第五章固定化酶和细胞
酶与细胞的固定化
发酵液中含菌体少，有利于产品的分离纯化，提高产品质量等
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
• 缺点：酶与载体相互作用力弱，酶易脱落等 1）引入功能团和间隔臂；
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方 固定化后酶的哪些主要性质发生了变化?变化的趋势及原因分析.
常见非共价法?常见共价法?
法。 少量的持续不断的配基的脱落;
交联法由于不需要活化基团,所以条件比较温和,酶活的回收率比较高? 活力回收:指固定化后固定化酶(或细胞)所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞)总活力的百分比. 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。颗粒状占 绝大多数，它和线条主要用于工业发酵生产 ，薄膜主要用于酶电极。酶管机械强度较大 ，主要用于工业生产。
固定化酶的优势：
① 极易将固定化酶与底物、产物分开；产物溶 液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；
② 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱 连续反应
③ 酶反应过程能够加以严格控制； ④ 较游离酶更适合于多酶反应； ⑤ 在大多数情况下，能够提高酶的稳定性； ⑥ 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ⑦ 酶的使用效率提高、成本降低。
在中性pH下优先与a-氨基反应,因此有一定的选择性 缺点：在包埋过程发生的化学反应同样会导致酶的失活。
• 优点：酶活性中心不易被破坏，酶高级结构 二、载体活化程度和固定化配基密度的测定
固定化过程中，酶分子空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；
用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。
第五章 固定化酶和细胞
制备固定化酶的依据
1.固定化酶必须能保持酶原有的专一性、 1.固定化酶必须能保持酶原有的专一性、高效催化 固定化酶必须能保持酶原有的专一性 能力和常温、常压下能起催化反应等特点。 能力和常温、常压下能起催化反应等特点。 2.固定化酶应能回收、贮藏，利于反复使用。 2.固定化酶应能回收、贮藏，利于反复使用。 固定化酶应能回收 3.固定化酶应用于机械化和自动化操作 固定化酶应用于机械化和自动化操作， 3.固定化酶应用于机械化和自动化操作，所用载体 常有一定的机械强度。 常有一定的机械强度。 4.固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性 固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性。 4.固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性。即 要保护活性中心基团。 要保护活性中心基团。 5.固定化酶应能最大程度与底物接近 固定化酶应能最大程度与底物接近， 5.固定化酶应能最大程度与底物接近，从而提高产 具有最小的空间位阻。 量。具有最小的空间位阻。 6.固定化酶应有最大的稳定性 固定化酶应有最大的稳定性。 6.固定化酶应有最大的稳定性。 7.固定化酶应易与产物分离 固定化酶应易与产物分离。 7.固定化酶应易与产物分离。
随着固定化技术的发展，出现固定化菌体 1973年 随着固定化技术的发展，出现固定化菌体 。1973年，日 本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨 酸酶，由反丁烯二酸连续生产L 天门冬氨酸。 酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。 在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了 在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了 固定化细胞技术 技术。 1976年 固定化细胞技术。 1976年，法国首次用固定化酵母细胞 生产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀 生产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀 粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。 粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。 1982年 日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸， 1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸， 固定化原生质体生产谷氨酸 取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍， 取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍， 更有利于胞内物质的分泌， 更有利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的 变革提供了新的方向。 变革提供了新的方向。
固定化技术应用-酶和细胞的固定化
固定化技术应用－酶和细胞的固定化试题中出现固定酶能不能催化一系列反应，查找资料，没有权威资料认为已经存在催化系列反应的酶，应该是研究方向。
选修知识的考查已经出现应用方向，也拓展到了技术的前景。
也就是说，需要在教学中创设情境适当扩大知识面，结合试题进行教学会收到很好的效果，如固定化酶技术可以拓展到固定化细胞。
问题：固定化技术以及发展前景如何？什么是固定化酶？什么是固定化细胞？011.固定化酶技术固定化酶技术是用物理或化学手段。
将游离酶封锁住固体材料或限制在一定区域内进行活跃的、特有的催化作用，并可回收长时间使用的一种技术。
酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。
经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。
2.固定化酶技术的发展以前，固定化酶技术是把从生物体内提取出来的酶，用人工方法固定在载体上。
1916年Nelson和GrImn最先发现了酶的固定化现象。
科学家们就开始了同定化酶的研究工作。
1969年日本一家制药公司第一次将固定化的酰化氨基酸水解酶用于从混合氨基酸中生产L－氮基酸，开辟了固定化酶在工业生产中的新纪元。
我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是微生物所和上海生化所的工作者开始了固定化酶的研究。
当今，固定化酶技术发展方向是无载体的酶固定化技术。
邱广亮等用磁性聚乙二醇胶体粒子作载体，采用吸附－交联法，制备出具有磁响应性的固定化糖化酶，简称磁性酶(M I E)一方面由于载体具有两亲性，M I E可稳定的分散于水相或有机相中，充分的进行酶催化反应；另一方面，由于载体具有磁响应性，M I E又可借助外部磁场简单地回收，反复使用，大大提高酶的使用效率。
Puleo等将钛合金表面用丙烯酸胺等离子体处理引入氨基，然后将含碳硝化甘油接枝于钛合金表面，或者将等离子体处理的钛合金先由琥珀酸酐处理，再用含碳硝化甘油接枝，进而将溶菌酶和骨形态蛋白进行固定，实现了生物分子在生物惰性金属上的固定化。
第五章酶和细胞的固定化
• 固定化酶与游离酶相比，具有下列 优点： (1)极易将固定化酶与底物、产物分开； 产物溶液中没有酶的残留，简化了 提纯工艺; (2)可以在较长时间内反复使用，有利 于工艺的连续化、管道化; (3) 在大多数情况下，能够提高酶的 稳定性；
①操作稳定性提高，在操作中可以 长时间保留活力，半衰期在一个 月以上 ② 贮存稳定性比游离酶大多数提 高。 ③ 对热稳定性，大多数升高，有 些反而降低。
(4)酶反应过程能够加以严格控制,有利 于工艺自动化和微电脑化。 (5)较游离酶更适合于多酶反应； (6)酶的使用效率提高，成本降低,增加 产物收率，提高产物质量.
第二节 固定化酶的制备
制备固定化酶应遵循的基本原则? 酶的固定化方法有哪几种？包埋法具有 什么特点？ 什么是交联法？有几种形式？ 固定化细胞受到重视的主要原因？包埋 法固定化细胞有哪些方法？
根据吸附剂的特点又分为两种：
1、物理吸附法
是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于 不溶性载体的方法。 常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、 氧化铝、磷酸钙胶、微空玻璃等无机 吸附剂，纤维素、胶原以及火棉胶等 有机吸附剂。
2、离子结合法
◆是指在适宜的pH和离子强度条件下，利
用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相 互作用而达到酶固定化的方法。最常用的 交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、 DEAE-葡聚糖凝胶等；其他离子交换剂还 有各种合成的树脂如Amberlite XE-97、 Dowe X-50等。
一、制备固定化酶遵循的基本原则： （1）必须注意维持酶的催化活性及专一性。 （2）固定化酶应有利于生产自动化连续化。 （3）固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能 不妨碍酶与底物接近，以提高产品产量。
（4）酶与载体必须结合牢固，从而使固定化 酶能回收贮藏，利于重复使用。 （5）固定化酶应有最大的稳定性，所选载体 不与废物、产物或反应液发生化学反应。 （6）固定化酶成本要低，以利于工业使用。
酶的固定化
1）酶传感器的原理
酶传感器主要由固定 化酶膜和变换器组成： 固定化酶膜：选择性 地“识别”并催化被 检测物质发生化学反 应 变换器：把催化反应 中底物或产物的变量 转换成电信号，通过 仪表显示出来。
65
（2）酶电极（葡萄糖氧化酶电极） 半透膜 酶胶层
感应电极
1967年Updike等采用 酶的固定化技术，将葡萄 糖氧化酶固定在疏水膜上， 然后再和氧电极结合，组 装成了世界上第一个生物 传感器——葡萄糖氧化酶 电极。
酶分子中可以形成共价键的基团：
氨基、羧基、巯基、羟基、酚基、咪唑基
载体 活泼基团
载体活化的方法
1. 活化
酶辅助蛋白交联法
酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联
32
固定化方法与载体的选择
1.必须注意维持酶的催化活性和专一性 2.酶与载体结合牢固 3.载体的机械强度 4.固定化酶要有最小的空间位阻 5.载体稳定，不可与底物、产物发生反应 6.固定化酶要廉价
3
4
5 6
7
游离酶：
固定化酶：
四、固定化酶的应用
Go 1.在工、农业生产上的应用 Go 2.在医药、治疗上的应用 Go 3.在分析化学中的应用
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1、固定化酶在工农业生产上的应用
产物
酶或细胞
L-氨基酸 果糖浆
氨基酰化酶 葡萄糖异构酶或含该酶菌体
6-APA L-门冬氨酸 L-苹果酸 低乳糖牛奶
原料
乙酰-DL-氨基酸 葡萄糖 青霉素G 反丁烯二酸 反丁烯二酸 牛奶 牛奶 蛋白 桔类果汁 生啤酒 植物油 植物油
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产物
类固醇 L-丙氨酸
D-苯甘氨酸 ATP 核苷酸类味 精 乙醇
啤酒
第五章-固定化酶
2．离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换剂的水不溶 性载体的固定化方法。 • 常用载体：各种阴、阳离子交换剂。 如CM-纤
维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等
• 优点：操作简单，酶活性中心不易被破坏和酶
高级结构变化少，酶活力损失很少。
• 缺点：载体和酶的结合力 比较弱，酶易脱落。
3.共价结合法
• 相对活力：固定化酶活力与同量蛋白量
的溶液酶活力的比值
固定化酶活力 相对活力 100% 溶液酶总活力 残留酶活力
四、固定化酶（细胞）的半衰期
• t1/2 ：固定化酶（细胞）的活力下降为最 初活力1/2所经历的连续工作时间；衡量 操作稳定性的指标。
Fig. 2. Kinetic of ROL adsorption on the silica aerogels. The activity was measured using olive oil emulsion as substrate at pH 8.5 and 37 °C.
第五章 固定化酶与固定化细胞
第一节 酶的固定化
一、固定化酶（immobilized enzyme）：是 指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能 连续进行反应，反应后的酶可以回收重复 使用。
优点：
①极易将固定化酶与底物、产物分开，简 化了提纯工艺，提高酶的使用效率； ②在大多数情况下，能够提高酶的稳定；
(五)固定化酶的米氏常数(Km)变化 • 中性载体：固定化酶的表观Km值上升。
• 载体与底物电荷相同：表观Km值显著 上升； • 载体与底物电荷相反：Km
？
四、影响固定化酶性能的因素
1．构象改变、立体屏蔽
• 构象改变：指固定化过程及酶和载体的 相互作用，引起了酶的活性中心构象发 生改变，从而导致酶活性改变的—种效 应。
酶工程选择题全部
第一章1.（C）证明了酶的本质是蛋白质A 施旺 B巴斯德 C 萨姆纳 D 芬恩 E 桑格2.1960年（A）提出操纵子学说。
A.Jacob和MonodB. Payen和PersonzC.Sumner和SangerD.Cech和Altmanard和Hans3.1个酶活力单位是指（B）A. 在特定条件（0℃，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量B. 在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量C. 在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，在1秒钟内能转化1微摩尔底物的酶量D. 在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1摩尔底物的酶量E. 在特定条件（0℃，其它为最适条件）下，在1秒钟内能转化1摩尔底物的酶量4.酶促反映的初速度不受那个因素的影响（D）A.[S]B.[E]C.pHD.时间E.温度5.关于米氏方程常数Km，哪个是对的的（D）A.饱和底物浓度时的速度B.在一定酶的浓度下，最大速度的一半C.饱和底物浓度的一半D.速度达最大速度半数时的底物浓度E.减少一半速度时的克制剂浓度6.下面关于酶的描述，哪一项不对的？（A）A.所有的蛋白质都是酶B.酶是生物催化剂C.酶是在细胞内合成的，但是可以再细胞外发挥催化功能D.酶具有专一性E.酶在强碱、强酸条件下会失活7.下列哪一项不是Km值的功能（E）A.Km值是酶的特性物理常数，可用于鉴定不同的酶B.Km值可以表达酶与底物之间的亲和力，Km值越小、亲和力越大C.Km值可以预见系列反映中哪一步是限速反映D.用Km值可以选择酶的最适底物E.比较Km值可以估计不同酶促反映速度8.酶的活性中心是指（C）A.酶分子上的几个必须基团B.酶分子与底物结合的部位C.酶分子结合底物并发挥催化作用的关键性三维结构区D.酶分子中心部位的一种特殊结构E.酶分子催化底物变成产物的部位9.在一定温度范围内，反映速度随温度升高而加快，一般来说，温度每升高（D），反映速度大约增长一倍？A.1℃B.2℃C.5℃D.10℃E.15℃1.酶的催化特点（ABCD）A.极高的催化效率B.高度的专一性C.活性的可调节性D.活性的不稳定性E.活性的稳定性2.酶的专一性分为哪两个(BC)A.底物作用的专一性B.结构专一性C.立体异构专一性D.温度选择的专一性E.PH专一性3.酶的催化作用受哪些因素的影响？ABCDEA.底物浓度B.产物浓度C.酶浓度D.温度E.pH第四章1，下列关于酶应用过程中的一些缺陷错误的是（C）A酶的稳定性较差B酶的一次性使用C不溶于水，易于与底物、产物分离D产物的分离纯化较困难2，下列关于酶应用过程中的优点,错误的是（A）：A；酶的自水解作用B可反复使用；C可连续化生产；D稳定性好。
固定化酶与固定化细胞
生化代谢产物,需由多种酶经多步酶促反应才能合成. 生化代谢产物,需由多种酶经多步酶促反应才能合成. 多酶反应器,为制造那些在有机合成上很棘手的, 多酶反应器,为制造那些在有机合成上很棘手的,结构 复杂的生化代谢物开辟了一条新的途径. 复杂的生化代谢物开辟了一条新的途径.
固定化细胞
直接把微生物细胞固定化
包埋法是制备固定化细胞最常用的方法. 包埋法是制备固定化细胞最常用的方法.将 产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶, 产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶,琼脂糖 凝胶,琼脂,海藻酸,卡拉胶, 凝胶,琼脂,海藻酸,卡拉胶,二和三醋酸纤 胶原,明胶和戊二醛等包埋起来, 维,胶原,明胶和戊二醛等包埋起来,发挥酶 或酶系的作用. 或酶系的作用. 例如: 3m1细胞悬浮液加人到 例如:海藻酸包埋 3m1细胞悬浮液加人到 2% 溶液中,置冰箱10h 10h, 20ml 2%CaCl2溶液中,置冰箱10h,用 100ml生理盐水洗二次 生理盐水洗二次. 100ml生理盐水洗二次. 注意:如果反复使用固定化细胞,需要避免 注意:如果反复使用固定化细胞, 其他微生物的污染, 其他微生物的污染,在工业生产中细胞的固 定化是在严格无菌条件下进行. 定化是在严格无菌条件下进行.
酶分子被结合到水不溶性 载体上共价结合形成水不 溶性的固定化酶
交联法
使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互 交联呈网状结构的固定化方法. 交联呈网状结构的固定化方法. 最常用的双功能试剂有戊二醛, 最常用的双功能试剂有戊二醛,顺丁稀二酸 酐和乙烯共聚物等.酶蛋白中的游离氨基, 酐和乙烯共聚物等.酶蛋白中的游离氨基,酚 咪唑基及巯基均可参与交联反应. 基,咪唑基及巯基均可参与交联反应. 双功能试剂: 双功能试剂: 常用的是戊二醛 常用的是戊二醛 O O
固定化酶和固定化细胞的制作方法
固定化酶的制作方法固定化酶的方法主要有吸附法、包埋法、共价结合法、共价交联法、结晶法(一)、吸附法吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。
只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触，再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。
是最简单的固定化技术，在经济上也最具有吸引力.物理吸附法(physical adsorption)是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。
常用的载体有：高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微空玻璃等无机吸附剂，纤维素、胶原以及火棉胶等有机吸附剂。
离子结合法(ion binding)是指在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法（离子键）。
最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等；其他离子交换剂还有各种合成的树脂如Amberlite XE-97、Dowe X-50等。
离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。
影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素:1. pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。
2. 离子强度：多方面的影响，一般认为盐阻止吸附。
3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。
4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。
5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。
6. 载体：对于非多孔性载体，则颗粒越小吸附力越强。
多孔性载体，要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。
吸附法的优点：操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固定化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。
吸附法的缺点：酶和载体的结合力不强，会导致催化活力的丧失和沾污反应产物；经验性强。
（二）、包埋法包埋法是将酶物理包埋在高聚物网格内的固定化方法。
(如将聚合物的单体和酶溶液混合后，再借助聚合促进剂的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到固定化的目的）。
固定化酶与固定化细胞技术
固定化酶与固定化细胞技术酶是具有生物催化功能的生物大分子(蛋白质或RNA)，但通常指的是由氨基酸组成的酶，本章也仅探讨此类酶。
作为一种生物催化剂，参与生物体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变化。
由于酶的高级结构对环境十分敏感，各种因素(包括物理因素、化学因素和生物因素)均有可能使酶丧失活力。
但在常温常压条件下能高效地进行反应，且具有很高的专一性，副反应少，许多难以进行的有机化学反应在酶的作用下都能顺利进行。
由于酶的这些特点，大大促进了酶的应用和酶技术的研究。
酶被人们广泛应用于酿造、食品、医药等领域，特别是近几年来，随着分子生物学的发展，酶的应用更加活跃。
由于酶反应随着时间的延长，反应速度会逐渐降低，反应后酶不能回收，这就限制了酶的应用范围。
如果能将酶固定在惰性支持物上制成固定化酶，仍具有催化作用，还能回收反复使用，并且生产可以连续化、自动化。
从20世纪60年代固定化酶技术发展以来，不仅在酶学理论研究中发挥独特作用，在实际应用中也显示出强大的威力。
随着技术的不断发展，广义的固定化酶发展到固定化辅酶、固定化细胞及固定化细胞器等，固定化酶在食品、医药、化工和生物传感器制造上都有成功的应用实例。
对一个特定的目的和过程来说，是采用细胞，还是采用分离后的酶作催化剂，要根据过程本身来决定。
一般来说，对于一步或两步的转化过程用固定化酶较合适；对多步转换，采用固定化细胞显然有利。
第一节固定化酶固定化酶(immobilized enzyme)是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。
酶的固定化是将酶与水不溶性载体结合，制备固定化酶的过程。
固定化酶的形状依不同用途有颗粒、线条、薄膜和酶管等，颗粒状占绝大多数；颗粒和线条主要用于工业发酵生产；薄膜主要用于酶电极；酶管机械强度较大，主要用于化学工业生产。
目前，由于固定化酶的性质比游离酶及其相关技术优越，人们对其极感兴趣，因此固定化酶的应用也与日俱增。
第五章酶的固定化
收率 Yield (%)
(fold)
2736.9
13080.2 23314.100
30 10 9
Sepharos
e柱层析 HiTrap19 42218 0.3
Q柱层析
实验 木瓜蛋白酶的固定化
实验原理：
载体：尼龙
固定化方法：共价结合法
Enzyme+N, N-甲叉双丙稀酰胺, 丙稀酰胺
引发剂－－inactiation
2）半透膜包埋法（微囊型）
将酶或含酶细胞包埋在高分子半透膜中的固定化方
法。
界面聚合法
是用化学手段制备微囊的方法。利用亲水性单体和
疏水性单体在油水界面上发生聚合反应形成聚合体
而将酶包裹起来。
（3）结合法
1）共价结合法 ☆ 通过共价键将酶与载体结合的方法。 ① 结合方法
化的方法称为包埋法。
凝胶包埋法（网格型） 包埋法 半透膜包埋法（微囊型）
只适合作用于小分子底物和产物的酶。
1）凝胶包埋法（网格型）
将酶或含酶菌体包埋在高分子凝胶细微网格中，制
成一定形状的固定化酶，称为网格型包埋法。也称
为凝胶包埋法。
首先被采用的网格包埋法是：
固定化胰蛋白酶 木瓜蛋白酶 －淀粉酶
在上述条件下，每10min增加0.001个消光值为 1个酶单位(U)(以下同)。
实验 木瓜蛋白酶的固定化
酶活力测定：
（2）残留酶活力测定：方法同溶液酶活力测定。
（3）固定化酶活力测定：取一块尼龙布固定化酶， 加入2.0mL激活剂，其余步骤与溶液酶测定相同。
第五章：微生物工程的固定化技术
（3）载体与酶结合后，酶虽不失活，但酶与底物间 的相互作用受到空间位阻，从而使活力下降。
固定化酶的活力：
指固定化酶催化某一特定反应的能力， 其大小以该酶在一定条件下催化某一反应的 速度来表示。
常用：umol/（min ·mg） umol/（min ·cm）
六、固定化酶的应用
1、固定化酶在发酵工业中的应用 L — Ala +乙酸
5、先决条件： 底物和产物应容易透过微生物细胞膜； 没有产物的分解系统或副反应系统，或者虽然 具有这两种系统，但用热处理或控制pH等简单方 法可使其失效。
三、固定化细胞的目的
微生物菌体不需多次培养、扩大，从而缩 短了发酵生产周期 ； 发酵稳定性好，可以较长时间反复使用或 连续使用，有希望在反应柱进行连续生产。 发酵液中菌体少，有利于产品的分离纯化。
一般的制备过程如下：将1ml溶于适当缓冲液的酶溶液加入含 有750mg丙烯酰胺(单体)和40mg N，N’—甲叉双丙烯酰胺 (交联剂)的3ml溶液中，再加0.5ml 15％的二甲氨基丙腈(加速 剂)，同时，加入1％过硫酸钾(引发剂)，混合，于23T，保温 10min，便得含酶凝胶。
缺点： 酶容易漏失，以低分子量蛋白质为甚，如果调 整交联剂浓度与交联程度可以得到克服。
2、吸附固定法 主要通过载体与细胞间的静电引力，即细 胞表面与载体之间范德华作用力，离子键 和氢键作用力，使细胞固定在载体上的。
影响吸附法的主要因素
（1）Z-电位： Z-电位能近似地代表表面 电荷密度的大小； （2）细胞的性质和细胞壁的组成：细胞 壁的电荷性质； （3）载体的性质：特别是玻璃、陶瓷等 无机材料。
生化工程固定化酶和细胞
底物从反应液传递到载体表面 （外扩散）
↓
底物从载体表面移向酶活性中心 （内扩散）
↓
底物与酶反应
↓
产物由反应位点移向载体表面 （内扩散）
↓
产物传递到反应液中（外扩散）
¾ 总的反应速度取决于最慢的步 骤
就是说固定化酶反应过程是由底物及产物的外 扩散、内扩散及反应等一系列分过程组成的。 传质过程必然影响到总体过程的速率。
④选择率Ssp (selectivity)
当反应过程中有副反应发生，除生成目的产物 外，还生成其它产物时，通常使用选择率这个概 念。
Ssp是指实际转化成目的产物量与全部底物可生
成产物S的sp 理= 论as量p (之sp0 比− 。s)
式 中 asp代表1摩尔底物能生成目的产物P的理论量 （摩尔），其数值取决于反应的计量式。
这种由物质扩散引起的固定化酶反应动力学与 游离酶间的差异称为扩散效应。
一般规律为： ①这种效应对反应速度的影响程度既取决于该效
应本身的大小，也取决于它和酶反应固有速度的 相对大小。这就是说，如果酶反应本身的速度很
小，扩散限制产生的影响也就小一些；反之，扩 散限制就将在整个过程起律速作用。
将固定化酶填充于反应器内，制成稳定的柱床， 然后，通入底物溶液，在一定的反应条件下实现 酶催化反应，以一定的流速，收集输出的转化液 (含产物)。在柱床中，液体流动状态接近于平推 流(又称活塞流)型，因此，填充床反应器可以近 似地看成是一种平推流型反应器。
填充床反应器
带循环的填充 床反应器
由于它且有高效率、易操作、结构简单等优点， 因而是目前工业生产及研究中应用最为普遍的反 应器。它适用于各种形状的固定化酶和不含固体 颗粒、强度不大的底物溶液，以及有产物抑制的 转化反应。
第五章固定化酶
一、固定化细胞的概念和目的
概念
细胞的固定化是利用物理、化学等因素将细胞约 束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍能保留 其催化活性，并具有能被反复或连续使用的活力
目的
生产酶等各种代谢产物。可代替游离细胞进行酶 的发酵生产。具产酶率高、发酵周期短、可连续 发酵等优点
➢ 微生物细胞、植物细胞和动物细胞都可以制成 固定化细胞
6、相 对 活 力 ＝ 加 入 酶 的 总 活 固 力 定 - 化 上 酶 清 总 液 活 中 力 未 结 合 酶 活 力 1 0 0 ％
第二节结束 优点 固定化酶的优缺点
性固 质定 及化 其酶 评的 价特 指点 标、
缺点
固定化酶的性质变化
酶活力的变化 酶稳定性的变化 最适温度的变化 最适pH的变化 米氏常数(Km)的变化
4、最适pH的变化
➢ 最适pH、酶活力－pH曲线发生偏移
➢ 带负电荷载体(阴离子聚合物)，最适pH偏高， 向碱性偏移
- --
-
--
-
---
--------------------------------
+ H+ +
+++ +
H+
H+
+
+
+
+ H+
+
-
OH-
-
-
OH-
-
OH- -
-OH-
-
-
-
-
5、米氏常数(Km)的变化
（2） 考察固定化酶稳定性 （3） 考察固定化酶最适反应条件
第三节提要
固定化酶的制备原则
尽可能地保持自然酶的催化活性 载体与酶结合牢固 空间位阻较小 成本尽可能低
酶与细胞固定化的方法
酶与细胞固定化的方法酶呀，就像是细胞世界里的小精灵，它们有着神奇的魔力，可以加速各种化学反应的进行。
那怎么才能把这些小精灵更好地利用起来呢？这就涉及到细胞固定化啦！细胞固定化，简单来说，就是给酶找个安稳的“家”，让它们能老老实实地在那里发挥作用。
那都有哪些方法呢？有一种方法就像是给酶盖房子，这就是吸附法。
就好像磁铁能吸住铁钉一样，一些具有吸附能力的材料可以把酶吸附住。
这些材料就像是酶的小窝，让酶舒舒服服地待在里面。
这种方法简单又方便，不需要太复杂的操作。
还有包埋法，这就好像把酶包在一个小口袋里。
用一些特殊的材料形成一个小网格，把酶困在里面。
酶在这个小口袋里依然可以自由活动，发挥它们的本领。
交联法呢，就像是给酶之间拉起很多“绳子”，让它们彼此连接固定起来。
就像小朋友们手牵手一样，这样酶就不容易乱跑啦。
这些方法各有各的特点和适用情况呢。
比如说吸附法，操作简单，但是可能不太牢固，酶容易跑掉。
包埋法呢，能很好地保护酶，但有时候可能会影响酶的活性。
交联法比较牢固，但操作起来可能稍微麻烦一点。
那我们为什么要费这么大劲去固定化酶呢？这好处可多啦！固定化后的酶可以重复使用呀，就像我们的工具一样，用了一次还能再用，多划算！而且它们的稳定性也提高了，不会轻易被破坏。
这就好比一个娇弱的小公主变成了坚强的女战士。
想象一下，如果没有这些细胞固定化的方法，我们的很多生产过程会变得多么麻烦呀！酶就像一群调皮的小孩子，到处乱跑，不好管理。
但是有了这些方法，它们就变得乖乖的，为我们的生活和生产带来了很多便利。
在实际应用中，我们要根据具体的情况选择合适的方法。
就像我们穿衣服一样，不同的场合要穿不同的衣服。
我们要让酶在最合适的环境中发挥最大的作用。
总之，酶与细胞固定化的方法是非常重要的，它们就像是打开生物技术大门的钥匙。
让我们更好地利用这些神奇的酶，为我们的生活创造更多的美好和可能吧！难道不是吗？。
第五章固定化酶及固定化技术
➢ 固定化酶：是指经物理或化学方法处理，限制 在一定的空间范围内，可以反复使用而又能发 挥催化作用的酶制剂。
➢ 酶的固定化技术包括吸附、交联、共价结合（ 化学偶联）及包埋等多种方法。
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酶生物反应器
✓与固定化酶技术相配套的是酶 生物反应器
✓同一般的化工容器一样，需要对酶反应器 温度和pH等条件进行严格的控制；不同的是， 酶反应器必须进行无菌操作。
选择载体的原则
（1）要有巨大的比表面积 （2） 要有活泼的表面
（3） 便于装柱进行连续反应。
有机载体：纤维素、骨胶原、火棉胶 无机载体：氧化铅、皂土、白土、 高岭土、多孔玻璃、 硅藻土、二氧化钛等
SMS:一种硅酸盐载体
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2. 结合法
离子键结合法
➢ 是指通过离子键将酶结合到具有离子交换基团的非水溶性载体上的 方法。
结果如图所示: 固定化酶的活力基本保持稳定活力损失15% , 由此可见该固定化酶具有良好的操作稳定性
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一、固定化酶（immobilized enzyme）
什么是固定化酶？
水溶性酶
水不溶性载体
固定化技术
水不溶性酶 （固定化酶）
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第七页，编辑于星期二：十九点 十一分。
简史
1916年，Nelson & Griffin “酶不溶于水而具有活性” 1948年，Sumner 尿素酶制成非溶性酶 1953年，Grubhofer & Schleith 第一次实现了酶的固定化 1960年，千细一郎，开始了氨基酰化酶固定化研究 1969年，千细一郎成功的将固定化氨基酰化酶应用于DL-AA
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固定化酶和细胞
制作：郑穗平
酶应用过程中的主要瓶颈
酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如α -淀粉酶、Taq酶等；和 胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在高温、强酸、 强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。
1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸， 取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍， 更有利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的 变革提供了新的方向。
本章 目录
3 酶固定化技术
固定化酶操作的注意事项 活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的
氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定 化酶时，需要在非常严密的条件下进行。 功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、 组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的 羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求 不参与酶的固定化结合 酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理， 而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因 此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。
酶的固定化技术和固定化酶
酶
可溶
间歇
吸附
包埋
间歇
固定化
交联
化学偶联
连续
固定化酶的三种形式
固定化酶：经提取和分离纯化后的酶
固定化菌体(死细胞)：含酶菌体或菌体碎片
固定化细胞：在一定的空间范围内进行生命活动的细胞
优点： 1. 不溶于水，易于与产物分离； 2. 可反复使用； 3. 可连续化生产； 4. 稳定性好。
包埋法
将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶 固定化的方法。
包埋法使用的多孔载体主要有：琼脂、琼脂 糖、海藻酸钠、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺、 光交联树脂、聚酰胺、火棉胶等。
根据载体材料和方法的不同，可分为：
凝胶包埋法：将酶或含酶菌体包埋在各种凝胶内部的微孔中，制成一 定形状的固定化酶或固定化含酶菌体。大多数为球状或片状，也可按 需要制成其他形状。常用的凝胶有琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜 胶、明胶等天然凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等合成凝胶。
半透膜包埋法：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内，制成 固定化酶。常用于制备固定化酶的半透膜有聚酰胺膜、火棉胶膜等
首先被采用包埋法的酶有：
• 固定化胰蛋白酶 • 固定化木瓜蛋白酶 • 固定化－淀粉酶 Enzyme+N,N-甲叉双丙烯酰胺，丙烯酰胺，引发 剂
海藻酸钙包埋法装置
将水溶性的海藻酸钠配成水溶液， 并把酶或细胞分散在其中，然后将 其滴入凝固浴中（常用CaCl2 溶 液），使海藻酸钠中的Na+，部分 被Ca2+所取代而形成由多价离子交 联的离子网络凝胶。
在1971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定 化酶的统一英文名称为Immobilized enzyme。
随着固定化技术的发展，出现固定化菌体 。1973年， 日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬 氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。
在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了 固定化细胞技术。 1976年，法国首次用固定化酵母细 胞生产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产 淀粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。
缺点： 1.固定化过程中往往会引起酶的失活 2.固定化酶在化学催化反应中存在空间位阻
2 固定化酶的研究历史
固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的 Grubhofer 和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉 酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。
60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的 千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。
酶和细胞固定化的模式
吸附法
利用各种固体吸附剂将酶或含 酶菌体吸附在其表面上，而使酶固 定化的方法。
常用的固体吸附剂有活性炭、 氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔 玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。
操作简便，条件温和，不会引 起酶变性失活，载体廉价易得，而 且可反复使用。
由于靠物理吸附作用，结合力 较弱，酶与载体结合不牢固而容易 脱落，所以使用受到一定的限制。
共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结
合法。共价键结合法所采用的载体主要有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖 凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。 酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基 和咪唑基等。要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化，
颗粒大小可实时监控
脂质体包裹酶
结合法
选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起 的固定化方法。
根据酶与载体结合的化学键不同，可分为：
离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子 键结合法。离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换 剂。常用的有DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。
酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系 统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力， 也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高， 而且难于连续化生产。
产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给 产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。
固定化技术
Contents of chapter 5
Go 1、什么是固定化技术和固定化酶 Go 2、固定化酶的研究历史 Go 3、酶的固定化技术 Go 4、固定化酶的特点 Go 5、固定化酶的应用
6、细胞、原生质体的固定化，自学
1 什么是固定化酶？
水溶性酶
水不溶性载体
固定化技术 水不溶性酶 （固定化酶）
交联法
借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固 定化酶的方法。
常用的双功能试剂有戊二醛、 己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶 氮苯等。其中应用最广泛的是 戊二醛。
戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反 应，形成席夫（Schiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定 化酶或固定化菌体。