1.2基因工程的基本操作程序
合集下载
基因工程程序
编码区下游 非编码区
终止子
能够转录为相应的信 使RNA，进而指导蛋 白质的合成，也就是 说能够编码蛋白质
不能转录为 信使RNA， 不能编码蛋 白质
真核细胞的基因结构 外显子
编码区上游
非编码区
编码区
内含子
编码区上游
非编码区
启动子
与RNA聚酶 结合位点
不能转录 为信使RNA， 不能编码 蛋白质
终止子
能够编码 蛋白质的 序列叫做 外显子
Ti质粒
✓Ti质粒是农杆菌的染色体外遗传物质 ✓双链闭合环状DNA ✓植物基因工程常用的载体
将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上构成重组Ti质粒 转入农杆菌细胞
含重组Ti质粒的农杆菌感染植物细胞 使目的基因整合到植物染色体上，实现遗传转化
组培再生获得植株
2、将目的基因导入动物细胞 ——显微注射技术
1.2基因工程的基本操作程序
1.2 基因工程的基本操作程序
一、目的基因的获取 二、基因表达载体构建 三、将目的基因导入受体细胞 四、目的基因的检测和鉴定
一、目的基因的获取
目的基因是人们所需要转移或改造的基因。
如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有 植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种 子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛cDNA 复制
双链cDNA
载体DNA
重组DNA分子
导入 受体菌增殖 cDNA基因组与cDNA的比较：只包括某一特定细胞类型、某一
组织、或某一发育时期的表达序列。 3、分离特定基因，cDNA库比较。 原 料：4种游离三磷酸脱氧核苷酸dNTP
dCTP、dGTP、dATP 、dTTP 。 能 量：dNTP 缓冲液：
DNA变性的本质是双链间氢键的断 裂
1.2基因工程的基本操作程序
PCR仪
微量离心管
推动按钮
微量移液器
调节轮
一 次 性 吸液枪头 卸枪头器
卸枪头按钮
利用PCR技术扩增目的基因
PCR技术
相 原理 同 原料 点 条件
解旋 方式
DNA复制
碱基互补配对 四种脱氧核苷酸 模板、能量、酶
DNA在高温下变性解旋 解旋酶催化 细胞核内 细胞内的DNA聚合酶 形成整个DNA分子
例：用棉铃饲喂棉 铃虫，如虫吃后不出现 中毒症状，说明未摄入 目的基因或摄入目的基 因未表达。如虫吃后中 毒死亡，则说明摄入了 抗虫基因并得到表达。
(四)目的基因的检测与鉴定 ——检查是否成功
①检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因 分子 检测
方法—— DNA分子杂交
②检测目的基因是否转录出了mRNA 方法—— 分子杂交 ③检测目的基因是否翻译成蛋白质
—— 核心
DNA连接酶
3.将切下的目的基因片段插入载体的______处，再加入适量 切口 DNA连接酶 ___________，形成了一个重组DNA分子
基因表达载体的组成：
a、复制原点 b、启动子
c 、目的基因
d 、终止子
e、标记基因
启动子：位于基因的首端的 一段特殊的DNA片断，它是 RNA聚合酶识别和结合的部 位，有了它才能驱动基因转 录出mRNA，最终获得蛋白质。
终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断， 能终止mRNA的转录。
三、将目的基因导入受体细胞 • 常用的受体细胞：
动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。
• 将目的基因导入受体细胞的原理：
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
受体细胞 转化——目的基因进入_________内，并且在 稳定 表达 受体细胞内维持_____和_____的过程
1.2基因工程的基本操作程序
步骤二：基因表达载体癿构建
相同点
编码区 都由能够编码蛋白质癿________和具有调 非编码 控作用癿__________区组成癿
步骤一：目癿基因癿获叏
1、目癿基因癿来源 ①从自然界已有癿物种分离 ②人工方法合因，需要对目癿基 因进行PCR技术扩增
编码区
非编码区 终止子
基因癿结构（补充知识）
1、原核基因癿结构
非编码区 启动子 RNA聚合酶结合位点
（3）编码区：能转录相应癿信使RNA，能编码蛋白质癿序列。 （4）非编码区 ：调控遗传信息表达癿核苷酸序列(启动子、 终止子），丌编码蛋白质。
编码区
非编码区 终止子
基因癿结构（补充知识）
2、真核基因癿结构
步库）
提叏细胞癿mRNA 反转录酶
不载体连接（单链RNA+单链DNA）
核酸酶H 单链DNA
DNA聚合酶
步骤因结构癿哪个片段？
原核细胞：编码区 真核细胞：外显子
步骤一：目癿基因癿获叏
（二）利用PCR技术扩增目癿基因 多聚酶链式反应 （1）概念：PCR全称为__________________，是一项 体外 特定DNA片段 在生物_____复制________________癿核酸合成技术。 （2）原理：DNA复制 （3）条件：已知基因癿核苷酸序列、 引物 热稳定DNA聚合酶、四种脱氧核苷酸 （4）方式：以指数方式扩增，即2n （n为扩增循 环癿次数） （5）结果：使目癿基因癿片段在短时间内成百万倍 地扩增
1.2 基因工程癿基本操作程序
基因工程癿基本操作程序主要包括四个步骤
① 目癿基因癿获叏 ② 基因表达载体癿构建（核心） ③ 将目癿基因导入叐体细胞
④ 目癿基因癿检测不鉴定
人教版高中生物选修三1.2 基因工程的基本操作程序
1．2 基因工程的基本操作程序阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测和鉴定等步骤。
知识点一 目的基因的获取1.目的基因：主要是指编码蛋白质的基因，也可以是一些具有调控作用的因子。
2.目的基因的获取方法 (1)从基因文库中获取①基因文库：将含有某种生物不同基因的许多DNA 片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。
②种类⎩⎪⎨⎪⎧基因组文库：包含一种生物所有的基因部分基因文库：包含一种生物的一部分基因③提取依据：基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA ，以及基因的表达产物蛋白质等特性。
(2)利用PCR 技术扩增目的基因①PCR 的含义：是一项在生物体外复制特定DNA 片段的核酸合成技术。
②目的：短时间内大量扩增目的基因。
③原理：DNA 双链复制。
④过程第一步：加热至90～95 ℃，DNA 解链；第二步：冷却至55～60 ℃，引物结合到互补DNA 链；第三步：加热至70～75 ℃，热稳定DNA 聚合酶(Taq 酶)从引物起始进行互补链的合成。
如此重复循环多次。
⑤特点：指数形式扩增。
(3)人工合成如果目的基因较小，核苷酸序列又已知，可通过DNA 合成仪用化学方法人工合成。
1．cDNA 文库与基因组文库的区别2.PCR过程优点操作简单专一性强可在短时间内大量扩增目的基因专一性强，可产生自然界中不存在的新基因缺点工作量大、盲目性大、专一性差操作过程较麻烦，技术要求过高需要严格控制温度、技术要求高适用范围小1．下列有关获取目的基因的方法的叙述，错误的是()A．直接分离目的基因的方法的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性B．由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，一般使用人工合成的方法C．目前人工合成基因的方法主要有两种，分别是反转录法和化学合成法D．PCR技术的原理是DNA复制，需要RNA聚合酶催化DNA合成[解析]选D。
1.2 基因工程的基本操作程序
2010寒假生物预习学案—————————————②1.2 基因工程的基本操作程序制作人：王军审阅人：任金龙魏巍 2010-2-2 班级：__________ 小组:____________ 姓名：_____________学习目标：①写出基因工程的四个操作步骤。
②解释基因文库、基因组文库、部分基因文库的区别与联系。
③分析基因工程四个步骤的原理、工具及具体的操作程序。
学习过程：基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：、、、。
(一) 目的基因的获取获取目的基因的方法：(1)从中获取目的基因：①基因文库：将含有某种生物的许多DNA片段，导入受体菌的中储存，各个受体菌分别含有这种生物的，称为基因文库。
基因文库可大可小，如果它包含了一种生物所有的基因，就叫；如果它只包含一种生物的一部分基因，就叫，如。
②具体方法：可根据基因的序列、基因的、基因在上的位置、基因的转录产物以及基因翻译产物等特性来获取目的基因。
(2)利用扩增目的基因：原理：前提：过程：(二)基因表达载体的构建（基因工程的核心）(1)目的：(2)组成：①启动子：是一段有特殊结构的，位于基因的，是识别和结合的部位，能驱动基因，最终获得所需的。
②终止子：也是一段有特殊结构的，位于基因的。
③标记基因的作用：；常用的标记基因是。
(三)将目的基因导入受体细胞(1)转化的概念：(2)常用的转化方法：①将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是，其次还有和等。
②将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是。
此方法的受体细胞是。
③将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是，最常用的原核细胞是，其转化方法是：先用处理细胞，使其成为，再将溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。
(四)目的基因的检测与鉴定(1)首先要检测，方法是采用。
(2)其次还要检测，方法是采用。
(3)最后检测，方法是从转基因生物中提取，用相应的进行杂交。
基因工程的基本操作程序
双子叶植物 :花生、大豆、棉花…
单子叶植物 : 水稻、小麦、玉米…
双子叶植物－网状脉
单子叶植物－平行脉
显微注射技术
目的基因的表达和检测 检测对象 目的基因是否导入 分子 目的基因是否转录 水平 方法
DNA分子杂交法
DNA-RNA分子杂交法
目的基因是否翻译
个体 受体是否具有 转基因特征 水平
抗原－抗体杂交法 接种实验
专题1
基因工程
1.2 基因工程的基本操作程序
目的基因的获取
基因表达载体的构建 将目的基因导入受体细胞 目的基因的检测和鉴定
基因工程的目的基因－－
从供体转移到受体的基因。 更符合人们需要的基因就可以是目的基因。 与生物抗逆性相关的基因 与优良品质相关的基因
与生物药物和保健品相关的基因
PCR技术
加热变性
PCR循环
退火复性
延伸
高温变性 低温复性
中温延伸
PCR反应体系中目的基因成指数(2n)形式扩增
一个DNA分子进行PCR扩增, 循环4次，理论上至少需要 几个引物？
D N A 增 殖
细胞内复制
1）模板：DNA母链 2）原料： 4种 dNTP 3）酶： 解旋酶 DNA聚合酶 引物 DNA连接酶 4）特点: 半保留复制
DNA合成仪
RNA逆转录的过程
逆转录酶
mRNA
RNA－DNA 杂合双链
单链DNA
DNA聚合酶
cDNA
Байду номы的基因结构
非编码区
（上游）
编码区 (编码蛋白质)
非编码区
(下游)
启动子
(与RNA聚合 酶结合位点)
终止子
(转录终止 标记)
1.2 基因工程的基本操作程序
移 植
分裂 含目的基因 分化 的受精卵
雌性动物输 发育 转基因
卵管或子宫
动物
为什么将目的基因导入动物细胞常用的受体细 胞是受精卵？
（三）导入微生物细胞 Ca2+ 处理法
1. 过程 （1）制备感受态细胞：用Ca2+（CaCl2）处理细菌，使细 菌易于接受外源DNA分子。 （2）重组DNA分子与感受态细胞混合孵育，完成转化。
呼吸酶基因
胰岛素基因
ATP酶 基因
胰岛B细胞的mRNA上含有部分的基因
胰岛A细胞的DNA上含有全部的基因
呼吸酶基因
胰高血糖素基因
胰岛素基因
抗体基因
ATP酶 基因
……
转基录因的选择性表达
呼吸酶基因
胰高血糖素基因
ATP酶 基因
胰岛A细胞的mRNA上含有部分的基因
浆细胞的DNA上含有全部的基因
呼吸酶基因
基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、 土壤农杆菌和动植物细胞等。
导入受体细胞的方法 ，因受体细胞的不同而不同。
（一）导入植物细胞
（1）农杆菌转化法
①适用范围： 易感染双子叶植物和裸子植物，对
大多数单子叶植物没有感染能力
②原理： Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受
体细胞染色体的DNA上。
胰高血糖素基因
胰岛素基因
抗体基因
ATP酶 基因
……
转基录因的选择性表达
呼吸酶基因
抗体基因
ATP酶 基因
抗体细胞的mRNA上含有部分的基因3. 基因的构建（1）基因组的构建
提取某生物 用适当限 全部DNA 制酶切割
许 多 与载体连接导片段）
的原理．
分裂 含目的基因 分化 的受精卵
雌性动物输 发育 转基因
卵管或子宫
动物
为什么将目的基因导入动物细胞常用的受体细 胞是受精卵？
（三）导入微生物细胞 Ca2+ 处理法
1. 过程 （1）制备感受态细胞：用Ca2+（CaCl2）处理细菌，使细 菌易于接受外源DNA分子。 （2）重组DNA分子与感受态细胞混合孵育，完成转化。
呼吸酶基因
胰岛素基因
ATP酶 基因
胰岛B细胞的mRNA上含有部分的基因
胰岛A细胞的DNA上含有全部的基因
呼吸酶基因
胰高血糖素基因
胰岛素基因
抗体基因
ATP酶 基因
……
转基录因的选择性表达
呼吸酶基因
胰高血糖素基因
ATP酶 基因
胰岛A细胞的mRNA上含有部分的基因
浆细胞的DNA上含有全部的基因
呼吸酶基因
基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、 土壤农杆菌和动植物细胞等。
导入受体细胞的方法 ，因受体细胞的不同而不同。
（一）导入植物细胞
（1）农杆菌转化法
①适用范围： 易感染双子叶植物和裸子植物，对
大多数单子叶植物没有感染能力
②原理： Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受
体细胞染色体的DNA上。
胰高血糖素基因
胰岛素基因
抗体基因
ATP酶 基因
……
转基录因的选择性表达
呼吸酶基因
抗体基因
ATP酶 基因
抗体细胞的mRNA上含有部分的基因3. 基因的构建（1）基因组的构建
提取某生物 用适当限 全部DNA 制酶切割
许 多 与载体连接导片段）
的原理．
基因工程操作程序
无表达产物
无表达产物
有表达产物
无表达产物
细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落， 检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产 物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。
练习
3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ A ）
A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞
33.(11分)生物学家通过基因工程培育出了能够通过乳房生 物反应器生产人的血清蛋白。 （1）在基因工程的操作中，目的基因是怎样获取的？ （2）“分子手术刀” _ _ ， （3）“分子缝合针” ， （4）“分子运输车” 。 （5）操作步骤：从人的____________获取目的基因；目 的基因与____________结合构建基因表达载体；在基因表 达载体中还应插入___________和终止子。然后把基因表 达载体导入牛的____________，通过发育形成的牛体细胞 含人的_________________，成熟的牛产的的奶中含有 ___________________，证明基因操作成功。 (6)人的基因在牛体内能表达,说明人和牛___________
(二)基因表达载体的构建
—— 核心
1.过程: 质粒
DNA分子 同一种限制酶处理
一个切口 两个黏性末端 DNA连接酶
两个切口 获得目的基因
重组DNA分子（重组质粒） 目的基因与运载体的结合过程，实际 上是不同来源的基因重组的过程。
原核细胞的基因结构 非编码区 编码区上游 启动子 编码区 非编码区 编码区下游 终止子
将目的基因导入 ——显微注射法 动物细胞 将目的基因导入 ——感受态细胞 微生物细胞
2020高考生物选修3现代生物科技专题1 1.2基因工程的基本操作程序
解析：B 过程是以 RNA 为模板合成 DNA 的反转录 过程，需要的酶 cDNA 为模板直接进行 PCR 扩增，该过程中所用酶的显著特点 是耐高温。
答案：(1)反转录酶 (2)大于 (3)DNA cDNA 耐 高温
5．基因工程常用的受体细胞都是动植物的体细胞。 (×)
6．基因工程是否成功需进行个体生物学水平上的鉴 定。(√)
要点一 目的基因的获取
1．有哪些方法可以获取目的基因，各有什么优缺 点？
2．PCR 扩增目的基因的原理是什么？
归纳提升 1．获取目的基 物 的 单 链 mRNA ―反―转―录―酶―催―化→ 单 链 互 补 DNAD―N―A聚――合―酶―催→化双链 cDNA 片段与―载―― 体―连→热变性后解链为单链，与 引物结合，然后在 Taq DNA 聚合酶的作用下进行延伸形 成 DNA。
3．化学合成目的基因：如果基因比较小，核苷酸序 列又已知，也可以利用 DNA 合成仪化学合成。
二、基因表达载体的构建
1．表达载体的组成：目的基因＋启动子＋终止子＋ 标记基因。
(4)PCR 扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退 火温度过高会破坏____________的碱基配对。退火温度的 设定与引物长度、碱基组成有关，长度相同但 ____________的引物需要设定更高的退火温度。
(5)如果 PCR 反应得不到任何扩增产物，则可以采取 的改进措施有________(填序号：①升高退火温度 ②降 低退火温度 ③重新设计引物)。
受体细胞
植物细胞 (体细胞)
导入方法
①农杆菌转化法：目的基因插入Ti质粒的TDNA→农杆菌→导入植物细胞→稳定维持和 表达 ②基因枪法：是单子叶植物中常用的一种基 因转化方法，但是成本较高 ③花粉管通道法：这是我国科学家独创的一 种方法，是一种十分简便经济的方法
基因工程的基本操作程序
1.2基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的获取（三种方法）1.从基因文库中获取：（1）分类：①基因组文库：含有某种生物的全部基因；② cDNA文库：含有某种生物的部分基因（2）基因文库的构建过程：略（课本P10；注意两种文库的区别）2.PCR技术扩增目的基因（1）概念：短时间内在体外大量复制DNA的技术。
（2）原理：DNA双链复制（3）条件：模板、Taq酶、引物（单链DNA片段，能与模板链互补配对）、4种脱氧核苷酸（4）过程：变性→退火→延伸3.通过DNA合成仪用化学方法人工合成：目的基因比较小，核苷酸序列已知第二步：基因表达载体的构建（核心步骤）1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在和表达，并且可以遗传给下一代2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因（+复制原点）（1）启动子（RNA聚合酶结合位点）：位于基因的首端，能驱动基因转录出mRNA（2）终止子：位于基因的尾端，终止转录①启动子和终止子位于DNA上；起始密码子和终止密码子位于mRNA上②真核生物的基因结构非编码区：不能转录出mRNA,但能调控基因的表达（含有启动子和终止子）基因外显子：转录出的mRNA能翻译出蛋白质编码区（原核生物的基因无外显子和内含子之分）（能转录形成mRNA）内含子：转录出的mRNA不能翻译出蛋白质（加工时被剪切）第三步：将目的基因导入受体细胞1.转化：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程2.常用的转化方法：①导入植物细胞：主要是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等农杆菌能感染双子叶植物和裸子植物（植物受损伤时，伤口处细胞分泌大量酚类化合物，吸引农杆菌移向这些细胞），农杆菌中Ti质粒的T-DNA能转移至受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上②导入动物细胞：最常用的方法：显微注射技术。
受体细胞：受精卵③导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的优点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少最常用的原核细胞是大肠杆菌，方法：感受态法（Ca2+处理法，增强细胞壁的通透性）第四步：目的基因的检测与鉴定目的基因是否成功导入：DNA分子杂交技术（用到基因探针）分子水平目的基因是否成功转录出mRNA：分子杂交技术（从细胞中提取mRNA，用检测基因探针与其杂交，观察是否形成杂交带）目的基因是否成功翻译成蛋白质：抗原—抗体杂交技术个体生物学水平鉴定：做抗虫、抗病接种实验；或将植物移栽至盐碱地；功能活性对比①基因探针：用放射性同位素标记含有目的基因的（单链）DNA片段②转基因实验成功的标志：成功表达出相关蛋白质和性状。
1.2基因工程的基本操作步骤
1.2 基因工程的基本操作程序
步骤
获取目的基因 构建表达载体 导入受体细胞 得到转基因生物 目的基因检测与鉴定
目的基因的获取
什么是目的基因？ 指编码蛋白质的结构基因。 如：苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因、植物的抗病基因、种 子的储藏蛋白基因、人的胰岛素基因、干扰素基因、与毒 物降解有关的基因等 获取目的基因的方法： ①从供体细胞的DNA中直接分离列人工合成基因（DNA合成仪 合成）。 ③PCR技术扩增目的基因
RNA模板 杂化双链
反转录酶 碱水解
单链DNA DNA聚合酶 S1核酸酶 试管内合成 双链DNA
整合 细胞内复制
（三）基因操作的基本步骤
• 步骤一：目的基因的提取 3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：
根据已知蛋白质的氨 蛋白质的氨基酸序列 推测 基酸序列，推测出相应的 信使RNA序列，然后按照 mRNA的核苷酸序列 碱基互补配对原则，推测 推测 出它的结构基因的核苷酸 结构基因的核苷酸序列 序列，再通过化学方法， 化学合成 以单核苷酸为原料合成目 目的基因 的基因。
DNA自动测序结果举例
遗传修饰动物模型的建立 及应用
一、转基因技术
转基因技术
采用基因转移技术使目的基因整合入受精 卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子 宫，使之发育成个体。 转基因——被导入的目的基因 转基因动物(transgenic animal)
——目的基因的受体动物
二、核转移技术
（三）基因操作的基本步骤
• 哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？
1）DNA序列自动测序仪： 对提取出来的基 因进行核苷酸序列 分析。
2）PCR技术： 使目的基因的片 段在短时间内成百 万倍地扩增。
（三）基因操作的基本步骤
步骤
获取目的基因 构建表达载体 导入受体细胞 得到转基因生物 目的基因检测与鉴定
目的基因的获取
什么是目的基因？ 指编码蛋白质的结构基因。 如：苏云金芽孢杆菌中的抗虫基因、植物的抗病基因、种 子的储藏蛋白基因、人的胰岛素基因、干扰素基因、与毒 物降解有关的基因等 获取目的基因的方法： ①从供体细胞的DNA中直接分离列人工合成基因（DNA合成仪 合成）。 ③PCR技术扩增目的基因
RNA模板 杂化双链
反转录酶 碱水解
单链DNA DNA聚合酶 S1核酸酶 试管内合成 双链DNA
整合 细胞内复制
（三）基因操作的基本步骤
• 步骤一：目的基因的提取 3）根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：
根据已知蛋白质的氨 蛋白质的氨基酸序列 推测 基酸序列，推测出相应的 信使RNA序列，然后按照 mRNA的核苷酸序列 碱基互补配对原则，推测 推测 出它的结构基因的核苷酸 结构基因的核苷酸序列 序列，再通过化学方法， 化学合成 以单核苷酸为原料合成目 目的基因 的基因。
DNA自动测序结果举例
遗传修饰动物模型的建立 及应用
一、转基因技术
转基因技术
采用基因转移技术使目的基因整合入受精 卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子 宫，使之发育成个体。 转基因——被导入的目的基因 转基因动物(transgenic animal)
——目的基因的受体动物
二、核转移技术
（三）基因操作的基本步骤
• 哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？
1）DNA序列自动测序仪： 对提取出来的基 因进行核苷酸序列 分析。
2）PCR技术： 使目的基因的片 段在短时间内成百 万倍地扩增。
（三）基因操作的基本步骤
专题Ⅰ基因工程之基本操作程序
目的基因
寻根问底
• 将目的基因直接导入受体细胞不是更简便 吗？如果这么做，结果会怎样？
• 没有进行表达载体的构建，这种方法针对 性差，完全靠运气，也无法确定什么基因 导入了受体植物。此法目前争议颇多，严 格来讲不算基因工程。
第三步：将目的基因导入受体细胞
• 一、转化 • 目的基因进入受体细胞内，并且在受体 细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。 • 二、导入方法 • 1、将目的基因导入植物细胞的方法 • （1）农杆菌转化法 （常用） • （2）基因枪法 • （3）花粉管通道法
PCR技术 相 原理 同 原料 点 条件 DNA复制
碱基互补配对 四种脱氧核苷酸
模板、ATP、酶 DNA在高温下 变性解旋 体外复制
解旋 方式
不 场所 同 酶、 点 引物 结果
解旋酶催化
细胞核内
热稳定DNA聚合酶 细胞内含有的DNA聚合酶， 需引物 不需引物 短时间内形成大 量DNA片段 形成整个DNA分子
第一步：目的基因的获取
• • • • • •
•
•
三、目的基因的获取方法 2、利用PCR 技术扩增目的基因 （5）PCR技术的过程： 变性：加热至90～95℃，目的基因DNA 受热变性 后解链为单链； 复性：温度恢复到55～60℃，引物与单链相应互 补序列结合； 延伸：加热至70～75℃，然后在Taq酶作用下进 行延伸 重复循环，目的基因则可成指数形式扩增(约为2n， 其中n为扩增循环的次数) 。 （6）PCR扩增仪
第一步：目的基因的获取
• • • • • • 三、目的基因的获取方法 3、用化学方法直接人工合成 （1）条件 基因比较小，核苷酸序列已知 （2）方法 DNA合成仪
第二步：基因表达载体的构建
寻根问底
• 将目的基因直接导入受体细胞不是更简便 吗？如果这么做，结果会怎样？
• 没有进行表达载体的构建，这种方法针对 性差，完全靠运气，也无法确定什么基因 导入了受体植物。此法目前争议颇多，严 格来讲不算基因工程。
第三步：将目的基因导入受体细胞
• 一、转化 • 目的基因进入受体细胞内，并且在受体 细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。 • 二、导入方法 • 1、将目的基因导入植物细胞的方法 • （1）农杆菌转化法 （常用） • （2）基因枪法 • （3）花粉管通道法
PCR技术 相 原理 同 原料 点 条件 DNA复制
碱基互补配对 四种脱氧核苷酸
模板、ATP、酶 DNA在高温下 变性解旋 体外复制
解旋 方式
不 场所 同 酶、 点 引物 结果
解旋酶催化
细胞核内
热稳定DNA聚合酶 细胞内含有的DNA聚合酶， 需引物 不需引物 短时间内形成大 量DNA片段 形成整个DNA分子
第一步：目的基因的获取
• • • • • •
•
•
三、目的基因的获取方法 2、利用PCR 技术扩增目的基因 （5）PCR技术的过程： 变性：加热至90～95℃，目的基因DNA 受热变性 后解链为单链； 复性：温度恢复到55～60℃，引物与单链相应互 补序列结合； 延伸：加热至70～75℃，然后在Taq酶作用下进 行延伸 重复循环，目的基因则可成指数形式扩增(约为2n， 其中n为扩增循环的次数) 。 （6）PCR扩增仪
第一步：目的基因的获取
• • • • • • 三、目的基因的获取方法 3、用化学方法直接人工合成 （1）条件 基因比较小，核苷酸序列已知 （2）方法 DNA合成仪
第二步：基因表达载体的构建
原创10：1.2 基因工程的基本操作程序
繁殖快、单细胞、遗传物质少、容易培养
用Ca2+处理细胞
转
感受态细胞
化
过 程
表达载体与感受态细胞混合
感受态细胞吸收DNA分子
典例分析
基因工程中科学家常采用细菌、酵母菌等微生物作为受体
细胞的主要原因是( B ) A．结构简单,操作方便
B．繁殖速度快
C．遗传物质含量少,易操作
D．性状稳定,变异少
目的基因的检测与鉴定
鉴
用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后
定
不出现中毒症状，说明未摄入
目的基因或摄入目的基因未表
达。如虫吃后中毒死亡，则说
明摄入了抗虫基因并得到表达。
典例分析 目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特
性，只有通过鉴定和检测才能知道。下列属于目的基因检测和鉴定
的是（ ） C
①检测受体细胞中是否有目的基基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群 体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因。基因组部分基因限制酶
连接在 载体上
导入 受体菌
基因组DNA DNA片段
运载体
受体菌
逆转录酶 DNA 聚合酶
目的基因
花粉管通道法
子房
将目的基因导入受体细胞
显微注射技术
将
目 的 基 因 导 入 动
提纯
操 含目 取 作 的基 受 程 因的 精
序 表达 卵
载体
显 微 注 射
胚 胎 早 期 培 养
胚 胎 移 植
新 性 状 动 物
物
细
胞
将目的基因导入受体细胞
将
目 原核生物特点
的
基
常用菌
因
导
入
微
原创12：1.2 基因工程的基本操作程序
信使RNA为模板，反转录成 互补的单链DNA，然后在酶 的作用下合成双链DNA，从 而获得所需的基因。
目的基因的mRNA
反转录
单链DNA(cDNA)
合成
双链DNA (即目的基因)
（2）化学合成法：根据已知的氨基酸序列合成DNA
根据已知蛋白质的氨 基酸序列，推测出相应的 信使RNA序列，然后按照碱 基互补配对原则，推测出 它的结构基因的核苷酸序 列，再通过化学方法，以 单核苷酸为原料合成目的 基因。
练习
1）以下说法正确的是
（C）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列
B、质粒是基因工程中唯一的运载体
C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制 酶切点，以便与外源基因连接
D、基因控制的性状都能在后代表现出来
2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是
A、能复制
（D）
B、有多个限制酶切点
C、具有标记基因
• 将目的基因导入受体细胞的原理
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳 定和表达的过程，称为转化。
（1）导入植物细胞 农杆菌转化法
农杆菌：感染双子叶植物和裸子植物
此外，还有基因枪法、花粉管通道法。
（2）导入动物细胞 显微注射法
（3）将目的基因导入微生物细胞
• 目的基因的提取方法从基因中获取目的基因人工合成目的基因
反转录法 化学合成法
利用聚合酶链式反应（PCR） 特异性地扩将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌 的群体中储存,各个受体菌分别含:
5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。
在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的
步骤是
目的基因的mRNA
反转录
单链DNA(cDNA)
合成
双链DNA (即目的基因)
（2）化学合成法：根据已知的氨基酸序列合成DNA
根据已知蛋白质的氨 基酸序列，推测出相应的 信使RNA序列，然后按照碱 基互补配对原则，推测出 它的结构基因的核苷酸序 列，再通过化学方法，以 单核苷酸为原料合成目的 基因。
练习
1）以下说法正确的是
（C）
A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列
B、质粒是基因工程中唯一的运载体
C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制 酶切点，以便与外源基因连接
D、基因控制的性状都能在后代表现出来
2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是
A、能复制
（D）
B、有多个限制酶切点
C、具有标记基因
• 将目的基因导入受体细胞的原理
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳 定和表达的过程，称为转化。
（1）导入植物细胞 农杆菌转化法
农杆菌：感染双子叶植物和裸子植物
此外，还有基因枪法、花粉管通道法。
（2）导入动物细胞 显微注射法
（3）将目的基因导入微生物细胞
• 目的基因的提取方法从基因中获取目的基因人工合成目的基因
反转录法 化学合成法
利用聚合酶链式反应（PCR） 特异性地扩将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌 的群体中储存,各个受体菌分别含:
5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。
在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的
步骤是
1.2_基因工程的基本操作程序 凯怿
检 测
方法——
DNA分子杂交
湖南长郡卫星远程学校
制作 03
2011年下学期
a
变性
DNA
DNA杂交
b c
加探针
（如检测SARS病毒等） 附着在膜上 硝化纤维素
报告基因(含荧光素分子)
d
四、目的基因的检测与鉴定
①导入检测： 目的基因是否导入受体细胞
检 测
方法——
DNA分子杂交
②表达检测
湖南长郡卫星远程学校
聚合酶链式反应 ① 概念：PCR全称为_______________，是一项 体外 特定DNA片段 在生物____复制___________的核酸合成技术。 DNA复制 ②原理：__________
已知基因的核苷酸序列 ③前提条件：_______________________； 模板DNA DNA引物 原料：___________、___________ 、 四种脱氧核苷酸 热稳定DNA聚合酶 __________________、 ________________。 2n 指数 ④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循
(%)
温度(℃)
人工合成 (基因比较小)
DNA合成仪
一 目的基因的获取 2、基因工程中有什么PCR C 人工合成
二 基因表达载体的构建
Байду номын сангаас
二 基因表达载体的构建
基因表达载体的组成：
a、目的基因 b、启动子 c、终止子 d、标记基因
一 目的基因的获取 2、基因工程中有什么节P10 上
CDNA合成过程
原核细胞的基因结构
非编码区
编码区上游 启动子 与RNA聚合酶结合位点 编码区： 能转录，编码蛋白质 非编码区： 不编码蛋白质,能调控遗传信息表达
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将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受 体菌的群体中储存,各个受体菌 用限制酶剪 去多余部分
限制酶 目的基因
获取目的基因的常用方法: （1）从基因中获取 （2）利用PCR技术扩增 （3）（如cDNA）提取受体生 物全部DNA
适当限制 酶切割 用同位素标记的
DNA片段
目的基因片段杂交
显 出 杂交带
（表明目的基因已插入）
2. 检测目的基因是否转录出了mRNA
提取受体生 物的mRNA
用同位素标记的 目的基因片段杂交
显 出 杂交带
（表明目的基因已转录出了mRNA）
检测DNA利用的是DNA与DNA杂交，检测mRNA 利用的是DNA与mRNA杂交。
原核细胞的基因结构(补充内容）
非编码区 编码区上游 启动子 编码区 非编码区 编码区下游 终止子
与RNA聚合酶结合位点
原核 细胞 的 基因 结构
编码区 ：编码蛋白质 ,连续不间断
①不编码蛋白质
非编码区 ②调控遗传信息表达,上
游有启动子，下游有终止子
真核细胞的基因结构（补充内容）
非编码区
编码区
非编码区
（2）基因枪法
基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力， 将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目 的基因与其整合并表达的方法。
（3）花粉通道法
植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。 花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合 前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基 因借助花A
反转录 cDNA (互补DNA） DNA聚合酶 反转录酶
mRNA
cDNA
基因 நூலகம்目的基因的有关信息。
如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质 等特性。
2、将目的基因导入动物细胞 方法: 显微注射技术 操作程序:
提纯含目的基 因表达载体 取受精卵 显微注射 移植到子宫 受精卵发育 新性状动物
3、将目的基因导入微生物细胞
常用法：Ca2+处理 常用菌：大肠杆菌 微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 过程：
Ca2+处理
大肠杆菌
感受态 细胞
（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因 的启动子才能比较导入受体生物中无法转录； （3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其 他调控元件，如增强子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么 部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基 因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。
胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以 来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取， 100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量 之低和价格之高可想而知。 假如让你用基因工程的方法使大肠杆菌 生产出人的胰岛素，想一想，如何设计？
3、基因表达载体的组成：
a、目的基因
b、启动子 c、终止子 位于基因的首端,是 mRNA结合位点 位于基因的末端,终 止转录
d、标记基因 检测目的基因是否导入受体细胞
它们有什么作用？
三、将目的基因导入受体细胞
• 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、 酵母菌和动植物细胞等。 • 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
表达载体 与感受态 细胞混合
感受态细 胞吸收 DNA
四、目的基因的检测与鉴定
目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中， 是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达， 只有通过检测、鉴定才能得知。 常用的检测手段主要从分子水平和个体水平 进行。
（一）分子水平
分子杂交技术
1. 检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因
PCR——聚合酶链式反应 是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合 成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。
（2）利用PCR技术扩增目的基因 PCR：即聚合酶链式反应。是一项生物体外复制
特定DNA片段的核酸合成技术。
• 原理： DNA复制 • 前提： 一段已知目的基因的核苷酸序列 • 原料： 模板DNA；DNA引物；四种脱氧
• 方式：
核苷酸；热稳定DNA聚合酶 （Taq酶）；离子
以指数方式扩增，即2n （n为扩增循环的次数）
PCR扩增仪
过程：变性、退火、延伸三步曲
变性：加热至90～95℃
双链DNA解链成为单链DNA
退火：冷却至55～60℃
部分引物与模板的单链DNA 的特定互补部位相配对结合
变性
延伸
延伸：加热至70～75℃
1、将目的基因导入植物细胞 特点: （1）农杆菌 转化法
能感染双子叶植物和祼子植物,对 单子叶植物无感染能力 Ti质粒的T—DNA可转移至受体细 胞并整合到其染色体上
转化过程:
表 植 农 Ti质粒 构建 达 转入 插入 植物细胞 表达 新 导入 物 杆 性 染色体DNA 载 细 菌 状 目的基因 体 胞基因组文 库与部分 基因 的关系基因如何构建？
将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶， 将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然后，将这些DNA 片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个 受体菌都含有了一段不同的DNA片段。也就是说，这个群体 包含了这种生物的所有基因，这样就构建成了生物的基因组文 库。这种方法称——直接分离法（或鸟枪法）
编码区上游
启动子
编码区下游
终止子
与RNA聚合 酶结合位点 真核 细胞 的 基因 结构 编码区
外显子
内含子
外显子：能编码蛋白质的序列
内含子：不能编码蛋白质的序列
非编码区 ：有调控作用,上游有启动子，下 游有终止子
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
原核细胞 真核细胞 编码区是间隔的、 _____的 不连续
两个切口 获得目的基因
表 DNA连接酶 达 载 体
2、基因表达载体的作用
a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代 b、同时使目的基因能表达和发挥作用
思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可
以完成任务吗？为什么？
不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用， 还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。 必须构建上述元件的主要理由是：
以目的基因为模板，合成互 补的新DNA链
退火
利用PCR技术扩增目的基因
（3） 人工合成 ——根据已知的氨基酸序列合成DNA
蛋白质的氨基酸序列 推测 mRNA的核苷酸序列 推测 结构基因的核苷酸序列 化学合成 目的基因
二、基因表达载体的构建
1.过程:
质粒
目的基因
同一种 限制酶处理
一个切口 两个黏性末端
如果用某种生物发育的某个时期的mRNA 反转录产生的 多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一 个受体菌群中，那么，这DNA的构建①鸟枪法：(直接分离法)
用 限 制 酶 切 成 许 多 片 段
该法最大缺点：带有很大盲目性，工作量大，成功率低。
不同点
编码区是 _____的 连续
编码区 都由能够编码蛋白质的______和具有 非编码 相同点 调控作用的______区组成的
基因操作的基本步骤
一、目的基因的获取
——将需要的基因从供体 生物的细胞内提取出来。 目前被较广泛提取使 用的目的基因有：苏云金 杆菌抗虫基因、人胰岛素 基因、人干扰素基因、种 子贮藏蛋白基因、植物抗 病基因等。
3. 检测目的基因是否翻译出蛋白质 抗原—抗体杂交技术
提取受体生 物的蛋白质
与相应抗体杂交
显 出 杂交带
（表明目的基因已形成蛋白质产品）
（二）个体水平
例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状， 说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃 后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。
尝试设计
限制酶 目的基因
获取目的基因的常用方法: （1）从基因中获取 （2）利用PCR技术扩增 （3）（如cDNA）提取受体生 物全部DNA
适当限制 酶切割 用同位素标记的
DNA片段
目的基因片段杂交
显 出 杂交带
（表明目的基因已插入）
2. 检测目的基因是否转录出了mRNA
提取受体生 物的mRNA
用同位素标记的 目的基因片段杂交
显 出 杂交带
（表明目的基因已转录出了mRNA）
检测DNA利用的是DNA与DNA杂交，检测mRNA 利用的是DNA与mRNA杂交。
原核细胞的基因结构(补充内容）
非编码区 编码区上游 启动子 编码区 非编码区 编码区下游 终止子
与RNA聚合酶结合位点
原核 细胞 的 基因 结构
编码区 ：编码蛋白质 ,连续不间断
①不编码蛋白质
非编码区 ②调控遗传信息表达,上
游有启动子，下游有终止子
真核细胞的基因结构（补充内容）
非编码区
编码区
非编码区
（2）基因枪法
基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力， 将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目 的基因与其整合并表达的方法。
（3）花粉通道法
植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。 花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合 前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基 因借助花A
反转录 cDNA (互补DNA） DNA聚合酶 反转录酶
mRNA
cDNA
基因 நூலகம்目的基因的有关信息。
如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质 等特性。
2、将目的基因导入动物细胞 方法: 显微注射技术 操作程序:
提纯含目的基 因表达载体 取受精卵 显微注射 移植到子宫 受精卵发育 新性状动物
3、将目的基因导入微生物细胞
常用法：Ca2+处理 常用菌：大肠杆菌 微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少 过程：
Ca2+处理
大肠杆菌
感受态 细胞
（1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因 的启动子才能比较导入受体生物中无法转录； （3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其 他调控元件，如增强子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么 部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基 因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。
胰岛素是治疗糖尿病的特效药，长期以 来只能依靠从猪、牛等动物的胰腺中提取， 100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量 之低和价格之高可想而知。 假如让你用基因工程的方法使大肠杆菌 生产出人的胰岛素，想一想，如何设计？
3、基因表达载体的组成：
a、目的基因
b、启动子 c、终止子 位于基因的首端,是 mRNA结合位点 位于基因的末端,终 止转录
d、标记基因 检测目的基因是否导入受体细胞
它们有什么作用？
三、将目的基因导入受体细胞
• 常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、 酵母菌和动植物细胞等。 • 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
表达载体 与感受态 细胞混合
感受态细 胞吸收 DNA
四、目的基因的检测与鉴定
目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中， 是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达， 只有通过检测、鉴定才能得知。 常用的检测手段主要从分子水平和个体水平 进行。
（一）分子水平
分子杂交技术
1. 检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因
PCR——聚合酶链式反应 是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合 成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。
（2）利用PCR技术扩增目的基因 PCR：即聚合酶链式反应。是一项生物体外复制
特定DNA片段的核酸合成技术。
• 原理： DNA复制 • 前提： 一段已知目的基因的核苷酸序列 • 原料： 模板DNA；DNA引物；四种脱氧
• 方式：
核苷酸；热稳定DNA聚合酶 （Taq酶）；离子
以指数方式扩增，即2n （n为扩增循环的次数）
PCR扩增仪
过程：变性、退火、延伸三步曲
变性：加热至90～95℃
双链DNA解链成为单链DNA
退火：冷却至55～60℃
部分引物与模板的单链DNA 的特定互补部位相配对结合
变性
延伸
延伸：加热至70～75℃
1、将目的基因导入植物细胞 特点: （1）农杆菌 转化法
能感染双子叶植物和祼子植物,对 单子叶植物无感染能力 Ti质粒的T—DNA可转移至受体细 胞并整合到其染色体上
转化过程:
表 植 农 Ti质粒 构建 达 转入 插入 植物细胞 表达 新 导入 物 杆 性 染色体DNA 载 细 菌 状 目的基因 体 胞基因组文 库与部分 基因 的关系基因如何构建？
将某种生物体内的DNA全部提取出来，选用适当的限制酶， 将DNA切成一定范围大小的DNA片段，然后，将这些DNA 片段分别与载体连接起来，导入受体菌的群体中储存，每个 受体菌都含有了一段不同的DNA片段。也就是说，这个群体 包含了这种生物的所有基因，这样就构建成了生物的基因组文 库。这种方法称——直接分离法（或鸟枪法）
编码区上游
启动子
编码区下游
终止子
与RNA聚合 酶结合位点 真核 细胞 的 基因 结构 编码区
外显子
内含子
外显子：能编码蛋白质的序列
内含子：不能编码蛋白质的序列
非编码区 ：有调控作用,上游有启动子，下 游有终止子
原核细胞与真核细胞的基因结构比较
原核细胞 真核细胞 编码区是间隔的、 _____的 不连续
两个切口 获得目的基因
表 DNA连接酶 达 载 体
2、基因表达载体的作用
a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代 b、同时使目的基因能表达和发挥作用
思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可
以完成任务吗？为什么？
不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用， 还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。 必须构建上述元件的主要理由是：
以目的基因为模板，合成互 补的新DNA链
退火
利用PCR技术扩增目的基因
（3） 人工合成 ——根据已知的氨基酸序列合成DNA
蛋白质的氨基酸序列 推测 mRNA的核苷酸序列 推测 结构基因的核苷酸序列 化学合成 目的基因
二、基因表达载体的构建
1.过程:
质粒
目的基因
同一种 限制酶处理
一个切口 两个黏性末端
如果用某种生物发育的某个时期的mRNA 反转录产生的 多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一 个受体菌群中，那么，这DNA的构建①鸟枪法：(直接分离法)
用 限 制 酶 切 成 许 多 片 段
该法最大缺点：带有很大盲目性，工作量大，成功率低。
不同点
编码区是 _____的 连续
编码区 都由能够编码蛋白质的______和具有 非编码 相同点 调控作用的______区组成的
基因操作的基本步骤
一、目的基因的获取
——将需要的基因从供体 生物的细胞内提取出来。 目前被较广泛提取使 用的目的基因有：苏云金 杆菌抗虫基因、人胰岛素 基因、人干扰素基因、种 子贮藏蛋白基因、植物抗 病基因等。
3. 检测目的基因是否翻译出蛋白质 抗原—抗体杂交技术
提取受体生 物的蛋白质
与相应抗体杂交
显 出 杂交带
（表明目的基因已形成蛋白质产品）
（二）个体水平
例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状， 说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃 后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。
尝试设计