于桉-磁性复合微粒在mRNA纯化中的应用(西北大学硕士学位答辩PPT)2007.6

（一） PG-Mag的制备及oligo(dT)20的偶联 （二） 应用PG-Mag从动植物组织总RNA中分离 纯化mRNA
(一) PG-Mag的制备及oligo(dT)20的偶联
OR RO Si OR OH OH OH 磁流体 S O Si O O Si NH C NH S O O Si NH C NH NH C NH S N C S N C S N C S NH2 O Si NH2 O Si O O Si NH2 O O Si NH2 氨基磁粒 S NH C NH O S O Si NH C NH S O O Si NH C NH S H NH CN H NH CN S H NH CN S NH2 S C N N C S (PDITC)
二 应用PG-Mag从动物组织中直 接纯化mRNA
反应步骤：
1 2 3 4 5 6 7 液氮研磨动物组织 加入裂解液匀浆、裂解组织 离心匀浆液，弃去沉淀 预处理磁性微粒 将匀浆上清液加入磁性微粒，杂交反应 清洗非特异性吸附 洗脱mRNA
动物组织mRNA直接提取结果
动物组织 （大鼠）
肝脏 肾脏 组织用量 52 mg 51 mg mRNA 1.16 μg 0.48 μg OD260/OD280 1.95 1.87
致谢
衷心的感谢崔亚丽教授对我三年来的指导和帮助，她 严谨缜密的思维、一丝不苟的工作作风深深感染了我，她 的对我的严格要求和在学习工作中谆谆善诱让我终生难忘。 衷心的感谢陈超教授创立了国家微检测中心，让我们 有了如此优良的实验平台，他睿智的思想和敏锐、深刻的 洞察力极大的启发了我。 衷心的感谢磁性材料组的所有研究生和员工，与你们 在一起的一千多个日夜是我人生美好和宝贵的财富。
PG Mag
偶 联有 oligo dT的 磁 粒
oligo(dT)20 偶联步骤：
1 2 3 4 5 磁性微粒的预处理 向磁性复合微粒表面固定 oligo(dT)20 非特异性吸附的oligo(dT)20的清洗 封闭 非特异性吸附的封闭剂的清洗
反应条件的确定：
一 偶联条件的确立
1 oligo(dT)20偶联缓冲液的确定 2 oligo(dT)20偶联时间的确定 3 磁性复合微粒封闭条件的确定
Harisinghani, N. Engl. J. Med, 2003
mRNA纯化发展现状
中心法则： DNA RNA
mRNA
Protein
mRNA纯化方法
oligo(dT)－纤维素柱 磁性复合微粒
优点
价格低廉 操作简单、耗时短 （25 min），获得 mRNA纯度高
缺点
操作复杂、易污染 耗时较长（40 min）
磁性复合微粒在mRNA纯化中的应用
专业：生物化学与分子生物学 答辩人： 于桉 导师： 崔亚丽
磁性复合微粒的概念及发展现状
无机/有机磁性复合微粒
（磁性材料+天然高分子、有机 合成高分子 ）
磁性复合微粒
磁性聚苯乙烯微粒
磁性聚甲 基丙烯酸甲酯微粒
无机/无机磁性复合微粒
（磁性材料+其它金属或无机物）
Fe3O4/Au金磁微粒 Fe2O3/Si 磁性微粒
三 链亲和素-金磁性微粒从总RNA中 纯化mRNA初步探索
磁性粒子聚集体
Biotin-oligo(dT)20
链亲和素
纳米金粒子
反应步骤：
1 2 3 4 5 动植物组织总RNA的提取 磁性微粒的预处理 杂交反应 非特异性吸附RNA的清洗 mRNA的洗脱
SA-Mag和 PG-Mag 从大鼠肝组织总 RNA中纯化mRNA
价格昂贵
mRNA纯化方法对比
oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA
磁性复合微粒纯化mRNA
内容提要
一 应用PG-Mag从总RNA中纯化mRNA 二 应用PG-Mag从组织中直接纯化mRNA初步 探索 三 应用链亲和素-金磁性微粒从总RNA中纯 化mRNA初步探索
一 应用PG-Mag从总RNA中纯化mRNA
1.83
1.92 1.91
（二） 应用PG-Mag从动植物组织总 RNA中分离纯化mRNA
mRNA提取步骤：
1 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 3 4 5 动植物组织总RNA的提取 磁性微粒的预处理 杂交反应 非特异性吸附RNA的清洗 mRNA的洗脱
总RNA提取结果
动物组织mRNA纯化结果
动物组织 （大鼠）
Total RNA
结论：1mg PG-Mag磁粒可偶联 NH4-oligo(dT)20 0.85nmol ~ 0.9nmol
5 磁性复合微粒提取mRNA质量跟踪实验
保存时间
1个月
mRNA/100 μg Total RNA OD260/OD280
2.06μg
1.87
2个月
3个月 6个月
2.71 μg
2.66 μg 2.34 μg
心脏 脾脏
应用偶联有oligo (dT)20 磁性复 合微粒对大鼠肝组织 mRNA 直 接提取电泳图
53 mg 54 mg
53 mg
0.32 μg 0.34 μg
0.19 μg
1.63 1.69
1.51
肺
小结
应用偶联oligo(dT)20的PG-Mag直接提取组织 mRNA的方法，目前只成功纯化出大鼠肝脏组织 的mRNA 。其它大鼠组织mRNA的提取含量偏低， 不能通过电泳检测到，OD260/OD280的值低于1.8， 有蛋白质的污染。 由于心脏和肾脏组织坚韧，不能对其细胞进 行充分的裂解，而脾脏内含有较多的多糖。
3 磁性复合微粒封闭条件的确定
结论：确定应用BSA+Lys 封闭 磁性复合微粒
不同封闭剂对mRNA纯化结果的影响
确立偶联体系：
偶联: 封闭: 保存:
偶联缓冲液， 37ْ C， 180 rpm， 1h 2%Lys 5%BSA ，37ْ C， 180rpm， 1h 0.01% DEPC 处理的偶联缓冲液
4 磁性复合微粒偶联oligo(dT)20的数量
反应批次 1 A组(nmol) 0.85 B组(nmol) 0.85
2 3 4 5 6 7 8 9 10
0.87 0.87 0.86 0.86 0.85 0.85 0.85 0.88 0.87
0.85 0.86 0.86 0.91 0.89 0.84 0.88 0.90 0.84
oligo(dT)偶联 量（nmol）
mRNA纯化量 / 100 μg Total RNA
OD260/OD280
1 mg SA-Mag 1 mg PG-Mag
0.55 0.84
3.24 μg 2.65 μg
1.96 1.93
小结
在oligo(dT)的偶联量上，SA-Mag 少于PG-Mag， 但由于生物素-亲和素系统的高特异性和亲和性， SA-Mag纯化出了更多量的mRNA。电泳结果表明， 两者纯化的mRNA具有相同的质量。 因此，链亲和素－金磁性微粒比PDITC-磁性微 粒能更好的应用于mRNA的分离纯化中，但链亲和 素的高成本，制约了此载体的广泛使用。
纯化的mRNA质量验证：
β-actin 核酸序列的反向扩增：
1 以oligo(dT)为通用引物进行mRNA到cDNA 的逆转录 合成。 2 以合成的cDNA为模板进行大鼠β-actin DNA 序列的 合成 。
大鼠β-actin序列反向扩增结果
小结
应用偶联oligo(dT)20 的PG-Mag已经可以很好的从 各种动、植物组织的总RNA中纯化mRNA，纯化出 的mRNA能很好的应用于下游的分子生物学实验。
mRNA
OD260/OD280
肝脏
肾脏 脾脏
100 μg
100 μg 100 μg
2.26 μg
2.45 μg 1.77 μg
1.94
1.83 1.84
植物组织mRNA纯化结果
植物组织 苜蓿草 小叶女贞
Total RNA 100 μg 100 μg
mRNA 0.93 μg 1.58 μg
OD260/OD280 1.96 1.99
1
2
Fuentes， Biosensors and Bioelectronics, 2006,
3
Rudge ，Journal of Controlled Release, 2001
4
Chen , Applied Surface Science, 2006
5
Smith, Trends in Analytical Chemistry, 2006
1
1.91 1.13 0.64
2
1.55 1.12 0.76
3
1.75 1.37 0.69
结论：确定偶联缓冲液作为反应体系
2 oligo(dT)20偶联时间的确定
0.9
0.8
偶联量(nmol)
0.7
结论：确定 1h 为反应时间
0.6
0.5
0.4 0 20 40 60 80 100 120
时 间 (min)
二 oligo(dT)20偶联数量和mRNA提取质量的确定
4 磁性复合微粒偶联oligo(dT)20的数量 5 磁性复合微粒提取mRNA质量跟踪实验
1 oligo(dT)20 偶联缓冲液的确定
偶联量 (nmol) 偶联缓冲液 PBS缓冲液 TE缓冲液 0.83 0.67 0.63
mRNA (μg )/100 μg Total RNA