黄连素抗氧化活性的研究

清除ＤＭＰＤＨ能力的测定根据Ｆｏｇｌｉａｎｏ等‘９ ３的 方法，稍作修改．将１００ ｍｍｏｌ·Ｌ－１ ＤＭＰＤ溶液和 ０．１ ｍｏｌ·Ｌ～、ｐＨ为５．２５的醋酸盐缓冲液混匀， 加入０．０５ ｍｏｌ·Ｌ＿１的ＦｅＣｌ。溶液启动反应，产生 ＤＭＰＤＨ自由基溶液．取１ ｍＬ ＤＭＰＤ叶溶液， 分别加入不同浓度的黄连素和Ｔｒｏｌｏｘ，２５℃下反 应１０ ｍｉｎ，在５０５ ａｍ处测吸光值．
Ｅ叽气，ｐＨ ８．０）配制质量浓度为０．００８ ｇ·ｍＬ．１
的琼脂糖凝胶．水平电泳后１“ｇ·ｍＬｌ ＥＢ中染 色３０ ｍｉｎ，于凝胶成像分析系统（ＢＴＳ一２０一ＭＵＶＩ） 中观察照相． １．２．３ 蛋白质氧化损伤的实验方法蛋白质氧化测 定按Ｈ．Ｙ．Ｋｗｏｎ等‘７ ３的方法，稍加改进．１０弘ｇ ＢＳＡ溶于０．２ ｍｏｌ·Ｌ叫ＰＢＳ中，由２０ ｍｍｏｌ·Ｌ＿１ ＡＡＰＨ启动氧化反应．检测组在加入ＡＡＰＨ之前 分别加人不同浓度的黄连素和Ｔｒｏｌｏｘ．终体积为 ５０弘Ｌ．３７℃孵育２４ ｈ后，加入１０肛Ｌ质量浓度为 ０．０４ ｇ·ｍＬ＿１的ＢＨＴ终止反应．加入样品缓冲液 ６０弘Ｌ沸水浴２～３ ｍｉｎ后，瞬间离心，从１２０ ｐＬ 体系中取上清液３０肛Ｌ上样，按常规ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 电泳，胶片以考马斯亮蓝Ｒ一２５０染色，脱色后制成 干板照相． １．２．４ ＤＭＰＤＨ法 酸性条件下，ＤＭＰＤ可被 ＡＢＡＰ、ＦｅＣＩ。、ＣｕＣＩｚ、Ｈ：Ｏ：氧化生成稳定有颜 色的ＤＭＰＤ一，它在５０５ ｎｍ处有最大吸收峰．当 加入抗氧化剂时，抗氧化剂能转移１个氢原子给 ＤＭＰＤ一，使其溶液脱色．脱色程度越强，说明 抗氧化剂的抗氧化能力越强．此反应迅速、稳定， ＤＭＰＤＨ的吸光值在室温下１２ ｈ内基本恒定．所 以此方法可用来有效大规模筛选抗氧化剂‘８。．
万方数据
西北师范大学学报（自然科学版）
第４５卷
８８
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）
Ｖ０１．４５
自由基是生物体正常代谢产物，如果自由基产 生过多或清除过慢，则可引起体内自由基浓度升 高．过量的自由基会攻击脂质、核酸和蛋白质等生 物大分子，导致细胞结构和功能破坏．因此，自由 基集聚是人类衰老和许多疾病如肿瘤、心脑血管病 等的重要诱因［１］．寻找能够有效清除自由基而无 毒副作用的抗氧化剂，用于预防和减轻上述疾病的 发生和发展，是生物医学重要的研究课题之一．
比色．脂质过氧化抑制率＝渊×１００％，
其中，Ａ为阴性对照组吸光值；Ａ。为阳性对照组吸 光值；Ａ：为待测样品（黄连素和Ｔｒｏｌｏｘ）组吸光值． １．２．２ ＤＮＡ氧化断裂的实验方法ｐＢＲ３２２质粒 ＤＮＡ主要以超螺旋型存在，当受到氧化损伤断链 时，质粒超螺旋的ＤＮＡ会先打开一条核酸链而解 为环状，当损伤程度进一步加强时，两条核酸链会 被同时打开而线型化，电泳后位于超螺旋和开环之 间Ｌ６］．将１００ ｎｇ的ｐＢＲ３２２质粒ＤＮＡ与溶于 ０．１５ ｍｏｌ·Ｌ＿１ ＰＢＳ的１０ ｍｍｏｌ·Ｌ＿１ ＡＡＰＨ混 匀，使终体积为２５肛Ｌ，３７℃孵育１ ｈ．检测组在 加入ＡＡＰＨ之前分别加入不同浓度的黄连素和 Ｔｒｏｌｏｘ．孵育后立即上样电泳．用ＴＡＥ缓冲液 （４０ ｍｍｏｌ·Ｌ一１ ｒｉｆｆｓ、２０ ｍｍｏｌ·Ｌ一１冰乙酸、２ ｍｍｏｌ·Ｌ一１
脂质过氧化的测定参照文献［５］，稍作修改． １ ｍＬ反应体系中含有３００肛ｇ的微粒体蛋白、 ０．２ ｍｏｌ·Ｌ～ＰＢＳ，０．１ ｍｍｏｌ·Ｌ一１ Ｖｃ和 １０ ｊｕｍｏｌ·Ｌ－１ ＦｅＳ０４启动氧化反应．检测组分别加 入不同浓度的黄连素和Ｔｒｏｌｏｘ．３７℃振荡孵育１ ｈ后， １．０ ｍＬ质量浓度为０．２ ｇ·ｍＬ＿１的三氯醋酸终止反 应，加入硫代巴比妥酸显色，上清液于５３２ ｒｉｍ处
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ。Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００７０，Ｇａｎｓｕ，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ａｎｎｉｎｇ Ｂｒａｎｃｈ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｌａｎｚｈｏｕ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｃｏｍｍａｎｄ，
万方数据
２００９年第６期 ２００９ Ｎｏ．６
刘国安等：黄连索抗氧化活性的研究
Ａ ｓｔｕｄｙ ＯＮ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ
ＤＭＰＤ件清除率＝１一ｚｒｆｆｔｓｏＳ－］×１００％． ／“ｔ－５０５—２
其中，Ａ晰．：为ＤＭＰＤ叶初始浓度的吸光值； Ａｓ州为存在抗氧化剂时剩余ＤＭＰＤ‘十浓度的吸光值．
黄连素具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗心 律失常、降血脂、降血糖、抗血小板聚集等多种药理 作用［２’３］．但有关黄连素抗氧化活性的研究较少．
本研究采用丙二醛（ＭＤＡ）测定、ＤＮＡ电泳技 术、蛋白质凝胶电泳，测定了黄连素对脂质过氧 化、ＤＮＡ和蛋白质的氧化损伤的保护作用．用 ＤＭＰＤ法测定了它清除ＤＭＰＤＨ自由基的能力． 旨在为阐明黄连素的抗氧化机理及其在临床上的进 一步应用提供一定的理论依据．
同的抗氧化体系中抗氧化Ａ损伤；蛋白质氧化；清除ＤＭＰＤ“能力；抗氧化活性
中图分类号：Ｒ ９６３
文献标识码：Ａ
文章编号：１００１－９８８Ｘ（２００９）０６—００８７—０５
Ａ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ
ＬＩＵ Ｇｕｏ—ａｎｌ，ＹＡＮＧ Ｙｕ—ｌｉｎ９１，ＺＨＡＮＧ Ｙａ—ｎａｎｌ，ＷＥＩ Ｚｈａｏ—ｚｈｅｎ９１，ＹＡＮＧ Ｈｏｎ９１， ＤＩＮＧ Ｌａｎｌ，ＣＵＩ Ｌｉ２，ＷＡＮＧ Ｗｅｉｌ
以上所有实验重复３次．
２ 实验结果
２．１ 对脂质过氧化的保护作用 黄连素对脂质过氧化有抑制作用（图１）．
５ ｔｔｍｏｌ·Ｌ－１的黄连素对脂质过氧化已有抑制作 用，随着浓度升高，其抑制作用逐渐增强．比起人 工改造的抗氧化剂Ｔｒｏｌｏｘ，黄连素对脂质过氧的 抑制作用较弱，但当浓度为８０ ｔｔｒｎｏｌ·Ｌ－１时，其 抑制率已达到４５．７％．３２０ ｔＬｍｏｌ·Ｌ－１时，达到 ９５．５％，显示了良好的抗氧化活性．
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图２黄连素和Ｔｒｏｌｏｘ对ＡＡＰＨ引起的 ｐＢＲ３２２ ＤＮＡ链断裂的保护作用
Ｆｉｇ ２ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｓ Ｏｆ ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ ａｎｄ Ｔｒｏｌｏｘ ａｇａｉｎｓｔ ｐＢＲ３２２ ＤＮＡ ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋａｇｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙＡＡＰＨ Ａ ｐＢＲ３２２ ＤＮＡ； Ｂ ｐＢＲ３２２ ＤＮＡ＋１０ ｍｒｒｌｏ卜Ｌ“ＡＡＰＨ： Ｃ～Ｇ １０ ｍｍ０１·Ｌ１ＡＡＰＨ＋ｐＢＲ３２２ ＤＮＡ＋ ５，１０，２０，４０，８０ ｕｔｏｏｌ·Ｌ～ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ； Ｈ－－Ｌ １０ ｍｍ０１．Ｌ＿１ ＡＡＰＨ＋ｐＢＲ３２２ ＤＮＡ＋ ２．５，５，１０，２０，４０“ｍｏｌ·Ｌ＿１ Ｔｒｏｌｏｘ
第４５卷２００９年第６期 Ｖ０１．４５ ２００９ Ｎｏ．６
西北 师 范大 学学报（自然科学版） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ）８７
黄连素抗氧化活性的研究
刘国安１，杨玉玲１，张亚楠１，魏照征１，杨 红１， 丁 兰１，崔 莉２，王 玮１
收稿日期：２００９—０７—０８；修改稿收到日期：２００９—０９一ＩＯ 基金项目：西北师范大学知识与科技创新工程资助项目（ＮＷＮＵ—ＫＪＣＸＧＣ一０３—４９） 作者简介：刘国安（１９６４一），女，河北滦南人，副教授，博士，硕士研究生导师．主要研究方向为生物化学与药理学
Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｉｕｇｕｏａｎ＠ｎｗｎｕ．ｅｄｕ．ｃｒｌ
１实验材料与方法
１．１ 实验材料 黄连素、Ｔｒｏｌｏｘ（水溶性维生素Ｅ）、ＤＭＰＤ
（Ｎ，Ｎ一二甲基一对苯二胺）、ＡＡＰＨ（２，２一偶氮二（２一 脒基丙烷）二盐酸盐）、ＢＨＴ（２，６一二叔丁基对甲 基苯酚）、琼脂糖、ＥＢ（溴化乙锭）均购自Ｓｉｇｍａ 公司，牛血清白蛋白（ＢＳＡ）、质粒ｐＢＲ３２２ ＤＮＡ 均购自华美生物工程公司，十二烷基磺酸钠（ＳＤＳ） 购自Ｓｅｒｖａ，实验用鼠由甘肃省肿瘤医院动物房提 供，其余试剂均为国产分析纯． １．２ 实验方法 １．２．１ ＭＤＡ测定脂质过氧化 微粒体的制备参 照文献［４］的方法．Ｗｉｓｔａｒ大鼠饥饿过夜，断颈处 死，立即取出肝脏，匀浆离心２次后即得大鼠肝脏 微粒体．Ｌｏｗｒｙ法测定微粒体蛋白质浓度．
（１．西北师范大学生命科学学院，甘肃兰州 ７３００７０； ２．兰州军区总医院安宁分院检验科，甘肃兰州 ７３００７０）
摘 要：采用ＭＤＡ测定、琼脂糖凝胶电泳和ＳＤ孓ＰＡＧＥ法，检测了黄连素对由自由基引起的脂质过氧化、ＤＮＡ断
裂、蛋白质氧化降解的保护作用；用ＤＭＰＤ。法检测了黄连素对ＤＭＰＤ。自由基的清除能力．研究结果表明，黄连
素有很好的抗氧化活性，并且随着浓度的升高，对脂质过氧化、ＤＮＡ断裂、蛋白质氧化降解的保护作用和清除
ＤＭＰＤ“的能力逐渐增强．在抑制脂质过氧化中，当浓度为３２０／－ｍｏｌ·Ｌ－１时，抑制率达到９５．５％．在保护ＤＮＡ的
氧化性损伤中，浓度为８０肛ｍｏｌ·Ｌ一１时，具有明显的保护作用．在保护蛋白质氧化降解中，浓度达３２０弘ｍ０１．Ｌ－１ 时，保护作用明显．但对ＤＭＰＤ“的清除能力较弱．＂－３浓度为８０ ｐｍ０１．Ｌ－１时，清除率为１．７％．说明黄连素在不
Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００７０，Ｇａｎｓｕ，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ，ｔｈｅ ＭＤＡ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ，ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ａｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ １ｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ，ＤＮＡ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌｓ．Ｔｈｅ ＤＭＰＤ‘＋ｍｅｔｈｏｄ ｉＳ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＭＰＤ‘＋．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ，ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ ａｒｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｉｓ ９５．５％ａｔ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ３２０ ｕｍｏｌ·Ｌ＇。．Ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ ｓｈｏｗｓ ａｎ ａｐｐａｒｅｎｔｌｙ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ａｔ ８０ ｔ』ｍｏｌ·Ｌ一．Ｉｔ ａｌｓｏ ｅｘｉｈｉｂｉｔｓ ａｎ ｏｂｖｉｏｕｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｔ ３２０ ｔｔｍｏｌ·Ｌ一１．Ｉｔｓ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｓｃａｖｅｎｇ ＤＭＰＤ‘＋ｉｓ ｗｅａｋ，ｔｈｅ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ ｒａｔｅ ｉｓ １．７％ａｔ ８０／１ｍｏｌ·Ｌ一１． Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ ｅｘｉｈｉｂｉｔｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｓｙｓｔｅｍｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ；ｌｉｐｉｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ；ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ；ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ；ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｔＯ ｓｃａｖｅｎｇ ＤＭＰＤ。＋；ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ