1 目的基因的获取

16336117 生物技术一班刘世杰
A班11组（其他成员：刘陶树，刘媛媛，刘书敏，卢珏雯）
实验一：目的基因的获取
1.实验目的
1.掌握总RNA的提取方法和技术及要注意的事项，掌握RNA分析测定方法。

2.了解用RT-PCR法获取功能基因的原理，学习和掌握RT-PCR的技术方法。

2.实验原理
1.RNA提取
RNA在细胞中是以与蛋白质结合的状态存在。

因此RNA提取遵循两个原则：① 保持核酸结构的完整性② 排除其它分子的污染。

RNA的提取一般是用强变性剂使蛋白质和DNA变性，同时有效抑制核糖核酸酶活性；通过有机溶剂抽提去掉蛋白质、多糖等；最后在RNA沉淀剂的作用下，分离出RNA。

提取试剂--TRIZOL: 含有苯酚、异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞并抑制细胞释放出的核酸酶。

本实验旨在获取斑马鱼中EF-1（Elongation Factor 1）基因，全长约480bp。

2.RT-PCR
在反转录酶的作用下，总RNA中的mRNA可在体外被反向转录合成DNA拷贝，其核苷酸序列完全互补于模板mRNA，因而称之为互补DNA（cDNA）。

然后再利用DNA聚合酶，以c DNA第一链为模板，以四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）为材料，在引物（已知或随机）的引导下，复制（扩增）出大量的互补DNA链。

3.试剂与材料
1.RNA提取
实验材料：斑马鱼
试剂：TRIzol Reagent (Invitrogen Co.)
DEPC处理的超纯水（0.02-0.1％）
氯仿、异丙醇及无水乙醇
其它：高速离心机
各种规格RNase Free的枪头、EP管(1.5ml)
RNase Free的玻棒，药勺，镊子，剪刀，碾钵，研杵等。

（烘箱中）新开的大滤纸
液氮
碎冰及泡沫冰盒
2.琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性
电泳缓冲液母液：50×TAE ：称取242g Tris , 57.1 ml冰乙酸,
100ml 0.5mol/L EDTA (pH 8.0) , 溶解后用蒸馏水定容至1000ml。

工作液：用蒸馏水稀释50倍即为1 x TAE 工作缓冲液（ 0.04 mol/L Tris-乙酸; 0.001 mol/L EDTA ; pH 8.0 ）
4.实验步骤
①RNA提取
1. 组织破碎和匀浆化
2.取１ml Trizol 处理样品于离心管中，室温静置5min
3.加入0.2ml氯仿(即0.2V TrIzol)，剧烈振荡15秒
4. 室温静置5分钟
5. 4℃，12,000g，15min，实验室冷冻离心机充分分层
6. 小心吸取上层水相，转入另一离心管
7. 加入0.5 ml异丙醇，混匀；室温静置10min
8. 4℃，12,000g，15min，进行离心沉淀
9. 小心弃去上清，加入0.5ml 75%乙醇，洗涤沉淀
10. 室温离心，7,500g，5min
11. 小心弃上清, 再用枪头吸干，平卧于干净滤纸上，室温干燥~10min
12. 加入20~30 µl ddH2O，溶解RNA
②使用Epoch超微量蛋白核酸分析仪检测RNA的纯度和浓度
③琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性
1. 制备琼脂糖凝胶
2．将样品槽梳子插进托盘长边上的凹槽内。

3、凝胶溶液冷却至50℃左右时，轻轻倒入电泳制胶板上
4、凝胶冷却凝固后，拔出梳子，将凝胶放入电泳槽内，加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液液面刚高出琼脂糖凝胶
5、点样(1-2uL RNA + Sybr green )。

避免因样品过多而溢出，污染邻近样品。

记录样品次序；（Sybr green内含loading buffer，所以不必另外加loading buffer）
6、加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极，打开电源开关。

最高电压不超过5V/cm。

（80-100v）
7、观察和拍照：小心地取出凝胶托盘，然后将胶块推至保鲜膜上，在波长254nm 紫外灯下观察。

荧光在紫外线照射下会逐渐减弱，因此初步观察后，应立即拍照记录下电泳图谱。

④反转录
1.按实配量配制反应液，混匀后分装PCR管，每管9µl，加自已的RNA样品1µl。

放入PCR仪中，进行反转录反应。

2.30C反应10分钟，42 C 反应30分钟，99C加热 5分钟，4 C 5分钟，
然后置于冰上。

注意：AMV RTase能与cDNA结合，会阻害PCR扩增反应。

因此，在PCR反应前，必须进行99℃ 5分钟加热使AMV RTase失活。

⑤目的基因的PCR扩增
1.配制反应液
2.把反转录后一链加入到反应液中，轻轻混匀。

3.按以下条件进行PCR反应step1 94℃变性 2 min
step2 94℃变性 40 sec
step3 60℃复性 40 sec
step4 72℃延伸 40 sec
step5 72℃温育 5 min
step6 4℃ 保存 step2-4运行30个循环
4 .反应结束后,取反应液 (3～
5 ul) 进行琼脂糖凝胶电泳，确认反应产物，或冷冻保存，备以后分析使用。

⑥胶回收
1.DNA样品琼脂糖电泳，切胶。

2.把所割胶放入 1.5 ml EP管 , 称重；
3.按 1g/1ml 的量, 加入 Binding Buffer, 55-65℃水浴 7min；（每隔2－3 min，摇一下）；
4.把溶液转移至柱子内,10000g 离心 1 min ，倒出套管内残液；
5.在柱子中加入300 μl Binding buffer, 10000g 离心 1min，倒出套管内残液；
6.在柱子中加入 700ul 的 SPW 溶液，放置 2－3min，10000g 离心 1min ，去残液；
7.10000g 离心 1min（去乙醇）；
8.把柱子放入干净的 1.5ml EP 管。

加灭菌ddH2O 20 μl。

50℃ 放置 1min，10000g 离心 1min。

9.检测DNA的纯度和浓度，选取质量好的进行连接转化。

5.实验结果
图1.斑马鱼总RNA 提取结果电泳图
图2.胶回收电泳结果（未加marker ） marker 28S 18S 5S
A B C D
6.思考题
①计算所提取的总RNA的A
260/A
280
值和浓度
共四组：
A：1.953,1193.44
B：1.942,1299.52
C：1.74,1595.36
D：1.715,1195.92
②写出三种常用的RNA酶的抑制剂以及其作用机理。

1.异硫氰酸胍：在裂解组织的同时也使得RNA酶失活，既可破坏细胞结构又可使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。

2.焦炭酸二乙酯（DPEC）：强烈但不彻底的RNA酶抑制剂，通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。

3.钒氧核糖核苷复合物：和RNA酶结合形成过渡态类物质，能百分百的抑制RNA 酶的活性。

③琼脂凝胶电泳中DNA分子迁移率受到哪些因素的影响？
1.DNA分子的大小，构型以及构象：cccDNA>直线DNA>开放双链环状DNA，分子量相同时，超螺旋DNA移动最快,而线状双链DNA移动最慢。

2.琼脂糖浓度：DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系
3.电源电压的大小：低电压下，分离效果较好。

在低电压条件下，线性DNA分子的电泳迁移率与所用的电压呈正比。

电场强度增加时，不同分子量的DNA段的迁移率将以不同的幅度增长,片段越大,因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大,因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。

（一般不大于5V/cm）
4.嵌入染料的存在：染料会嵌入碱基对之间，使其刚性变强从而迁移率降低。

5.电泳缓冲液的组成及其离子强度：在没有离子存在时,电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中,则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。

④如果样品电泳后很久都没有跑出点样孔，有哪几方面的原因？
1.点样或是制孔出现失误。

2.样品未提出或是提出的DNA量太少，难以观察到
3.电泳时间过长，染料消耗殆尽
4.未成功与蛋白质分离导致DNA无法跑出点样孔
⑤如何提高RT-PCR的灵敏度和特异性？
1.确定模板RNA 完整性，无DNA污染；
2.RNA 模板中不应含有扩增反应抑制剂；
3.为了防止模板降解，在反应体系中加入RNase 抑制剂RNasin；
4.使用适量的模板RNA，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱；
5.若模板中有二级结构，可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果；
6.设计引物时，避免在引物3’端含有互补序列，避免形成内部发卡结构。

7.讨论
RNA提取实验中28S和18S可以看到较为清晰的条带，而5S条带难以观察到清晰的条带，可能的原因是：
①实验操作过程中尽管一直使用了塑胶手套，但还是使得样品接触到了一定量的RNA酶，使得部分RNA样品被降解
②有两组样品的A260/A280值低于1.8，代表其中还有蛋白质或是其他的杂质（如酚）残留，干扰了条带的观察。

③实验仅仅进行了一组分光光度计的操作，可能设备本身有一定问题没有排除，导致最后的结果不够理想。