【备课精选】江苏省高考生物专题复习 蛋白质的分离与纯化课件 新人教版
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蛋白质的分离纯化.ppt
logMr
三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 法测定相对分子质量
聚丙烯酰胺凝胶电泳，（简称PAGE），也称 圆盘电泳，它以聚丙烯酰胺凝胶（单体丙烯 酰胺Arc和交联剂甲叉双丙烯酰胺Bis共聚而 成）为支持物 。
蛋白质颗粒在各种介质中电泳时，它的迁移率
决定于它所带的电荷以及分子大小和形状(电 荷效应、分子筛效应)。
v =沉降速度（dx/dt）
s
=
—ω—v2x——
ω=离心机转子角速度（弧度/s） x =蛋白质界面中点与转子中心的
距离（cm）
沉降系数的单位常用S，1S=1×10-13（s）
蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系
M = —D—（—1R－—TsV—ρ）—
R—气体常数（8.314×107ergs·mol -1 ·度-1） T—绝对温度 D—扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机 转速很快，则忽略不计） V—蛋白质的微分比容（m3·g-1） ρ—溶剂密度（20℃，g·ml-1） s—沉降系数
二、凝胶过滤法测定相对分子质量
凝胶过滤原理
分子筛色谱 （凝胶过滤）
利用Andrews的实验经验式：
logMr = a/b—Ve/bVo
Ve（elution volume）为某一溶质组分的洗脱 体积。它是自加样品开始到该组分的洗脱峰 （峰顶）出现时所流出的体积。
V0 (outer volume)为外水体积，即存在于柱床 中凝胶珠外孔隙的水相体积。测定出不能被 凝胶滞留的大分子溶质如蓝色葡聚糖—2000 的洗脱体积可以决定V0。
在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质 胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白 质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不 可能再重新溶解于水。
由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性 质的变化，所以又称为变性沉淀。
蛋白质的分离和纯化精品课件
( A)
• A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次 序，降低分离效果
• B、气泡阻碍蛋白质的运动 • C、气泡与蛋白质发生化学反应 • D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密
最新 PPT
34
2、样品的加入和洗脱的操作不正确的是 A
• A 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱 内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面
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40
4、在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷
酸缓冲液处理的目的是 A.防止血红蛋白被O2氧化
( D)
B.血红蛋白是一种碱性物质，需要酸中和
C.磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程
D.让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其 结构和功能
最新 PPT
41
5、下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的
最新 PPT
50cm高
32
样品加入与洗脱
①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到 与凝胶面平齐，关闭出口。
②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶 端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样， 同时注意不要破坏凝胶面。
③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝 胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。
• B.采用透析法使蛋白质与其他小分子化合 物分离开来
• C.离心沉降法通过控制离心速率使分子大 小、密度不同的蛋白质分离
• D.蛋白质在电场中可以向与其自身所带电 荷相同的电极方向移动
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18
三、血红蛋白的提取和分离
1.样品处理 2.粗分离 3.纯化 4.纯度鉴定
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19
1.样品处理
叙述中，正确的是 ( D )
A.用蒸馏水进行红细胞的洗涤，其目的是去 除细胞表面杂蛋白
• A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次 序，降低分离效果
• B、气泡阻碍蛋白质的运动 • C、气泡与蛋白质发生化学反应 • D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密
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2、样品的加入和洗脱的操作不正确的是 A
• A 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱 内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面
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4、在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷
酸缓冲液处理的目的是 A.防止血红蛋白被O2氧化
( D)
B.血红蛋白是一种碱性物质，需要酸中和
C.磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程
D.让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其 结构和功能
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5、下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的
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50cm高
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样品加入与洗脱
①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到 与凝胶面平齐，关闭出口。
②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶 端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样， 同时注意不要破坏凝胶面。
③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝 胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。
• B.采用透析法使蛋白质与其他小分子化合 物分离开来
• C.离心沉降法通过控制离心速率使分子大 小、密度不同的蛋白质分离
• D.蛋白质在电场中可以向与其自身所带电 荷相同的电极方向移动
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三、血红蛋白的提取和分离
1.样品处理 2.粗分离 3.纯化 4.纯度鉴定
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1.样品处理
叙述中，正确的是 ( D )
A.用蒸馏水进行红细胞的洗涤，其目的是去 除细胞表面杂蛋白
蛋白的分离纯化详解课件PPT
的分离。 2021/3/10
23
电泳（electrophoresis）
• 带电粒子在电场中向与自身电荷相反的电 极移动的现象称为电泳。蛋白质在电场中 泳动时，受到电场力和摩擦力两种方向相 反的力的作用
• 蛋白质因带电、大小和形状不同而在直流 电场中泳动速度不同。
2021/3/10
24
常用蛋白质电泳技 术
2021/3/10
20
3. 亲和层析
• 以样品的生物活性为依据的分离方法。生物分子 的特点是有专一的活性，如酶与底物的结合，抗 原与抗体，激素与受体，糖与凝集素……等。
• 将上述作用体系的一方连接到层析基质上，使之 固定化，就有可能分离纯化专一作用的另一方。
2021/3/10
21
各种用于抗体识别的标记
15
蛋白质的纯化
• 粗分离只是使蛋白质得到浓缩和初步分离 纯化，多数情况下还要根据蛋白质分子大 小、分子形状、分子表面特征或分子带电 状况进一步纯化，这就是蛋白质细分级。
• 常用的实验技术：层析（离子交换等）和 电泳
2021/3/10
16
1. 离子交换层析
固相支持物：纤维素、琼脂糖、葡聚糖等高分子聚 合物
• 方法：尿素变性复性从包涵体中纯 化原核表达蛋白
2021/3/10
9
二、蛋白质的分离纯化
2021/3/10
10
分离纯化流程
原材料的获取
预处理 （沉淀）
纯化
细胞破碎
研磨 超声 渗透压 酶 ……
2021/3/10
蛋白溶解
酸、碱 醇 去垢剂 尿素 ……
粗提
沉淀 相分离 分子筛 ……
精提
各种色谱 电泳分离 差速离心 ……
《蛋白质分离、纯化》PPT课件
聚丙烯酰胺凝胶（ Bio-GelP）
整理ppt
15
带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层整析理ppt过程示意图
16
凝胶的前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸 泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上 层悬浮物及蒸馏水。
碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能 相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
整理ppt
43
蛋白质鉴定
蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：
➢蛋白质纯度鉴定 ➢蛋白质分子量及等电点测定 ➢蛋白质氨基酸组成及顺序分析 ➢蛋白质结晶与结构分析 ➢蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴
定 ➢蛋白质生物活性及功能测定
整理ppt
44
• （一）蛋白质纯度鉴定：
目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法， 电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋 白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比 来表示目标蛋白的纯度。
整理ppt
12
一、凝胶层析
• 又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天 然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不 同规格。
整理ppt
13
凝胶层析
• 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物 质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
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带网孔的 葡聚糖珠
小分子进入 葡聚糖珠内
大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出
凝胶过滤层整析理ppt过程示意图
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凝胶的前处理
溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸 泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上 层悬浮物及蒸馏水。
碱洗：用0.5 M NaOH 溶液浸泡半个小时，然 后用蒸馏水洗至中性。
a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能 相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.010.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、 多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。
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蛋白质鉴定
蛋白质鉴定主要包括以下几个方面：
➢蛋白质纯度鉴定 ➢蛋白质分子量及等电点测定 ➢蛋白质氨基酸组成及顺序分析 ➢蛋白质结晶与结构分析 ➢蛋白质免疫印迹（Western-blotting）鉴
定 ➢蛋白质生物活性及功能测定
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• （一）蛋白质纯度鉴定：
目前最常用的蛋白质纯度鉴定为电泳法， 电泳后的凝胶经过染色脱色后，用目标蛋 白质条带占整个泳道蛋白质条带的百分比 来表示目标蛋白的纯度。
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一、凝胶层析
• 又叫分子筛层析。
分子筛是具有三维空间网状结构的物质，有天 然的，也可人工合成。根据网孔不同可制成不 同规格。
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凝胶层析
• 原理： 1、分子量大的物质不能进入凝胶粒子内部，随洗脱 液从凝胶粒子之间的空隙挤落下来，所以大分子物 质迁移速度快； 2、小分子物质要通过凝胶网孔进入凝胶粒子内部， 所以小分子物质迁移速度慢。
蛋白质分离纯化技术ppt课件
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10
紫外分光光度法测定蛋白质含量的 实验原理
1.蛋白质分子中，酪氨酸和色氨酸残基含有共轭双键， 使蛋白质具有吸收近紫外光的性质。吸收高峰在280nm 处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。
2.蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。 利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓 度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
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24
考马斯亮兰G-250
实验原理：考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白 质结合，使染料的最大吸收峰的位置(max),由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为， 染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸和赖
氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。 在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
.
6
测定分两步：
① 用沸浓硫酸消化，并以硫酸铜为催化剂，使碳、氢分 别以二氧化碳及水蒸汽形态逸去，而氮转为铵盐。此 过程需时较长，可达数小时。
② 加碱，并将氨自碱液中蒸至标准酸液中，测定中和氨 所消耗的酸量，计算出样品中含氮量，再乘以6．25 （经验平均值），则得蛋白质含量。
.
7
反应：以甘氨酸为例
测定时，将待测蛋白质溶液倒入石英比色皿中，用配制蛋白质溶液的溶 剂（水或缓冲液）作空白对照，在紫外分光度计上直接读取280nm的吸光度 值A280。蛋白质浓度可控制在0.1～ 1.0mg/ml左右。通常用1cm光径的标准 石英比色皿，盛有浓度为1mg/ml的蛋白质溶液时，A280约为1.0左右。由此 可立即计算出蛋白质的大致浓度。
（二）Folin－酚试剂法（Lowry法）
实验原理:蛋白质中的肽键在碱性条件下与Cu2+反 应，生产紫红色蛋白质-Cu2+复合物，这一复合物 中的氨基酸残基（主要是酪氨酸、色氨酸、半胱 氨酸）还原Folin—酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸 盐，产生钼兰和钨兰复合物的深兰色（745750nm），颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。
蛋白质的分离与纯课件
蛋白质的分离与纯化
纯化目的: 研究其结构、组成、性质和功能等。 纯化方法的依据：蛋白质的基本性质
1）溶解性：盐析等。 2）分子大小和形状：凝胶过滤（分子筛过滤）， 透析，超离心，超滤等。 3）电荷（酸碱性质）：电泳，离子交换层析，等 电聚焦等。 4）吸附性质：吸附层析，疏水互作层析。 5）特异结合亲和性：亲和层析。
• 有的方法利用了蛋白质几个方面的性质。 • 一般要连续采用多种方法才能达到纯化的目的。
Selection of protein source 蛋白质原料的 选择
• 选含“目的”蛋白多的原料。 • 选来源广、容易得到的原料。 • 用重组DNA技术（recombinant DNA technique）
（二）有机溶剂沉淀蛋白质：
• 凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，
如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀 蛋白质。
• 沉淀原理是：① 脱水作用；② 使水的
介电常数降低，蛋白质溶解度降低。
• 为了防止蛋白质在分离过程中发生变性，
有机溶剂浓度不能太高(30%-50%)，而且
需要在低温条件下进行。
（三）层析：
反过来可根据某物质的Ve或Ve/V0推测出其分子 量。
1）制作标准曲线 2）待测样品过柱或 与标准物质混合过柱。
测定其Ve和V0值。 查标准曲线。
Ion exchange chromatography 离子交换层析（2）
• 基本原理： 根据物质的电离性质进行交换，然后用 适当的洗脱液进行洗脱。由于各种被分离的物质离 子的净电荷量不同，与载体上与可解离基团的结合 力大小不同，所以被先后洗脱下来。
SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰凝胶电泳（1）
• SDS-PAGE ：利用SDS处理蛋白质后，在变性条件下进 行的聚丙烯酰凝胶电泳。即“变性”电泳。
纯化目的: 研究其结构、组成、性质和功能等。 纯化方法的依据：蛋白质的基本性质
1）溶解性：盐析等。 2）分子大小和形状：凝胶过滤（分子筛过滤）， 透析，超离心，超滤等。 3）电荷（酸碱性质）：电泳，离子交换层析，等 电聚焦等。 4）吸附性质：吸附层析，疏水互作层析。 5）特异结合亲和性：亲和层析。
• 有的方法利用了蛋白质几个方面的性质。 • 一般要连续采用多种方法才能达到纯化的目的。
Selection of protein source 蛋白质原料的 选择
• 选含“目的”蛋白多的原料。 • 选来源广、容易得到的原料。 • 用重组DNA技术（recombinant DNA technique）
（二）有机溶剂沉淀蛋白质：
• 凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，
如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀 蛋白质。
• 沉淀原理是：① 脱水作用；② 使水的
介电常数降低，蛋白质溶解度降低。
• 为了防止蛋白质在分离过程中发生变性，
有机溶剂浓度不能太高(30%-50%)，而且
需要在低温条件下进行。
（三）层析：
反过来可根据某物质的Ve或Ve/V0推测出其分子 量。
1）制作标准曲线 2）待测样品过柱或 与标准物质混合过柱。
测定其Ve和V0值。 查标准曲线。
Ion exchange chromatography 离子交换层析（2）
• 基本原理： 根据物质的电离性质进行交换，然后用 适当的洗脱液进行洗脱。由于各种被分离的物质离 子的净电荷量不同，与载体上与可解离基团的结合 力大小不同，所以被先后洗脱下来。
SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰凝胶电泳（1）
• SDS-PAGE ：利用SDS处理蛋白质后，在变性条件下进 行的聚丙烯酰凝胶电泳。即“变性”电泳。
第六章-蛋白质的分离、纯化PPT课件
a． 分散相质点1-100nm b． 分散相质点带有同种电荷，互相
排斥不聚成颗粒而沉淀 c． 分散相的质点能与溶剂形成溶剂
化层
2021/3/12
16
蛋白质：
a. 胶体质点的范围
c． 丁达尔效应 d． 布朗运动 e． 不能透过半透膜
2021/3/12
17
2．蛋白质的沉淀
2021/3/12
18
沉淀蛋白质的方法：
因此，所有SDS-蛋白质复合物， 电泳时均以同样的电荷/蛋白质比向正极 移动。
② 改变了蛋白质单体分子的构象。
2021/3/12
8
• SDS-蛋白质在水溶液中长椭圆棒，短轴 直径均为1.8nm,长轴长度则随蛋白质的 分子量而成正比例地变化。 电泳迁移率μ与多肽链分子量的对数有 下列关系
2021/3/12
① 盐析法：
中性盐（NH4SO4，NaSO4，Nacl等）－→ 蛋白质脱去水化层
优点：不引起蛋白质变性 ② 有机溶剂沉淀法：
极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）－→ 脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点 间的相互作用
条件：低温操作 缩短时间
2021/3/12
பைடு நூலகம்
19
③ 重金属盐沉淀法
当溶液pH>pI,蛋白质颗粒带负电荷, 易与重金属离子 (Hg2+,Pb2+,Cu2+.Ag+等)－→生成沉淀
∵在蛋白质分子中受到邻近电荷的影响 F．蛋白质可看作一个多价离子
2021/3/12
3
• 蛋白质等电点--在某一pH值，蛋白质所 带的正电荷与负电荷恰好相等，净电荷 为零。这一pH称为蛋白质等电点
2021/3/12
4
• 等离子点--没有其他盐类干扰时，蛋白质 质子供体基团界离出来的质子数与质子 受体基团结合的质子数相等时的pH称等 离子点。特征常数。
排斥不聚成颗粒而沉淀 c． 分散相的质点能与溶剂形成溶剂
化层
2021/3/12
16
蛋白质：
a. 胶体质点的范围
c． 丁达尔效应 d． 布朗运动 e． 不能透过半透膜
2021/3/12
17
2．蛋白质的沉淀
2021/3/12
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沉淀蛋白质的方法：
因此，所有SDS-蛋白质复合物， 电泳时均以同样的电荷/蛋白质比向正极 移动。
② 改变了蛋白质单体分子的构象。
2021/3/12
8
• SDS-蛋白质在水溶液中长椭圆棒，短轴 直径均为1.8nm,长轴长度则随蛋白质的 分子量而成正比例地变化。 电泳迁移率μ与多肽链分子量的对数有 下列关系
2021/3/12
① 盐析法：
中性盐（NH4SO4，NaSO4，Nacl等）－→ 蛋白质脱去水化层
优点：不引起蛋白质变性 ② 有机溶剂沉淀法：
极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）－→ 脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点 间的相互作用
条件：低温操作 缩短时间
2021/3/12
பைடு நூலகம்
19
③ 重金属盐沉淀法
当溶液pH>pI,蛋白质颗粒带负电荷, 易与重金属离子 (Hg2+,Pb2+,Cu2+.Ag+等)－→生成沉淀
∵在蛋白质分子中受到邻近电荷的影响 F．蛋白质可看作一个多价离子
2021/3/12
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• 蛋白质等电点--在某一pH值，蛋白质所 带的正电荷与负电荷恰好相等，净电荷 为零。这一pH称为蛋白质等电点
2021/3/12
4
• 等离子点--没有其他盐类干扰时，蛋白质 质子供体基团界离出来的质子数与质子 受体基团结合的质子数相等时的pH称等 离子点。特征常数。