大黄酸抑制小鼠腹腔巨噬细胞炎性介质活化的作用机理

3 讨论 有关大黄的临床应用和实验研究已有广泛报
道 。 对其在细胞水平的作用机理的研究也不断深 入 。有研究提示 , 大黄的抗炎作用机理可能和其 抑制脂类炎性介质花生四烯酸代谢产物的生成有
关 。本研究结果证实 , 大黄酸对白细胞脂类炎性皮 质 L T C4 及 L T B4 的 生物合成 均有较强 的抑制作 用 , 由于 LT C4 及 LT B4 是花生四烯酸经 5 -脂氧酶 (5 -L 0)作用的产物 , 从而提示大黄的有效成分可 能对 5 -脂氧酶有一定的抑制作用 。
结果表明 , 在本实验条件下 , 大黄酸 (1 -100 μm ol · L -1) 对静息状态下的小鼠腹腔巨噬细胞胞 浆游离钙水平无明显影响 , 但在 10 -100 μm ol · L -1 范围内大黄酸能显著抑制内毒素刺激所致的细
胞内游离钙水平增高 。结果见表 1 。
2.3 大黄酸对小鼠腹腔巨噬细胞内 cAM P 水平的
*天津市卫生局优秀科技人员基金资助项目 作者单位 :300100 天津市中西医结合急腹症研究所
下贴壁的巨噬细胞 , 在光学显微镜下进行巨噬细胞 计数 , 并配成 1×107 · m L -1 的巨噬细胞悬液 。 1.3.2 L T s 的生成与提取 将上述细胞悬 液 (1 m L)置于 37 ℃恒温振荡水浴中温孵 10 分钟 , 随即 加 入 AA 100 μm ol · L -1(终 浓 度 ), A 23187 5 μmol · L -1(终浓度), 继续温孵 10 分钟 , 每管加入 无水乙醇 2 m L 终止反应 , 加入内标 PG B2 50 ng , 加蒸 馏水 10.5 m L 使 乙醇 浓度 稀释 至 15 % , 于 4 ℃, 4 000 r · mi n -1 离心 15 分钟 , 取上清液用 1 mo l · L -1H Cl 调 pH 值 至 3.0 后 通 过 Sep -P ak C18 反相小柱富集样品 , 并依次用 0.1 %EDT A 、蒸 馏水 、15 %乙醇 、石油醚及甲醇 10 m L 连续洗脱 , 收 集甲醇组份 , 氮气吹干后甲酵复溶 , 取一定量进行
1.5 巨噬细胞 cAM P 水平的测定 将巨噬细胞悬
浮于 PBS 中 , 加入不同浓度的受试药物 ห้องสมุดไป่ตู้空白对照 管不加药物)后 , 37 ℃温孵 30 分钟 , 用煮沸法破碎
细胞 , 然后用放免法测定 cAM P 水平 。
2 结果 2.1 大黄酸对小鼠腹腔巨噬细胞内 L T C4 及 L T B4
生物合成的影响 将大鼠腹腔白细胞悬液配制成 107 m L -1 , 加入
36
天津中医 2001 年 2 月第 18 卷第 1 期
适量 , 加入 F ura -2/ A M 3 .5 μmo l · L -1(终浓度), 37 ℃水浴温 0.5 小时 , 3 000 r · min -1 离心 5 分钟 , 用 PBS 缓冲液 5 m L 洗去残存于细胞外的 Fura -
不同浓度的大黄酸后混匀 , 于 37 ℃预温孵 15 分钟 , 然后加入花生四烯酸 (100 μm ol · L -1);A 23187(5 μm ol · L -1), 继续温孵 30 分钟 , 加入无水乙醇终止 反应 , 经提取纯化用 RP -HP LC 分离定量 。结果表 明 , 大黄酸可明显抑制 L T s 的生物合成 , 对 L T C4 及 L T B4 抑制的 IC50 值分别为 0.44 μmo l · L -1 及 2.78 μmol ·L -1 。 2.2 大黄酸对小鼠腹腔巨噬细胞浆游离钙的影响
内毒素为一生物活性介质的广泛刺激剂 , 可刺 激合成白三烯类炎性介质 。 5 -脂氧酶正常存在于 细胞浆 , 在细胞活化时 , 借助于 Ca2 +转移至细胞膜 上而活化 。还有研究报道提示 , 刺激内源性脂氧酶 产物生成 , 能增强细胞钙内流 , 提高细胞内钙水平 , 脂氧酶抑制剂可抑制钙库的释放 。我们的研究结果 证实 , 大黄酸在抑制 L T C4 及 L T B4 生成的同时可 显著的抑制内毒素刺激引起的细胞内钙增加 。 此 外 , 本研究还发现 , 大黄酸还可使小鼠腹腔巨噬细 胞内 cAM P 水平显著升高 , 而 cAM P 升高可抑制 腹腔巨噬细胞 AA 代谢的更新 。 综上所述 , 大黄酸 可在 L T s 合成 、 细胞内 C a2 +和 cA M P 水平等多个 环节影响白细胞的功能 , 这可能是大黄具有广泛抗 炎作用机制之一 。
(收稿日期 :2000 -08 -29)
1.3.4 生物样品中 L T s 的鉴定 先分别测定 L T C 4 , L T B 4 标准品及白细胞生物
样品中 AA 代谢物在 RP -H P LC 中的保留时间 , 然
后将来自白细胞的生物样品与 L T C4 及 L T D4 标准 品混合 , 再进行 RP -H PL C 分析 。 1.4 巨噬细胞内游离钙浓度测定 1.4.1 Fura -2/ AM 导入 取上述巨噬细胞悬液
加入不同浓度的受试药物 (对照管不加任何药物), 温孵 5 分钟后测定荧光强度 。激发波长 140 nm , 发
射波长 100 nm , 激发光栅 5 nm , 发射光栅 10 nm , 扫描速度 120 nm · mi n-1 。首先测定静息状态时的 荧光强度 , 然后加入刺激剂 f M L P(10-6 mo l · L -1),
天津中医 2001 年 2 月第 18 卷第 1 期
35
大黄酸抑制小鼠腹腔巨噬细胞 炎性介质活化的作用机理 *
倪 弘 薛小平 杨秀竹 张艳萍
摘 要 目的 :探讨大黄有效成分大黄酸抗炎作用机理 。方法 :以小鼠腹腔巨噬细胞为实验材料 , 分别采用高效 液相色谱法 (H P LC), 放射免疫分析法 (R IA )和荧光分光光度法测定巨噬细胞内白三烯 (L T s)、 环 -磷酸腺苷 (cA M P )和细胞内游离钙水平 。结果 :大黄酸可显著抑制巨噬细胞内白三烯 B 4 、白三烯 C 4 的生物合成 , 其 I C 50 值分 别为 0.44 和 2.78 μmo l · L -1 ;大黄酸还可显著抑制内毒素激发的巨噬细胞内 Ca2 +升高 , 并促进细胞内 cA M P 水平 提高 。结论 :大黄酸显著影响巨噬细胞脂类炎性介质活化过程 ,可能是大黄的抗炎作用机制之一 。
影响 结果表明 , 大黄酸(1-100 μmol ·L -1)可使小鼠
腹腔巨噬细胞内 cAM P 水平显著升高。结果见表 2 。
表 1 不同浓度大黄酸对活化前后 小鼠腹腔巨噬细胞浆游离钙的影响(x ±s)
组别 剂量 n
[ C a2 +] i/nmol · L-1 活化前 活化后
Con trol - 6
测定荧光强度 , 约 1 分钟后加 10 %F rit on X -100 20 μl , 1 分钟后再加 300 mmo l · L -1 ED T A 25 m L 使钙离子完全结合 。先后测定最大及最小荧光值 , 用计算机程序处理实验数据 , 分别计算出静息状态
时及加刺激物后细胞内钙离子浓度 。
组别
Con trol 大黄酸 大黄酸 大黄酸
剂量/nmol · L-1 1 10 100
cAM P/pm ol · 106cell
0 .675 ±0 .437 1 .315 ±0 .576 1 .712 ±0 .634 * 2 .235 ±0 .665 **
*P <0 .01 **P <0.001 vs con trol
大黄酸 1
6
大黄酸 10
6
大黄酸 100 6
231±42 222±36 219±54 198±49
498 ±68 479 ±35 392 ±23 * 334 ±26 **
*P <0 .01 **P <0.001 vs control
表 2 大黄酸对小鼠腹腔巨噬 细胞内 cA M P 水平的影响(x ±s)
关键词 大黄酸 白三烯 细胞内游离钙 炎症
中图分类号 :R 285.5 文献标识码 :A 文章编号 :1004 -5392(2001)01 -0035 -02
大黄是一种传统中药 , 有多方面的药理活性 。 目前从大黄中提取并鉴定出结构的药理成分已有
十几种 , 大黄酸是其中含量较高的药理成分 。 药理 研究已证明 , 大黄具有泻下 、抑菌 、清热 、降压 、镇 静 、利尿 、抗炎 、抗变态反应等活性 。 临床治疗研究 显示 , 腹腔急性炎症病人早期应用含大黄中药 , 可 明显缓解症状 , 下调炎症反应 , 对其有关作用机理 的研究受到人们的广泛重视 。本文观察了大黄有效 成分之一的大黄酸对巨噬细胞功能的影响 , 以对大 黄的抗炎作用机理有进一步的了解 。 1 材料和方法 1.1 动物 C 57BL/ 6 雌性小鼠 , 6 ～ 8 周龄 , 由军事 科学院动物研究所提供 。 1.2 药品 与 试 剂 LT C 4 和 LT B4 、 花 生 四 烯酸 (A A )、钙离子载体 A 23187 、前列腺素 B2(PG B2)、内 毒素(E T), Fura -2/AM 均为 Si gm a 产品 ;cAM P 放免测定盒 , 购自中国原子能科学研究院同位素 所 ;大黄酸 , 购自中国药品生物制品检定所 。 1.3 白细胞内 LT B4 , C4 含量测定 1.3.1 小鼠腹腔巨噬细胞悬液的制备 小鼠腹腔 巨噬细胞的制备方法参照文献[ 3] 。将收集的小鼠腹 腔巨噬 细胞加入含 5 %新生牛血清 (NBS)和 10 m mol · L -1Hepes 的 RP M I -1640 培养基 , 培养 4 小时后 , 用磷酸盐缓冲液 (PBS , mm ol · L -1N aCL 137.0 , K CL 2.7 , N a2H PO4 · 12H2O 9.8 , K H2P O4 1.5 , pH 7.2)洗去不贴壁的巨噬细胞 , 用细胞刮刀刮
2/ AM , 再将洗好的细胞重新悬浮于 P SS 缓冲液 中 , 并稀释细胞数至 8 ×106 · L -1 。 1.4.2 荧光强度的测定 取上述有 F ura -2/ AM