才能分离纯化出质粒DNA。

分离制备质粒DNA的方法很多，其中常用的方法有碱裂解法、煮沸法、SDS法、羟基磷灰石层析法等。

在实际操作中可以根据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。

本实验使用碱裂解法，即利用SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液分离提取质粒DNA.其原理如下。

（1）碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA的原理：碱裂解法提取质粒DNA是根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA之间变性与复性的差异来分离质粒DNA，达到分离提纯质粒DNA的目的。

在pH值高达12.6的碱性条件下，线性的DNA因氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的大部分氢键会被断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链相互缠绕，不会完全分离。

当加入pH4.8乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性，恢复其天然构象，以可溶状态存在于液相中；而线性的染色体DNA由于两条互补链彼此已完全分开、分子量大、结构复杂而相互缠绕形成不溶性网状结构。

与不稳定的大分子RNA、变形的蛋白质以及细菌碎片等一起沉淀而被除去。

进一步用酚、氯仿使蛋白质变性去除蛋白质杂质，然后用无水乙醇沉淀，即可获得纯化的质粒DNA。

SolutionⅠ、Ⅱ、Ⅲ三种溶液以及无水乙醇沉淀DNA的具体作用和原理如下。

（2）四种溶液作用及原理：①Solution I的作用：悬浮大肠杆菌菌体，增加溶液的粘度，维持渗透压及防止DNA受机械剪切力作用而降解。

质粒DNA的提取及其琼脂糖凝胶电泳实验报告及思考题

1．实验目的：（1）通过本次实验学习和掌握碱裂解法提取质粒；（2）通过本次实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术；2．实验材料及用品（1）实验仪器（apparatus）：恒温培养箱（Constant temperature incubator）、恒温摇床（Constant temperature shaking table）、高速离心机（High speed centrifuge）、漩涡振荡器（V ortex mixer）、超净工作台（Bechtop）、高压灭菌锅（Autoclave）、微量加样器（Pipettes）、烧杯（beaker）、量筒（graduated cylinder）、玻璃棒（stir bar）、微波炉（microwave）、天平（Pan balance）、电泳梳子（comb）、电泳槽（electrophoresis tank）、电泳器（Electro-phoresis System）、紫外灯（Ultraviolet transilluminator ）3）、材料与试剂（Reagents）：①溶液I（Solution Ⅰ）：溶液I可成批配制，每瓶约100ml，10磅高压蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。

②溶液Ⅱ（Solution Ⅱ）：新鲜配制，等体积混合0.2mol/L NaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）；1% SDS （可用10％贮存液稀释配制）注意：SDS易产生气泡，不要剧烈搅拌。

③溶液III （Solution Ⅲ，100mL)：加上后混匀会形成絮状沉淀60mL 5mol/L KAc，11.5mL 冰醋酸，28.5mL H2O （该溶液钾离子浓度为3mol/L，醋酸根离子浓度为5mol/L）④TE液缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）；1 mmol/L EDTA（pH8.0）⑤70% 乙醇；⑥平衡酚：氯仿1：1：将量取25 ml Tris-HCl（pH8.0）平衡苯酚，加入24 ml 氯仿和1 ml 异戊醇，充分混合后，移入棕色玻璃瓶中，4℃保存。

质粒DNA提取原理步骤凝胶电泳分析及其应用

对
接种单菌落。检查抗生素使用
策
浓度是否正确。
• 溶液Ⅱ在温度较低时可能出现浑浊，置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液。
常见问题
问题二：质粒纯度不高，如何解决？
原因
• 混有蛋白
• 混有RNA
对
• 混有基因组DNA 策
• 不要使用过多菌体。重新纯化 DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质
• 加入RNaseA室温放置一段时间
以上是琼脂糖凝胶在生物学各个领域中的部分应用。但由于当今
生物研究领域正处于飞速的发展之中，所以琼脂糖凝胶的应用范围可能会更广，会在生物研究中发挥自己应有的作用。
溶液 I
• 50mmol/L 葡萄糖 • 25mmol/L Tris·Cl(pH8.0) • 10 mmol/L EDTA (pH8.0)
利用琼脂糖凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂糖凝胶，其内部为多孔网状。而且孔径很大，可以允许大分子物质（分子量自十几万到几百万以上）自由通过。因为大多数抗原和抗体的分子量都在20万以上，所以它们在琼脂糖凝胶中几乎可以自由扩散。而且琼脂糖凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处理容易等优点，因此是免疫沉淀检测技术中最理想的扩散介质。双向琼脂扩散实验中也用琼脂或琼脂糖作为扩散介质，原因同上。
• 向上清中加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24:1），反复混匀，12000r/min离心2min，将上清转至另一离心管中
• 向上清中加入2倍体积异丙醇，混匀后，室温放置2min， 12000r/min 离心1min.
• 倒去上清液，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体
• 用1mL70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡，12000r/min离心30s，倒去上清液，空气干燥10min

琼脂糖凝胶电泳检测质粒

溴化乙锭eb溴化乙锭eb是一种吖啶类染料它在紫外灯照射下能发射荧光当dna样品在琼脂糖凝胶中电泳时琼脂糖凝胶中的eb就插入dna分子中形成荧光络合物使dna发射的荧光增强几十倍电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的dna
琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA
一、实验原理琼脂糖凝胶电泳：是常用的用于分离、鉴定及纯化DNA分子标准方法，这种电泳方法以琼脂糖凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。
DNA分子的构象
• 不同构象DNA分子在电场中移动的距离不同。具有相同分子量的线状、开环状和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度糖胶液：取0.4g琼脂糖溶于40mL TAE中。
在短时间里加热琼脂糖全部熔化。使溶液冷却至60℃。(加入EB ，使EB的终浓度为1μg/mL)。
电泳结束后，在紫外观测仪上进行观察
结果分析
Thanks
迁移方向 DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷 DNA迁移方向？点样孔朝向？
影响DNA迁移率的因素 • DNA分子大小 • DNA分子的构象
DNA分子大小 • 线形的双链DNA分子在凝胶中迁移的速率与其碱基数的对数成反比。 • 分子越大，迁移越慢。一是摩擦阻力越大，二是大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。
将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在3—5mm之间，凝固约30min。
在凝胶完全凝固之后，小心移去梳子，将胶床放在电泳槽内，加样孔一侧靠近阴极（黑极）。向电泳槽中注入适量的TAE缓冲液，通常缓冲液高于胶面1cm。
将适量的质粒样品与加样缓冲液混合,用移液枪将样品加入加样孔。
正确连接电泳槽和电源，设定稳压为3-5V/cm。
溴化乙锭（EB） • 溴化乙锭（EB）是一种吖啶类染料，它在紫外灯照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检测琼脂糖中的 DNA。

质粒DNA的检测琼脂糖凝胶电泳

实验原理
2.质粒DNA的检测琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为 0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。 DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。
Bam HI： G↓GATCC
Hind III： A↓AGCTT
DNA连接酶能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键，这种酶需要在一条DNA链的3-末端具有一个游离的-OH，和在另一条DNA链的5-末端具有一个磷酸基团(-P)
实验原理
4. 重组质粒转化到大肠杆菌的表达系统（BL-21）中
细菌处于外源DNA的生理状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA分子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0℃，在有氯化钙存在的低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-磷酸钙复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有抗生素的选择培养基上。