一种简便_快速的大肠杆菌质粒转化方法
(完整word版)质粒的转化(热激法)
实验四质粒的转化质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。
可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。
实验目的：掌握热激法或电转化法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方法。
实验材料：外源片段与载体的连接产物；大肠杆菌感受态细胞。
实验原理：（1）热激法：大肠杆菌在0℃ CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。
在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。
（2）电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于孔DNA等大分子进入。
同时DNA在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。
热激法转化实验步骤：1．制备选择性培养基平板：在融化的250ml LB固体培养基中（冷却止55摄氏度以下）加入Amp至终浓度50μg/ml，混匀后倒入灭菌培养皿中；2．取出1管制备好的感受态细胞，放在冰上融化；3．每100μl感受态细胞加入约20ng质粒DNA，轻轻混匀，在冰上放置30分钟；4．热击：将离心管放置42℃水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管；5．冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置1－2分钟；6．复苏：每管加400 μl LB培养基，在37℃摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复苏；7．布皿：取适当体积均匀涂布于含有、抗生素（Amp）的LB平板；8．培养：倒置培养皿，于37℃培养12－16小时即可观察到白色的菌落，即为转化子。
质粒DNA转化感受态大肠杆菌的方法
质粒DNA转化感受态大肠杆菌的方法实验原理利用CaCl2处理感受态体细胞，然后通过热休克处理，即置于42℃高温热激90秒，热休克后，需要使受体细胞在不含有抗生素的培养液中生长至少半小时以上，使其表达足够的蛋白，以便能在含有抗生素的平板上生长菌落。
试剂与器材1.LB液体培养基10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCl加水至1L，高压灭菌消毒。
2.LB固体培养基LB液体培养基中加1.5%琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手背时铺培养皿。
3.0.1mol/L CaCl2高压灭菌消毒或过滤除菌。
4.氨苄青霉素用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml溶液，置-20℃保存。
5.质粒6.大肠杆菌DH5α 此为DNA扩增菌7.恒温水浴箱8.超净工作台9.高速冷冻离心机10.恒温摇床11.恒温箱12.消毒离心管13.消毒tips 14.玻璃培养皿直径90mm 15.玻璃涂布器16.95%乙醇17.标记笔实验方法与步骤1、制备含有Amp抗生素的LB平板，终浓度为50ug/ml2、取一个1.5ml离心管，加入100μl感受态细胞悬液，置冰上：加入20ul 质粒T+G(提取的质粒DNA稀释500X)，用移液器轻柔混匀。
冰上静置20min。
3、42℃水浴中热激90秒，然后迅速置冰上3~5min。
整个过程不要振荡菌液。
4、加入1ml LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养(180rpm)1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因。
5、取100ul菌液，至含有抗生素Amp的LB固体培养基上，涂布均匀。
6、待菌液被培养基吸收后，37℃倒置培养12~16小时，菌落生长良好而又未互相重叠时，取出。
7、计算转化率8、统计每一个培养皿中的菌落数。
9、转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下：10、转化子总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积;11、转化频率(转化子数/μg质粒DNA)=转化子总数/质粒DNA加入量(μg)2．DNA重组子的转化大肠杆菌DH-5α：（实验流程如下所示）100ul感受态细胞DH-5α+重组质粒───→轻轻旋转混合───→冰上放置30min───→42 ℃,热激120S───→冰浴2min───→400ulLB培养基───→37℃, 50r/min振摇45min───→取200ul涂布于含Amp琼脂板───→室温放置，使液体吸收───→37℃倒置培养12~16h冻融法质粒DNA转化至大肠杆菌操作步骤1. 取100μl感受态细胞于冰浴上融化。
大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化[荟萃知识]
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行业知识
• CaCl2 法是目前常用的感受态细胞制备方 法，简便易行，且其转化效率完全可以 满足一般实验的要求，制备出的感受态 细胞暂时不用时，可加入占总体积15％ 的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此 CaCl2法使用更广泛。
行业知识
③ 彻底弃去上清液，再加入0.6mL冰冷的 0.1mo1／L CaCl2溶液缓和悬菌，冰浴10 min ； ④ 4000r／min离心10min； ⑤ 弃去上清液，加入0.2mL冰冷的0.1mo1/L CaCl2溶液缓和悬菌，冰上放置待用。
行业知识
• 质粒DNA的转化
① 分别用2个100µl感受态细胞悬液(如是冷 冻保存液，则需化冻后马上进行下面操 作：
大肠杆菌感受态细胞的制备 与质粒DNA的转化
行业知识
• 实验目的 • 实验原理 • 实验试剂 • 实验步骤 • 注意事项
行业知识
一、实验目的
• 了解转化的概念及其在分子生物学研究 中的意义。
• 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞 的方法。
• 学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并 筛选转化体的方法。
行业知识
四、实验步骤
• 大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)
①从E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于LB 液体培养基中，37℃振荡培养过夜。将该菌悬液 以1:30～100接种于LB液体培养基中，37℃ 250r/min活化培养2-3h至OD600=0.2-0.4时停止培 养;
②每人取1个离心管，加入1.5ml菌液，在冰上放置 10min后，于4℃，4000r／min离心2min（从这一 步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而 稳）；
实验二 质粒DNA转化大肠杆菌
实验二质粒DNA转化大肠杆菌一、实验目的掌握质粒DNA转化大肠杆菌的方法技术二、实验原理转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程，其原理是细菌处于0℃的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA 形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物，粘附于细胞表面，经42℃短时间热击，促进细胞吸收DNA复合物，将细菌放置在培养箱中保温一段时间，促使在转化过程中获得新的表型得到表达，然后将细菌培养物涂在含有Amp的选择培养基中。
三、实验仪器及药品仪器：超净工作台、恒温摇床、制冰机、恒温培养箱、-70℃冰箱、水浴锅材料：大肠杆菌JM109、pUC19质粒、离心管试剂：LB固体培养基、20mg/mL X-gal、20mg/mL IPTG四、实验内容1、取200μL新制备的感受态细胞，加入DNA 2 μL（50 ng）混匀，冰浴30min，同时用pUC19做两个对照。
1）受体菌对照：200μL感受态细胞+ 2 μL 无菌水2）质粒对照：200μL 0.1mol / L CaCl2溶液+ 2 μL 质粒DNA2、将管放在42℃水浴90s。
3、立即冰浴2 min。
4、每管中加入800μL 的LB液体培养基，培养45min~60min（140rpm）。
5、向两个转化平板中先加入40μL IPTG，再加入40μL X-gal，并用灭过菌的涂布棒将这两样药品涂满平板。
6、然后将适当体积（100μL）转化的感受态细胞涂匀平板。
7、倒置平皿37℃培养12~16 h，出现菌落。
五、实验结果各实验组观察并记录皿内菌落大的生长状况并进行结果分析。
六、思考题如何提高转化率？。
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序
质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序一、感受态细菌制备（CaCl2法）1. 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于5ml不加Amp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜（200r/min，至OD=1.5左右）。
2. 取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50ml的LB的三角烧瓶（1%）中，37℃条件下振荡培养2~2.5小时左右（200r/min），使OD600达到0.2~0.4左右（100μl 测600nm时OD值）。
3. 将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中，每管10ml，冰上放置10min，4. 4℃条件下，4000r/min离心10分钟，弃上清。
将离心管倒扣在吸水纸上，尽量倒尽管中的培养基。
5. 每管加入预冷的0.1mol/l CaCl2溶液2ml，用枪轻轻吹打，重悬沉淀。
转移到一个离心管中，共8ml。
6. 冰上放置10min后，4℃条件下，4000r/min离心10min。
7. 沉淀用预冷的1.6ml 含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液悬浮。
分装成200μl 的小份，共8管（40ml变为1.6ml浓缩25倍），-70℃保存备用。
二、溶液的配置1. LB培养基：1%蛋白胨（typtone）、0.5%酵母提取物（yeast extract）、1%NaCl，即10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH 调PH至7.0，在补足水至1L。
高压灭菌20分钟备用。
2. 0.1mol/l的CaCl2溶液：1.1g/100ml，称取1.1g CaCl2，加入双蒸水定容至100ml，滤膜过滤或高压灭菌，分装成10ml/小份，4℃保存。
另取8.5ml+1.5ml已灭菌甘油，甘油含量为15%甘油，分装成1ml/小份（10份）4℃保存。
3. 配置液体培养基时，高压灭菌20min备用；4. 配置固体培养基时+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min。
大肠杆菌化转感受态制备
大肠杆菌化转感受态制备大肠杆菌是一种常见的革兰氏阴性杆菌，具有广泛的生物学功能和应用价值。
化转感受态制备是一种常用的方法，通过改变大肠杆菌的遗传物质，使其表达特定的转基因产物。
本文将介绍大肠杆菌化转感受态制备的原理、方法以及应用。
一、大肠杆菌化转感受态制备的原理大肠杆菌化转感受态制备是利用大肠杆菌的自然特性和遗传工程技术，将外源DNA导入大肠杆菌细胞内，并使其稳定表达。
大肠杆菌细胞通过自身的DNA复制和转录机制，将外源DNA整合到自身的基因组中，从而使外源基因在大肠杆菌中得以表达。
1. 质粒转化法：将质粒DNA与大肠杆菌细胞一起处理，使质粒DNA 进入大肠杆菌细胞内，并通过质粒DNA上的选择标记基因筛选转化成功的细胞。
2. 噬菌体转染法：利用噬菌体作为载体，将外源DNA导入大肠杆菌细胞内，并通过噬菌体的复制和感染机制，使外源DNA稳定表达。
3. 电穿孔法：利用高压电脉冲使大肠杆菌细胞膜发生破裂，外源DNA得以进入细胞内，并通过细胞自身的修复机制，使外源DNA稳定表达。
4. 钙离子转化法：利用钙离子与外源DNA形成复合物，通过渗透作用使其进入大肠杆菌细胞内，并通过细胞自身的代谢机制使外源DNA稳定表达。
三、大肠杆菌化转感受态制备的应用1. 蛋白表达：通过将目的基因导入大肠杆菌细胞内，使其表达目的蛋白，广泛应用于基因工程、生物制药等领域。
2. DNA克隆：利用大肠杆菌的高效复制和转录机制，将目的DNA片段插入质粒中，并通过质粒在大肠杆菌中的复制和传递，实现DNA 的克隆和扩增。
3. 突变分析：通过外源DNA的插入、缺失或替换，研究大肠杆菌基因的功能和调控机制，为进一步研究生物学问题提供重要工具。
4. 基因敲除和敲入：通过将外源DNA的特定片段插入大肠杆菌基因组中，实现对目的基因的敲除或敲入，研究基因功能和调控网络。
5. 抗生素筛选：利用大肠杆菌对抗生素的敏感性，通过将目的基因导入大肠杆菌中，筛选抗生素抗性基因。
大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA转化
实验十七大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒DNA转化在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但在人工构建的质粒载体中，一般缺乏此种转移所必需的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
一、实验目的1、通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。
2、了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。
二、实验原理转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ，Mˉ)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法，CaCl2 ，RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaCl2 法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此CaCl2法为使用更广泛。
DNA分子转化分以下几步：1．吸附：双链DNA分子吸附于受体菌表面；2．转入：双链DNA分子解链。
一条链进入受体菌，另一条降解；3．自稳：外源质粒DNA分子在细胞内复制成双链；4．表达：供体基因随同复制子同时复制，分裂，转录翻译。
将重组质粒导入大肠杆菌的方法
将重组质粒导入大肠杆菌的方法
将重组质粒导入大肠杆菌有多种方法，其中包括化学转化、电转化和共转化等。
1. 化学转化：通过将重组质粒与大肠杆菌细胞一起暴露在一种化学溶液中，使细胞发生渗透增强，从而使质粒能够进入细胞。
常用的化学转化方法有钙离子诱导法、聚乙二醇法等。
2. 电转化：通过利用强电场作用，使质粒能够通过细胞膜进入细胞。
将含有重组质粒的细胞与电极片一起置于电场中，施加脉冲电压，使细胞膜发生破裂，从而实现质粒的导入。
3. 共转化：将含有重组质粒的细胞与另一种质粒（例如载带质粒）一起转化，使质粒通过共转化机制进入细胞。
在共转化过程中，载带质粒的存在可以提高重组质粒的转化效率。
以上是常用的将重组质粒导入大肠杆菌的几种方法，具体使用哪种方法取决于实验需求和条件。
一种优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法
一种优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法一、本文概述随着生物技术的快速发展，大肠杆菌作为常用的基因工程受体菌，其感受态细胞的制备及转化方法对于基因克隆、表达以及基因功能研究等领域具有至关重要的意义。
传统的感受态细胞制备及转化方法往往存在转化效率低、细胞活性不稳定等问题，优化大肠杆菌感受态细胞的制备及转化方法成为当前研究的热点。
本文旨在介绍一种经过优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法，旨在提高转化效率，保证细胞活性，并简化操作步骤，为相关领域的研究提供更为可靠、高效的实验手段。
二、材料与方法1 大肠杆菌菌株：选用的大肠杆菌菌株应具备易于转化、生长迅速且遗传背景清晰的特性。
（1）从LB平板上挑取单菌落，接种至5ml LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床培养过夜。
（2）次日，按1:100的比例将菌液转接至新鲜的LB液体培养基中，继续培养至OD600达到4-6。
（3）将菌液冰浴10分钟，然后4℃、4000rpm离心10分钟，收集菌体。
（4）弃去上清液，用预冷的1M CaCl₂溶液重悬菌体，冰浴30分钟。
（5）再次4℃、4000rpm离心10分钟，收集菌体，并用预冷的含15%甘油的1M CaCl₂溶液重悬菌体。
（6）将感受态细胞分装至无菌的EP管中，每管50μl，液氮速冻后存于-80℃冰箱备用。
（2）向感受态细胞中加入适量的质粒DNA（或连接产物），轻轻混匀，冰浴30分钟。
（4）向EP管中加入500μl LB液体培养基，37℃、200rpm摇床复苏45分钟。
（5）将复苏后的菌液涂布于含有相应抗生素的LB平板上，37℃培养箱倒置培养过夜。
为了提高转化效率，我们在传统的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法上进行了以下优化：（1）在菌液OD600达到4-6时进行感受态细胞的制备，此时菌体处于对数生长期，活性较高，有利于后续的转化。
（2）在制备感受态细胞时，使用预冷的1M CaCl₂溶液进行重悬，并在其中加入15%的甘油，以提高细胞的稳定性并防止冰晶形成。
一种快速简便高通量筛选重组克隆的方法
１ １ １ 质粒和菌株 转化试 验平板 由南 阳师 范学院陈吉 宝 ．． 博士惠赠 ， 该转化 试 验是 在 Ｔ—ｅｓ ａｙ载体 上 连接 大豆 ｃ Ｎ ＤＡ
片 段 ， 化 大 肠 杆 菌 Ｄ ５ 转 Ｈ。 １ １２ 试 剂 ．．
１２ ． 方 法
１ Ｓ Ｓ溶 液 为 裂 解 液 ； ａ ａｔ ｉｕｅ ％ Ｄ ２ＸＴｑｍ ｓ ｒｍｘ ｒ， ｅ ｔ
几 百 个 重 组 质 粒 的筛 选 。
关键 词 ： 重组质粒 ；高通量 筛选 ； 一步裂解 ；Ｄ Ａ迁移速率 ； Ｃ Ｎ ＰＲ
中图分 类号 ： ８２ Ｑ １ 文献标 志码 ： Ａ 文章编号 ：０ ２—１０ （ ０ ２ ０ ０４ — ２ １０ ３２ ２ １ ）６— ０ １ ０
随 着各 种生 物试 验 的 大 规 模 开 展 ， 找 一 种 高 通 量 筛 选 寻
来 建 立 了不 少 简 单 快 速 的方 法 ， 些 方 法 都 大 大 缩 短 了 操 作 这
ｌ ｄｎ ｕ ｅ， ｏ ｉｇｂ ｆ ｒ迅速进行 ０ ８ ａ ．％琼脂糖凝胶电泳。 １２ ２ 从单菌落制备质粒 ．． 转化后的平板 ３ ７℃倒置培养过 夜至单菌落 长至 ２～３ｍ 用无 菌小枪头挑 取上述对应 的 ４ ｍ， 个单菌落 ， 加入 １ Ｄ ％Ｓ Ｓ溶 液 ２ ， Ｏ 涡旋混 匀或者 用枪头 吹 打混匀 ， 室温放置 ２ｍｉ，２０ ０ｒｍ ｎ离心 ３ｍｎ 取上清 ； ｎ １ ０ ｉ ／ ｉ， 加 入 ４Ｉ Ｌ６×Ｄ Ａ ｌ ｄｎ ｕ ｅ ， ｘ Ｎ ａ ｉ ｂ ｒ迅速 进行 ０ ８ ｏ ｇ ｆ ． ％琼脂糖 凝胶
江 苏农业科 学 ２ １ ０ ２年第 ４ ０卷第 ６期
董冰雪， 玉英， 李 叶壮清 ， 等．一种快速 简便 高通量 筛选重组克 隆的方法［ ］ 江苏农业科学 ， １ ， （ ）４ — ２ Ｊ． ２ ２４ ６ ：１ ４ ０ ０
大肠杆菌质粒提取 碱裂解法
大肠杆菌质粒提取碱裂解法大肠杆菌质粒提取是一种用于从大肠杆菌中提取质粒的方法。
碱裂解法是其中一种常用的方法，该方法利用碱性条件下DNA的不稳定性，将细胞壁溶解，并使质粒DNA从细胞中释放出来。
本文将介绍碱裂解法的步骤、原理以及优缺点。
碱裂解法的步骤如下：1.大肠杆菌培养：首先从保存在琼脂板上的大肠杆菌菌落中挑取一株菌，接种到含有适量抗生素的LB培养基中，培养过夜，直到菌液呈现较浓的悬浮液。
2.收取大肠杆菌：将培养液离心，除去上清。
用冷凉的纯水冲洗沉淀两次，将菌沉淀重悬于50 mM Tris-HCl缓冲液中，pH 8.0。
3.制备碱性溶液：在50 mM Tris-HCl缓冲液中加入0.2 M NaOH 和1% SDS，混匀制成碱性溶液。
4.碱性裂解：将菌悬液与等体积的碱性溶液混匀，使菌细胞在碱性条件下裂解。
孵育数分钟至十几分钟，直至溶液变为粘稠状。
5.酸性中和：加入等体积的3 M醋酸，酸性中和碱性溶液。
此步骤中，质粒DNA会从溶液中析出沉淀。
6.离心：用高速离心将沉淀离心下来，除去上清。
7.溶解：用适量的纯水将沉淀溶解，可以通过轻轻摇动溶液使其充分溶解。
8.纯化：通过离心或其他纯化方法，如柱层析、琼脂糖凝胶电泳等技术，纯化目标质粒DNA。
碱裂解法的原理是利用碱性条件下DNA的不稳定性。
当细胞处于高pH环境中时，碱性条件会破坏大肠杆菌的外膜，使细胞壁失去完整性。
此时，细胞内的DNA易于释放出来，包括质粒DNA。
然后，通过酸性中和反应将质粒DNA沉淀下来。
最后，通过纯化步骤，可以得到高纯度的质粒DNA。
碱裂解法的优点是简单易行，不需要较昂贵的设备和试剂，并且可以在相对短的时间内提取到目标质粒DNA。
此外，这个方法适用于大多数质粒类型和质粒大小。
碱裂解法适用于小规模提取或初步提取，用于大规模提取时效率较低，不推荐使用。
然而，碱裂解法也存在一些缺点。
首先，该方法提取到的DNA含有RNA、蛋白质和其他污染物。
质粒转化大肠杆菌
本次实验中，我们采用了优化的转化条件，并获得了较高的转化效率，具体数据见下表。
阳性克隆筛选与鉴定
阳性克隆定义
筛选方法
鉴定方法
实验结果
阳性克隆是指成功导入目标质 粒并表达出目标蛋白的大肠杆 菌细胞。
常用的筛选方法包括抗性筛选 、颜色筛选和PCR筛选等。本 次实验采用了抗性筛选和PCR 筛选相结合的方法。
对筛选出的阳性克隆进行进一 步鉴定，通常采用PCR扩增、 测序和蛋白表达等方法。本次 实验中对阳性克隆进行了PCR 扩增和测序鉴定。
经过筛选和鉴定，我们成功获 得了多个阳性克隆，具体数据 见下表。
数据分析与解读
数据统计
对实验数据进行统计和分析，包括转化效率、阳性克隆数、目标蛋白表达量等 指标。
改进方向
将菌液冰浴30分钟，使细胞停止生长并处于感受态。
实验步骤
将菌液分装到预冷的离心管中， 离心收集菌体，弃去上清液。
加入预冷的转化缓冲液（如 CaCl2溶液），轻轻悬浮菌体，
冰浴30分钟。
再次离心收集菌体，弃去上清液 ，加入适量的预冷转化缓冲液， 轻轻悬浮菌体，即为感受态细胞
。
实验步骤
01
2. 质粒转化
01
在特定条件下，如钙离子处理，质粒DNA能被导入大肠杆菌细
胞。
质粒DNA的复制与表达
02
进入大肠杆菌细胞后，质粒DNA利用宿主细胞的复制系统进行
复制，并表达其携带的基因。
质粒与宿主细胞的相互作用
03
质粒上的基因可能影响宿主细胞的表型，同时宿主细胞的基因
组也可能影响质粒的复制和稳定性。
03
实验材料与方法
提高转化效率的技巧
优化质粒与感受 态细胞的比例
碱裂解法抽提大肠杆菌质粒
移液器及吸头 漩涡混合器
03
实验步骤
菌体培养
菌体培养是碱裂解法抽提大肠杆菌质 粒的第一步，需要将大肠杆菌接种在 适量的培养基中，在适宜的温度下进 行培养，使菌体生长至对数生长期。
培养过程中，需要控制温度、pH和培 养时间，以确保菌体生长良好且无杂 菌污染。
菌体收集
当菌体生长至对数生长期后，需要将 菌体收集起来，以便进行后续的实验 步骤。
碱裂解法抽提大肠杆 菌质粒
目 录
• 实验原理 • 实验材料 • 实验步骤 • 结果与分析 • 结论与讨论
01
实验原理
碱裂解法介绍
碱裂解法是一种常用的质粒抽提 方法，通过改变细胞壁和细胞膜 的性质，使质粒DNA从染色体
DNA中分离出来。
在高pH值条件下，细胞膜和染 色体DNA的双螺旋结构被破坏，
聚丙烯酰胺凝胶电泳
对于较小片段的质粒，可采用聚丙烯 酰胺凝胶电泳进行检测，该方法分辨 率更高。
质粒结构与功能分析
01
质粒电泳图谱分析
通过比较标准质粒和提取质粒的 电泳图谱，分析提取质粒的分子 量大小及可能缺失的片段。
02
限制性内切酶分析
03
基因测序验证
利用限制性内切酶对质粒进行酶 切，通过电泳检测酶切产物，判 断质粒的结构。
形成不可逆的变性，而质粒 DNA则保持稳定。
通过离心分离，染色体DNA和 细胞膜等大分子物质被沉淀，而
质粒DNA则留在上清液中。
大肠杆菌质粒介绍
01
大肠杆菌质粒是一种小型环状DNA分子，可以自主 复制和遗传。
02
质粒携带特定的基因，赋予宿主细胞某些表型特征， 如抗生素抗性或代谢特性。
03
大肠杆菌质粒是基因工程中常用的载体，用于克隆 和表达目的基因。
质粒转化大肠杆菌
质粒具有宿主独立性，即可以在宿主细胞中稳定复制，且具有多态性，即不同质粒具有不同的遗传特征。
特于革兰氏阴性菌，具有鞭毛和菌毛等结构，是人类肠道中的正常菌群之一。
特点
大肠杆菌具有生长速度快、培养简单、遗传背景清楚等特点，因此被广泛应用于基因工程和生物研究中。
表达水平检测
基因表达分析
05
质粒转化大肠杆菌应用与前景
克隆鉴定
质粒转化大肠杆菌被广泛应用于基因克隆和鉴定研究中，因为大肠杆菌是基因表达效率较高的宿主菌之一，可以快速、准确地鉴定目的基因的功能和表达产物。
基因表达
通过将目的基因插入到质粒中，再将质粒转化到大肠杆菌中，可以实现目的基因的高效表达，为研究基因功能和生产重组蛋白药物等提供了有力支持。
培养基成分与添加剂
04
质粒转化大肠杆菌实验结果分析
转化效率定义
转化效率是指外源DNA导入受体细胞并实现稳定遗传的频率。在大肠杆菌转化实验中，转化效率是指每微克质粒DNA能够成功转化大肠杆菌的菌落数。
转化效率评估
影响因素
转化效率受到多种因素的影响，如质粒DNA的质量和浓度、受体菌的生理状态、转化条件等。
03
质粒转化大肠杆菌影响因素
感受态细胞制备方法
细胞生长状态
培养温度与时间
感受态细胞制备方法与条件
质粒浓度过高可能导致细胞死亡，降低转化效率；质粒浓度过低则可能导致转化效率下降。
质粒浓度
质粒纯度对转化效率也有影响，高纯度的质粒可以提高转化效率。
质粒纯度
质粒浓度与纯度
VS
大肠杆菌转化最适宜的温度为42°C左右，温度过高或过低都可能影响转化效率。
在含有抗生素的培养基中培养大肠杆菌，筛选出成功转入质粒的菌落。
快速提取质粒检测转化子
快速提取质粒检测转化子溶液I：50mM葡萄糖25mM TrisHCl（PH=8.0）10mM EDTA（PH=8.0）溶液II：（现用现配）0.2MNaOH1%SDS PH=7.2溶液III：5M乙酸钾11.5%的冰乙酸1。
选取单菌落，编号，挑取半个菌落，接种于10ml含25ml/LG418的LB培养基中，振荡培养过夜。
2。
取1.5ml菌液，装入离心管中，7000r/min离心2分钟。
3。
去上清，把沉淀重悬于100ul的溶液I中。
4。
加200ul的现配溶液II，轻轻混匀，冰浴5分钟。
5。
加入150ul溶液III，混匀。
6。
12000r/min离心15分钟。
7。
吸取上清，用酚，酚/氯仿（1：1）和氯仿等体积分别抽提一次。
8。
加2倍体积的无水乙醇，混匀后放入-20℃放置30分钟。
9。
12000r/min离心15分钟。
10。
去上清，把沉淀物吹干，加入20ul水溶解。
10ul，保存于4℃冰箱。
11。
酶切，电泳，对照基因图谱进行鉴定。
12。
确定已经转化了的单菌落。
挑取另一半菌落，接种于液体LB（25mg/LG418）中，37℃振荡培养过夜。
取出700ul，加入等体积的甘油，贮存在-70℃长期保存。
LB培养基（大肠杆菌）：NaCl 10g/L酵母提取物5g/L蛋白胨10g/L琼脂15g/L1。
以DH5a为受体菌，挑取DH5a单菌斑，接种于5mlLB培养基中，在37℃下振荡培养过夜。
2。
取出0.2ml转入50mlLB培养基中，在37℃下振荡培养2.5小时。
3。
在4℃下，以4000r/min离心10分钟。
4。
去上清液，将菌体悬浮于25ml100mM的CaCl2溶液中，冰浴20min，在4℃下，4000r/min 离心10分钟。
5。
去上清液，再将菌体悬浮于0.5ml100mM的CaCl2溶液中，分装100ul，贮存在-70℃保存备用。
6。
取感受态细胞100ul，置冰上5分钟。
7。
加入1ul质粒DNA（0.5ug/ul），混匀，冰浴30分钟。
质粒导入大肠杆菌的方法
质粒导入大肠杆菌的方法
1.制备大肠杆菌感受态细胞，将其培养至对数生长期。
2. 用无菌PBS或无菌水将质粒转化至电击装置中，设置适当的电击参数。
3. 将大肠杆菌感受态细胞转移到电击器中，并进行电击处理。
电击后将细胞立即转移到预先加热的SOC培养基中。
4. 在SOC培养基中将细胞恢复2小时后，取适量菌液涂布在含有适量抗生素的LB平板上进行筛选。
5. 鉴定阳性克隆，并进行质粒提取和酶切鉴定。
这种方法简单易行，可高效地导入质粒至大肠杆菌中，是常用的基因工程和分子生物学实验方法。
- 1 -。
质粒转化大肠杆菌
结构特点
质粒大小通常在1-200kb之间， 具有一个或多个复制起点，以及 可选的抗生素抗性基因、荧光蛋 白基因等。
大肠杆菌特性及作用
大肠杆菌特性
大肠杆菌是一种革兰氏阴性菌，属于 肠杆菌科。它生长迅速、营养要求简 单，是生物学研究中常用的模式生物 。
长情况。
实验结果观察与记录要求
菌落计数
记录平板上生长的菌落数量，计算转化效率。
菌落形态观察
观察菌落的形态、大小、颜色等特征，记录异常菌落情况。
质粒DNA验证
挑取单菌落进行PCR验证或测序验证，确保质粒DNA已成功转化入大肠杆菌中。
实验记录与报告
详细记录实验过程、结果及数据分析，撰写实验报告并存档。
转化过程
质粒转化是指将外源质粒DNA导入大肠杆菌细胞内，并使其在细胞内复制、表达的过程 。
转化方法
常用的质粒转化方法包括化学转化、电穿孔转化和基因枪法等，其中化学转化法最为常用 ，其原理是利用化学物质处理细胞，使其暂时处于能接受外源DNA的状态。
PART 02
质粒与大肠杆菌
质粒定义及结构特点
质粒定义
感谢观看
实验步骤与操作规范
前期准备工作及注意事项
实验材料准备
01
准备好大肠杆菌感受态细胞、质粒DNA、LB培养基、抗生素、
无菌水等实验所需材料。
实验室环境准备
02
确保实验室环境干净、整洁，实验台面无菌，实验器皿和试剂
均经过高压蒸汽灭菌处理。
安全防护
03
穿戴好实验服、手套和口罩，避免皮肤直接接触有害物质，确
作用
大肠杆菌在基因工程、蛋白质表达和 生物制造等领域具有广泛应用，如生 产重组蛋白、药物前体、工业酶等。
质粒转化大肠杆菌
质粒的结构与功能
质粒是一种裸露的、独立于细菌染色 体外并具有自我复制能力的双链环状 DNA分子。
质粒在细菌中发挥着重要的遗传调控 作用，可以促进细菌的进化与适应环 境。
质粒携带特定的基因，赋予细菌某些 表型特征，如抗性、代谢性、致病性 等。
大肠杆菌的遗传特性
大肠杆菌是一种常见的革兰氏阴 性细菌，具有多种遗传特性，如
抗性、代谢性、致病性等。
大肠杆菌的染色体和质粒共同构 成其基因组，调控其生命活动和
适应性。
大肠杆菌的基因组相对较小，易 于进行遗传操作和基因工程研究
。
转化过程的分子机制
转化过程是指将外源DNA分子导 入受体细胞，并使其获得新的遗
传特性的过程。
在大肠杆菌中，转化过程主要依 赖于细胞表面的受体蛋白与外源 DNA分子的结合，以及DNA分
质粒转化反应
将转化后的细胞在合适的选择培 养基上培养，筛选出转化子。
转化细胞的筛选与鉴定
转化细胞的筛选
在选择培养基上，通过观察菌落的生 长情况，筛选出含有目的质粒的转化 子。
转化细胞的鉴定
通过PCR、酶切等分子生物学方法对 转化子进行鉴定，验证目的质粒是否 成功转化到大肠杆菌中。
04
转化效率的影响因素及优化策 略
转化子基因表达水平的检测
基因表达水平的定量分析
通过qPCR、Western blot等技术手段，对转化子中的目的基因表达水平进行定 量分析，了解转化子中目的基因的表达情况。
基因表达谱的比较
将转化子与未转化子的基因表达谱进行比较，找出差异表达的基因，分析转化对 基因表达的影响。
转化子稳定性的评估
转化子的稳定性检测
感受态细胞制备
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遗传HEREDITAS(Beijing)21(4):48～511999・技术与方法・一种简便、快速的大肠杆菌质粒转化方法①郭培懿, 陈向东, 谢志雄, 沈 萍(武汉大学生命科学学院,湖北武汉430072)摘 要: 将受体菌与质粒DNA混匀直接在Ca2+离子选择平板上进行转化和筛选,其转化过程仅需2 min左右,并能得到105以上的转化效率,可满足一般克隆工作的需要。
关键词: 转化;大肠杆菌;Ca2+选择平板中图分类号: Q933,Q931039 文献标识码: B 文章编号: 0253-9772(1999)04-0048-51A Simple and R apid Method for the T ransformationof Escherichia coli by PlasmidsGUO Pei-yi, CHEN Xiang-dong, XIE Zhi-xiong, SHEN Ping(College of Life Sciences,Wuhan University,Wuhan430072,China)Abstract: After mixing the recipient cells and plasmids DNA,directly spread the mixture on selective media containing Ca2+1The whole process of transformation just needs2min or so,and could acquire the transformation efficiency of more than105,which is enough to common gene cloning1K ey w ords: Transformation;Escherichia coli;Ca2+selective plate转化是分子克隆中将外源DNA导入受体细胞的关键技术,自1970年Mandel和Higa发现用CaCl2处理的细菌细胞可被λ噬菌体DNA转染后〔1〕,接着在1972年和1973年C ohen等人用同样的方法首次成功地将R因子和重组质粒DNA导入大肠杆菌细胞(Escherichia coli)〔2,3〕,而成为基因工程的创始人。
此后在转化技术上虽有过不少的改进,但都旨在如何提高转化效率上〔4～6〕,自70年代中期以来,使“转化效率作为分子克隆中限制因素的时代已一去不复返了”〔7,8〕。
但就方法本身而言一直没有大的变化,而是作为一种常规转化技术一直沿用至今〔8～10〕。
该转化技术主要由三部分组成〔8〕:(1)用CaCl2诱导受体细胞使其成为“感受态”;(2)DNA转化受体细胞;(3)涂布平板筛选转化重组子。
一般至少需要2h完成。
我们这里介绍一种十分简便迅速的质粒平板转化方法,该方法删除了常规方法中十分费时、繁杂的(1)和(2)二部分的操作,而是直接在Ca2+选择平板上一次完成,整个过程仅需2min左右,转化效率与常规方法相当,足以满足一般克隆工作的需要。
1 材 料 和 方 法111 菌株大肠杆菌(E1coli)TG1、HB101、DH5α,本实验室保存。
112 质粒①收稿日期:1998-11-03;修订日期:1999-02-01基金项目:国家自然科学基金(39670397)资助项目。
作者简介:郭培懿(197711-),女,湖北武汉人,1995级本科生,专业:微生物遗传学。
pBR322购自华美生物工程公司;重组质粒pJ H由本实验室构建〔11〕;枯草杆菌-大肠杆菌穿梭重组质粒pBE2,中科院微生物学研究所郭兴华先生馈赠〔12〕。
113 试剂、培养基及主要缓冲液Bacto-Tryptone及Y east extract为英国Oxiod公司生产;氨苄青霉素由华北制药厂生产;RNase、Protease K、B am HI、DNA Marker等均购自华美生物工程公司;其它化学试剂均为分析纯产品。
LB培养基及用于质粒提取、检测的各种缓冲溶液均参照Sambrook等的方法配制〔8〕,而用于平板转化的C a2+选择平板是在LB固体培养基加入单独灭菌的C aC l2和氨苄青霉素(终浓度分别为100mmol/L和100mg/ml)。
114 实验方法质粒的提取、纯化、酶切、琼脂糖凝胶电泳等均参照文献〔8〕。
传统的CaCl2处理转化方法参见文献〔8〕略做修改:(1)CaCl2处理法制备感受态大肠杆菌:挑取受体菌单菌落接种于5ml LB培养液,37℃培养过夜,以1/100量接种于LB培养基活化至OD600=014～016。
取菌液1ml,冰浴10min,4℃12000r/min离心20～30s收集菌体,弃上清,重悬于1ml经预冷的100mmol/L CaCl2中,冰浴20～40min,4℃12000r/min离心20～30s收集菌体,弃上清,重悬于012ml经预冷的100mmol/L CaCl2中,冰浴2～7h;(2)转化:将10μl质粒DNA(1ng/μl)与200μl感受态细胞溶液混匀,经冰浴20～40min、42℃水浴3～4min、冰浴1～2min处理后,加等体积2倍LB培养液,37℃水浴温育1h;(3)转化子的检测:涂布20μl 转化混合物于加相关抗生素的LB选择平板,37℃倒置培养约20h,筛选转化子。
平板转化法:挑取受体菌单菌落接种于5ml LB培养液,37℃培养过夜,以1/100量接种于LB培养基活化2～3h(OD600015～0155),取菌液1ml,12000r/min离心20～30s收集菌体,重悬于200μl LB培养液,加入10μl质粒DNA(1ng/μl),混匀,取20μl转化混合物涂布于4℃下预冷的含Ca2+和相关抗生素的选择平板,37℃倒置培养约20h,筛选转化子。
2 结 果 与 分 析211 平板法与传统的C aCl2处理方法的转化效率将质粒pBR322分别用二种方法转化经常用的三种大肠杆菌受体菌株TG1,HB101和DH5α,结果(表1)显示,新方法所能达到的转化效率与传统方法相当,可达105转化子/μgDNA,足以满足一般常规克隆的需要。
为了进一步证实新方法的适用性,我们又将不同的质粒分别转化同一受体菌。
这些质粒包括松弛型质粒pBR322,带有古细菌启动子的重组质粒pJ H,以及穿梭质粒pBE2。
表2显示用TG1为受体的转化效率比较,其结果表明新方法对所用的三种质粒均显示出与传统方法相当的转化效率,以其它菌株为受体也获得类似的结果,说明该方法具有很好的适用性。
表1及表2中的数据均为3次独立实验结果的平均值。
表1 二种转化方法对不同受体菌株的转化效率比较菌 株传统方法的转化效率(平均转化子数/μg DNA)平板转化法的转化效率(平均转化子数/μg DNA)TG1 HB101 DH5α511×105413×105118×1051184×105211×1050189×105表2 二种转化方法对不同质粒DNA的转化效率比较质 粒传统方法的转化效率(平均转化子数/μg DNA)平板转化法的转化效率(平均转化子数/μg DNA)pBR322 pJ H pBE2511×105416×1050194×1051184×105119×105110×105944期郭培懿等:一种简便、快速的大肠杆菌质粒转化方法212 转化子的检测任意挑取34个用新方法转化所得到的转化子进行质粒检测,均能检测到质粒,而且酶切结果(图1)也显示,不同转化子所携带质粒的大小及酶切位点均完全与原转化质粒DNA 相同,说明所采用的平板转化方法具有与传统转化方法相同的质粒转化特点〔13〕。
此外,用从转化子中提取的质粒,采用新方法重新转化受体菌,仍可以获得相似的转化结果,说明采用新方法对质粒的转化活性也无影响。
图1 新方法转化子质粒及其酶切的凝胶电泳检测213 C a 2+浓度对转化率的影响Ca 2+浓度是影响转化的重要因素〔8〕,为了找到Ca 2+选择平板中最适的Ca 2+浓度,我们以不同Ca 2+浓度的选择平板进行了pBR322转化大肠杆菌TG 1的实验。
结果(图2和表3)表明,平板转化和传统方法一样需要通过Ca 2+的处理促使细胞建立感受态才能进行有效的质粒DNA 转化〔8〕,并随着转化体系中Ca 2+浓度的增加,转化效率逐渐升高,在Ca 2+浓度达到80～100mmol/L 时,可以获得最高的转化效率。
而Ca 2+浓度进一步升高,超过120mmol/L 后,转化效率明显下降,这可能与平板中的高离子浓度抑制了细胞的生长有关。
图2 Ca 2+浓度对转化效率的影响表3 C a 2+浓度对转化效率的影响CaCl 2(mmol/L )02040 60 80 100 120140160转化效率(/μg )010052539900128000119000546001200 03 讨 论(1)CaCl 2处理对于诱导大肠杆菌受体细胞“感受态”的形成具有重要作用,在传统的转化方法中,CaCl 2处理及转化都是在液体条件下完成的〔8〕。
而本实验的结果证明,在一定的离子浓度范围内CaCl 2同样可以诱导涂布05 遗 传HEREDITAS (Beijing )199921卷到平板上的受体细胞建立感受态,并进行质粒DNA 的转化。
采用这种平板转化方法所得到的转化子菌落较传统方法形成的转化子菌落略小,说明培养基中的CaCl 2可能在一定程度上对细菌的生长有抑制作用。
(2)在传统的转化方法中转化过程的变温处理被认为对转化率的提高具有重要意义〔8〕。
我们在实验中也发现将受体菌和转化DNA 混合后涂布到事先预冷的平板上比使用未经预冷的平板能得到更高的转化效率,但两者间的差异不超过一个数量级(分别为118×105和310×104转化子/μg DNA ),该现象在Baur 等最近的研究报道中也有反映〔14〕。
(3)本文介绍的质粒转化大肠杆菌的新方法将受体细胞感受态的诱导建立、质粒DNA 转化及转化子的筛选等步骤合并在Ca 2+选择平板上一步完成,与传统方法相比,具有操作简便易行的优点,整个转化过程仅需2min 左右,无需其他特殊仪器及试剂,且转化率与传统方法基本相当,足以满足一般常规克隆的需要。
同时,用平板转化代替液体转化,对进一步揭示大肠杆菌的DNA 转化机理也有一定的方法学上的意义〔14〕。
参 考 文 献:〔1〕Mandel M ,Higa A 1Calcium -dependent bacteriophage DNA infection [J ]1J 1Mol 1Biol 1,1970,53:159～1621〔2〕Cohen S N ,A C Y Chang ,Hsu L 1Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria :G enetic transformation of Escherichia coli byR -factor DNA [J ]1Proc 1Natl 1Acad 1Sci 1,1972,69:2110～21141〔3〕Cohen S N ,A C Y Chang ,H W Boyer ,et al 1Constrruction of biologically functional bacterial plasmids in vit ro [J ]1Proc 1Natl 1Acad 1Sci 1,1973,70:3240～32441〔4〕Dagert M ,Ehrich S D 1Prolonged incubation in calcium chloride improves the competence of Escherichia coli cells [J ]1G ene ,1979,6:23～281〔5〕Norgard M V ,K K eam ,Monahan J J 1Factors affecting the transformation of Escherichia coli strain x1776by pBR322plasmidDNA [J ]1G ene ,1978,3:279～2921〔6〕Hanahan D 1Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids [J ]1J 1Mol 1Biol 1,1983,166:557～5801〔7〕Dower W J ,Miller J F ,Ragsdale C W 1High efficiency transformation of Escherichia coli by high voltage electroporation [J ]1Nu 2cleic Acids Res 1,1988,16:6127～61451〔8〕Sambrook J ,Fritsch E F ,Maniatis T 1Molecular cloing -A laboratory manual (second edition )[M ]1Cold Spring ,Habour ,NewY ork 19891〔9〕G erhardt P ,Murray R G E ,Wood W A ,et al 1Methods for general and molecular bacteriology [M ]1American S ociety for Micro 2biology ,1325Massachusetts Ave 1,N 1W 1Washington ,DC 20005119941〔10〕Krajcikova D ,Hartley R W ,Sevcik J 1Isolation and purification of two novel Streptomycete RNase inhibitors ,Sa I 14and Sa I 20,and cloning ,sequencing ,and expression in Escherichia coli of the gene coding for Sa I 14[J ]1J 1Bacteriol 1,1998,180:1582～15851〔11〕孙广秀,江爱民,沈 萍1具有真细菌基因启动子活性的盐生盐杆菌质粒DNA 片段[J ]1遗传学报,1997,24:380～3841〔12〕郭兴华,熊 占,周 民,等1枯草杆菌-大肠杆菌多功穿梭载体的构建[J ]1生物工程学报,1991,7:224～2291〔13〕Stewart G J 1The Biology of Natural Transformation [J ]1Ann 1Rev 1Microbiol 1,1986,40:211～2351〔14〕Baur B ,K Hanselmann ,Schlimme W ,et al 1G enetic transformation in freshwater :Escherichia coli is able to develop natural compe 2tence [J ]1Appl 1Environ 1Microbiol 1,1996,62:3673～36781154期郭培懿等:一种简便、快速的大肠杆菌质粒转化方法。