黄瓜花叶病毒CB7株系引起心叶烟坏死反应与RNA2相关
黄瓜花叶病毒病防治策略研究进展
黄瓜花叶病毒病防治策略研究进展植物病毒病是危害农作物的一类重要病害，因其危害大、防治困难而有植物癌症之称。
近年来，植物病毒病在果树、蔬菜、花卉以及多种经济作物上的危害越来越严重。
大量研究证明，植物病毒病多数是由烟草花叶病毒（TMV）和黄瓜花叶病毒（CMV）引起的。
黄瓜花叶病毒能侵染1000多种单、双子叶植物，可经75种蚜虫传播，有些分离物还可通过种子传播，是寄主植物最多、分布最广、最具经济重要性的植物病毒之一。
能引起多种蔬菜产生花叶、坏死、枯萎等，为害面积大。
为了减轻其在生产上的危害，多年来科研工作者尝试了多种不同方法防治CMV，提出了不同的防治策略。
本文拟对相关内容进行探讨，以寻求高效的黄瓜花叶病毒防治策略。
1黄瓜花叶病毒（CMV）概述1.1CMV分类及危害黄瓜花叶病毒（Cucumbermosaicvirus，CMV）属雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的典型成员。
白Doolittle和Jagge分别报道CMV是黄瓜花叶病的病原以来，各国学者相继报道了CMV的危害。
近10多年来，CMV在一些国家和地区的许多作物上造成严重危害，如引起番茄的坏死、香蕉的花叶（心腐）、豆科植物的花叶、瓜类的花叶、西番莲的死顶等。
此外，许多过去被认为是新的病毒，现已被证实为CMV新的株系。
几十年来，各国学者根据他们分离到的CMV的寄主范围及症状表现得到许多株系或分离物，迄今，全世界已报道了100多个CMV株系（如Fny、Y、O、NT9、lx、Q）或分离物。
1.2CMV微观结构及RNA组成黄瓜花叶病毒为直径约29nm的二十面体的小颗粒，颗粒分子量约为5.3×10E6，其中18%是RNA，82%是蛋白质。
CMV是单链RNA病毒，属三分体基因组，包括4个RNA片段，即RNA1～4，其分子量分别为1.01×10E6、0.89×10E6、0.68×10E6、0.33×10E6。
现代烟草植保技术培训lu
4．防治方法
对于烟草黑胫病防治采取以抗病品种和轮作为中心的综合防 治措施。 （1）农业防治 ①选用抗病品种。种植抗病品种是防治黑胫 病最经济有效的措施。目前生产上利用的抗病品种为多基因 控制的水平抗性，如G80、NC82、NC89、NC98、K326、K346、 云烟85、云烟87等，即抗病又优质。②栽培防病。旱地实行 四年两头栽的轮作制度，而烟、稻轮作只需隔年栽烟，就可 获得理想的防治效果。施用无病菌的肥料，灌溉未受病原物 污染的水。精细整地，并搞好排灌体系。 （2）药剂防治 可用75%甲基托布津可湿性粉剂1000倍液浇施， 58%甲霜灵锰锌500倍液浇施等。
4．防治方法 由于其接触性传染的特点，烟草花叶病在田间浸染性较强，最有效的防治方法是使作 物远离毒源。烟株一旦发病，难以治疗，因此，防治主要是以预防为主，从侵染途径 入手，进行综合防治。防治TMV的最有效的技术措施是防止烟株感染。为防止TMV在烟 草中的机械传播，可对苗床喷洒牛奶（每20L牛奶配20L清水，可用于100m2的苗床）， 或者让操作者每20~30分钟在牛奶或磷酸盐溶液中洗手。上述措施可有效防止TMV在植 株间传播和将病毒从苗床带到大田。 （1）农业防治 ①加强抗耐病品种的选育和利用。近年国内外已培育出一些抗TMV的品 种，产值、产量均高于原有的对照品种。目前生产可选用较耐病品种G28、G80、NC98 等。②栽培管理。选用无病种子。需从无病烟株上采种，单收、单藏，并需进行汰选， 防止混入病株残屑。由于病毒可以附着在病茎、病根和其他病株残体上，在土壤中长 时间存活。因此要坚持轮作，轮作年限以2~3年为宜。培育无病壮苗，适时移栽。移栽 时要特别注意选用壮苗，减少大田的初侵染源。③注意操作卫生。在进行田间农事操 作时，要禁止吸烟。在间苗和大田管理中，应先处理健株，后处理病株；在病害初发 期，及时拔除田间病株。打顶后及时抹杈并铲除田间杂草，破坏烟青虫及直翅目昆虫 的生存条件，防止后期烟草花叶病的扩展。④加强大田管理。烟苗移栽前，做好大田 保墒工作，移栽后一个月内禁止大水漫灌，防止地温下降，烟苗受寒，造成生理抗性 减弱。使烟株尽快通过团棵、旺长两个最感病阶段，及时追肥、培土，促使烟株生长 健壮，提高抗病力。在团棵和旺长期，如田间出现普通花叶病，应立即追施速效性肥 料，抓紧培土后浇水，促进生长。 （2）药剂防治 目前，防治烟草花叶病没有特效药。最有效的防治方法是用0.1%硫酸 锌液在发病初期及时施用，可钝化病毒活性。据曲靖烟区大面积应用调查，在发病初 期喷施0.1%硫酸锌液，间隔3~5天喷施0.3%的尿素交替喷施1~2次，既能避免烟株产生
沉默2b基因获得抗黄瓜花叶病毒(CMV)的转基因烟草
沉默2b基因获得抗黄瓜花叶病毒(CMV)的转基因烟草芮鹏环;宋培培;蒋磊;江彤【摘要】[目的]本研究利用dsRNA技术沉默26基因,获得烟草品种云烟85的T1代转基因抗CMV株系.[方法]构建含有CMV 2b部分序列反向重复的植物表达载体pBIN-2b(r)-In-2b(i),以农杆菌介导的叶盘法转化普通烟草(Nicotiana tabacum)品种云烟85.[结果]抗性筛选获得112株T0代转基因阳性植株,接种CMV进行抗病性鉴定,发现有46株T0代转基因植株表现为抗病,其他66株表现为感病.Tas-ELISA检测表明,T0代抗病烟株的病毒积累量显著低于感病烟株.选取10个T0代抗病株系繁殖,接种CMV鉴定T1代抗病性,发现部分T1代烟株发生一定比例的抗感分离,T1代抗性株率为46.7％～100％.Real-time PCR检测T1代烟株,发现T1代抗病烟株CMV 2b基因RNA积累水平显著低于感病烟株.[结论]基于以上策略及实验,获得抗CMV转基因烟草株系.【期刊名称】《中国烟草学报》【年(卷),期】2019(025)001【总页数】5页(P111-115)【关键词】黄瓜花叶病毒;2b基因;沉默;转基因抗病烟草【作者】芮鹏环;宋培培;蒋磊;江彤【作者单位】安徽农业大学植物保护学院,合肥230036;安徽农业大学植物保护学院,合肥230036;山东省平度市农业局,山东平度266700;安徽农业大学植物保护学院,合肥230036;安徽农业大学植物保护学院,合肥230036【正文语种】中文黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）是雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）的典型成员[1]，其基因组含3个RNA组分，分别为RNA1、RNA2和RNA3， RNA2 3'端ORF编码2b蛋白，已证明是病毒基因沉默的抑制子[2]。
黄瓜绿斑驳花叶病毒病的防控技术方案
黄瓜绿斑驳花叶病毒病的识别与防控技术黄瓜绿斑驳花叶病毒，是一种新传入危险性有害生物。
根据《植物检疫条例》有关规定，中华人民共和国农业部于2006年12月21日发布（第988号）公告，将该病确定为全国农业植物检疫性有害生物。
主要危害西瓜、黄瓜、甜瓜、葫芦、南瓜等葫芦科作物，是一种通过种子远距离传播的病毒性病害。
主要分布在日本、韩国、我国台湾、印度、英国等欧洲和亚洲地区。
一、病原物黄瓜绿斑驳花叶病毒，学名 Cucumber green mottle mosaic virus，属于烟草花叶病毒属，是正单链RNA病毒，病毒粒体为杆状，长为300nm，直径15nm，致死温度为80-90℃10分钟，稀释终点为10-6，体外保毒期为240天以上（20℃），是一种很稳定的病毒。
二、主要症状西瓜：幼苗和成株期都可发病。
早期受侵染的西瓜植株生长缓慢，出现不规则的褪色或淡黄色花叶，绿色部位突出表面，叶面凹凸不平，叶缘上卷，其后出现浓绿凹凸斑，随叶片老化症状减轻；病蔓生长停滞并萎蔫，严重时整株变黄，不能正常生长而死亡；果梗部常出现褐色坏死条纹，果实表面有不明显的浓绿圆斑，有时长出不太明显的深绿色瘤疱。
与健果相比，病果有弹性，拍击时，声音发钝。
果肉周边接近果皮部呈黄色水渍状，内出现块状黄色纤维，果肉纤维化，种子周围的果肉变紫红色或暗红色水渍状，成熟时变为暗褐色并出现空洞，呈丝瓜瓤状，俗称“血果肉”，味苦不能食用，丧失经济价值。
黄瓜：新叶出现黄色小斑点，后出现花叶并带有浓绿色突起，叶片上引起色斑、水泡及变形，叶脉间褪色呈绿带状，植株矮化、结果延时，果实大部分黄化或变白并产生墨绿色水疱状的坏死斑，损失产量甚至导致不孕而绝产。
在其它作物上主要表现为花叶、绉缩、畸形、局部坏死等症状。
使产量减少，质量下降，一般损失15-30%，严重的造成绝收。
三、传播途径：该病毒主要传播途径：种子、花粉、汁液、土壤、虫介体、病残体、灌水以及嫁接、整枝、摘心、授粉、摘瓜等农事操作传播，甚至病株与健株间自然摩擦也可传播。
黄瓜绿斑驳花叶病毒病症状识别与监测方法
黄瓜绿斑驳花叶病毒病症状识别与监测方法黄春,黄雪萍,农勇胜.黄瓜绿斑驳花叶病毒病症状识别与监测方法[J].农业与技术.2015,35(08)：115-116.黄瓜绿斑驳花叶病毒（CGMMV）属于烟草花叶病毒属，在世界许多国家和地区葫芦科植物都有寄生。
特别会对黄瓜、南瓜、甜瓜、瓠瓜、西瓜、葫芦等葫芦科植物有严重危害。
掌握黄瓜绿斑驳花叶病毒病害症状，了解黄瓜绿斑驳花叶病毒病毒传播途径，正确使用黄瓜绿斑驳花叶病毒病毒监测方法，可以针对性制定防治措施，便于生产上进行有效控制该病毒的肆虐。
一、CGMMV病害症状1、黄瓜黄瓜绿斑驳花叶病毒侵害黄瓜时，开始会在黄瓜新叶上呈现小斑点，并逐渐扩大成花叶、斑驳和绿色泡状突起。
有时这些黄色小斑点，也会扩展成星状，造成叶脉褪色，并呈现绿色带状。
黄瓜植株会出现矮化现象，部分病株顶部叶片有时会呈现上卷情况，果实会出现黄色或者银色条纹，严重者还会出现瘤状突起。
黄瓜绿斑驳花叶病毒可以给黄瓜生产带来严重危害，甚至造成黄瓜的绝收。
2、西瓜黄瓜绿斑驳花叶病毒侵害西瓜时，会在植株幼叶上引发褪色，叶片呈现淡黄色斑驳花叶状，叶缘向上翻起。
叶面显得凸凹不平，叶片老化之后，其病症并不明显，而病果则在果表面出现斑纹，甚至会出现坏死斑。
果肉周围出现黄色水渍状，并逐渐恶化，果肉全部变成暗红色，内部有大量空洞，形同丝瓜瓤，开始腐烂变味。
造成西瓜的严重减产。
3、甜瓜黄瓜绿斑驳花叶病毒侵害甜瓜时，甜瓜生长至1周后，在最顶部第3～4片幼叶会出现黄色斑纹，以后展开的叶片症状逐渐减轻，再后来又出现黄色花叶，这样反复不断变化。
甜瓜成株后，其侧面的枝叶会出现星状黄花叶，甚至出现大型黄色斑纹。
幼果期，会出现绿色花叶；到果实后期，会表现为绿色斑，有时会在绿色部的中心出现白灰色。
4、瓠瓜黄瓜绿斑驳花叶病毒侵害瓠瓜时，瓠瓜会出现花叶，叶脉之间呈现黄化绿带状。
整个植株顶部的叶片会变小，且呈现黄化。
下面的叶片也会畸形，叶脉皱缩，叶片边缘呈现波浪状。
小西葫芦黄花叶病毒甜瓜分离物的基因组及其侵染性克隆
小西葫芦黄花叶病毒甜瓜分离物的基因组及其侵染性克隆作者：刘莉铭彭斌康保珊吴会杰刘茜古勤生来源：《中国瓜菜》2023年第12期摘要：病毒侵染性克隆是病毒与寄主互作研究的有力工具，分析了小西葫芦黄花叶病毒（zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）甜瓜分离物CH-87的基因组序列和分子变异，构建了具有侵染性的全长cDNA克隆。
结果显示，CH-87分离物基因组全长为9592 nt，与其他分离物的全基因组核苷酸和多聚蛋白氨基酸的序列一致性平均值分别为91.42%、96.45%。
基于CP 蛋白和多聚蛋白氨基酸序列的系统进化分析显示，CH-87分离物与美国的BL-67南瓜分离物亲缘关系最近，与中国的CN∶Lc∶17丝瓜分离物亲缘关系次之，均聚于亚组Ⅴ中。
接种试验显示，CH-87分离物的克隆具有侵染性，能系统侵染甜瓜、黄瓜、西瓜和西葫芦，经接种产生的病毒后代也具有侵染性。
关键词：小西葫芦黄花叶病毒；甜瓜分离物；基因组；侵染性克隆中图分类号：S652 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2023）12-009-07The genome and infectious clone of zucchini yellow mosaic virus melon isolateLIU Liming1，2， PENG Bin1， KANG Baoshan1，2， WU Huijie1，2， LIU Xi1，2，GU Qinsheng1，2（1.Henan Key Laboratory of Fruit and Cucurbit Biology/Zhengzhou Fruit Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450009， Henan， China; 2. Zhongyuan Research Center， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Xinxiang 453500， Henan，China）Abstract： Viral infectious clone is a powerful tool for studying the interaction between virus and host. In this study， the genome sequence of zucchini yellow mosaic virus （ZYMV） melon isolate CH-87 was cloned and analyzed， and its full-length cDNA clone was constructed. The results showed that the genome of isolate CH-87 was 9592 nt in length， and the average nucleotide and amino acid sequence identities between CH-87 and other isolates were 91.42% and 96.45%，respectivly. Phylogenetic analysis based on CP and polyprotein amino acid sequences showed that CH-87 was most closely related to isolate BL-67 from The United States， followed by isolateCN∶Lc∶17 from China， and they all clustered in subgroup Ⅴ. The inoculation showed that the infectious clone was successfully constructed， and it could systematically infect melon，cucumber， watermelon and zucchini. The progeny produced from the clone was infectious by mechanical inoculation.Key words： Zucchini yellow mosaic virus; Melon isolate; Genome; Infectious clone小西葫蘆黄花叶病毒（zucchini yellow mosaic virus，ZYMV）属于马铃薯Y病毒属（Potyvirus），通过蚜虫、机械接触和种子进行传播，主要侵染甜瓜、黄瓜、西瓜、西葫芦等瓜类作物，引起植株生长缓慢、矮化、花叶、蕨叶、新叶变小、果实畸形等，造成巨大经济损失，严重制约瓜果产业的可持续发展。
基于VIGS技术干扰病毒RNA防控烟草黄瓜花叶病毒病
㊀山东农业科学㊀２０２３ꎬ５５(６):１３６~１４２ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２３.０６.０１８收稿日期:２０２２－０７－０６基金项目:河南省烟草公司平顶山市公司科技项目(ＰＹＫＪ２０２２０７)作者简介:郭玉鸽(１９９７ )ꎬ女ꎬ河南洛阳人ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向:烟草遗传育种与品质改良ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｇｕｏｙｕｇｅ３３＠１６３.ｃｏｍ通信作者:武兆云(１９７９ )ꎬ男ꎬ安徽马鞍山人ꎬ博士ꎬ讲师ꎬ主要从事烟草遗传育种与品质改良研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｗｕｚｈａｏｙｕｎ＠ｈｅｎａｕ.ｅｄｕ.ｃｎ阎海涛(１９８４ )ꎬ男ꎬ河南荥阳人ꎬ博士ꎬ农艺师ꎬ从事土壤改良及烟草栽培研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｙｈｔ５６５７＠１６３.ｃｏｍ基于ＶＩＧＳ技术干扰病毒ＲＮＡ防控烟草黄瓜花叶病毒病郭玉鸽１ꎬ张倩１ꎬ杨惠娟１ꎬ李俊营２ꎬ常栋２ꎬ张富生２ꎬ武兆云１ꎬ阎海涛２ꎬ杨铁钊１(１.河南农业大学烟草学院ꎬ河南郑州㊀４５０００２ꎻ２.河南省烟草公司平顶山市公司ꎬ河南平顶山㊀４６７０００)㊀㊀摘要:黄瓜花叶病毒(ＣｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓꎬＣＭＶ)引起的花叶病是烟草上的重要病害ꎮ本试验通过病毒诱导基因沉默技术(ｖｉｒｕｓｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇꎬＶＩＧＳ)构建靶向沉默ＣＭＶ－１ａ㊁ＣＭＶ－２ａ㊁ＣＭＶ－ＭＰ和ＣＭＶ－ＣＰ的ＶＩＧＳ载体ꎬ测定基因沉默后ＣＭＶ相对表达量㊁ＣＭＶ病毒浓度和ＴＲＶ相对表达量ꎬ并对ＶＩＧＳ载体对ＣＭＶ的防治效果进行评价ꎮ结果表明ꎬ试验建立的ＶＩＧＳ载体能够有效导入烟株ꎻ沉默ＣＭＶ－２ａ的处理ＣＭＶ相对表达量最低ꎬ基因沉默效率最高ꎬ为４６.２５％ꎻ接种病毒３０ｄ后ＣＭＶ－２ａ处理的病毒浓度最低ꎬ仅为对照的７２.８％ꎬＴＲＶ载体的相对表达量显著高于其他处理ꎻ沉默ＣＭＶ－２ａ的处理发病时间推迟ꎬ病情指数最低ꎬ防治效果最好ꎮ本研究建立的ＣＭＶ－２ａＶＩＧＳ体系能够有效沉默外源侵入的ＣＭＶ基因表达ꎬ抑制ＣＭＶ在烟株内的传播ꎬ为防治烟草黄瓜花叶病毒病提供了新的思路与方法ꎮ关键词:ＶＩＧＳ技术ꎻ干扰病毒ＲＮＡꎻ烟草ꎻ黄瓜花叶病毒病中图分类号:Ｓ４３５.７２:Ｑ７８９㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２３)０６－０１３６－０７ＣｏｎｔｒｏｌｏｆＴｏｂａｃｃｏＣｕｃｕｍｂｅｒＭｏｓａｉｃＶｉｒｕｓＤｉｓｅａｓｅｂｙＩｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＶｉｒａｌＲＮＡＢａｓｅｄｏｎＶＩＧＳＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＧｕｏＹｕｇｅ１ꎬＺｈａｎｇＱｉａｎ１ꎬＹａｎｇＨｕｉｊｕａｎ１ꎬＬｉＪｕｎｙｉｎｇ２ꎬＣｈａｎｇＤｏｎｇ２ꎬＺｈａｎｇＦｕｓｈｅｎｇ２ꎬＷｕＺｈａｏｙｕｎ１ꎬＹａｎＨａｉｔａｏ２ꎬＹａｎｇＴｉｅｚｈａｏ１(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＴｏｂａｃｃｏꎬＨｅｎａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＺｈｅｎｇｚｈｏｕ４５０００２ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＰｉｎｇｄｉｎｇｓｈａｎＢｒａｎｃｈｏｆＨｅｎａｎＴｏｂａｃｃｏＣｏｍｐａｎｙꎬＰｉｎｇｄｉｎｇｓｈａｎ４６７０００ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｍｏｓａｉｃｄｉｓｅａｓｅｃａｕｓｅｄｂｙｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ(ＣＭＶ)ｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｄｉｓｅａｓｅｏｆｔｏｂａｃｃｏ.Ｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｕｓｅｄｔｈｅｖｉｒｕｓｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ(ＶＩＧＳ)ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔＶＩＧＳｖｅｃｔｏｒｓｔａｒｇｅｔｅｄｓｉｌｅｎｃｉｎｇＣＭＶ￣１ａꎬＣＭＶ￣２ａꎬＣＭＶ￣ＭＰａｎｄＣＭＶ￣ＣＰ.ＴｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＣＭＶꎬｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＣＭＶｖｉｒｕｓａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＴＲＶａｆｔｅｒｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｗｅｒｅｍｅａｓｕｒｅｄꎬａｎｄｔｈｅｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｅｆｆｅｃｔｓｏｆＶＩＧＳｖｅｃｔｏｒｓａｇａｉｎｓｔＣＭＶｗｅｒｅｅｖａｌｕａｔｅｄ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＶＩＧＳｖｅｃｔｏｒｓｅｓ￣ｔａｂｌｉｓｈｅｄｉｎｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｃｏｕｌｄｂｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｎｔｏｔｏｂａｃｃｏｐｌａｎｔｓｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＴｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｓｉｌｅｎｃｉｎｇＣＭＶ￣２ａｈａｄｔｈｅｌｏｗｅｓｔｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＣＭＶａｎｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙａｓ４６.２５％.Ａｆｔｅｒ３０ｄａｙｓｏｆｖｉｒｕｓｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎꎬｔｈｅＣＭＶ￣２ａｔｒｅａｔｍｅｎｔｈａｄｔｈｅｌｏｗｅｓｔｖｉｒｕｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎꎬｏｎｌｙ７２.８％ｏｆｔｈａｔｏｆｃｏｎｔｒｏｌꎬａｎｄｔｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＴＲＶｖｅｃｔｏｒｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｏｔｈｅｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ.ＳｉｌｅｎｃｉｎｇＣＭＶ￣２ａｔｒｅａｔｍｅｎｔｄｅｌａｙｅｄｔｈｅｏｎｓｅｔｔｉｍｅａｎｄｔｈｅｄｉｓｅａｓｅｉｎｄｅｘｗａｓｔｈｅｌｏｗｅｓｔꎬｓｏｉｔｈａｄｔｈｅｂｅｓｔｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｅｆｆｅｃｔ.ＴｈｅＣＭＶ￣２ａＶＩＧＳｓｙｓｔｅｍｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙｃｏｕｌｄｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｓｉ￣ｌｅｎｃｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｅｘｏｇｅｎｏｕｓＣＭＶｇｅｎｅｓꎬａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎｏｆＣＭＶｉｎｔｏｂａｃｃｏｐｌａｎｔｓꎬｗｈｉｃｈｐｒｏｖｉｄｅｄａｎｅｗｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｏｆｔｏｂａｃｃｏｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｄｉｓｅａｓｅ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＶＩＧＳｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎻＩｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇｖｉｒａｌＲＮＡꎻＴｏｂａｃｃｏꎻＣｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓｄｉｓｅａｓｅ㊀㊀由黄瓜花叶病毒(ＣｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓꎬＣＭＶ)引起的花叶病是烟草上的重要病害ꎬ严重影响烟叶质量[１ꎬ２]ꎮ黄瓜花叶病毒是雀麦花叶病毒科(Ｂｒｏｍｏｖｉｒｉｄａｅ)黄瓜花叶病毒属(Ｃｕｃｕｍｏｖｉｒ￣ｕｓ)的典型成员ꎬ为三分体正义单链ＲＮＡ病毒[３]ꎬ编码５种蛋白[４]ꎮＲＮＡ１编码１ａ复制酶蛋白[５]ꎻＲＮＡ２的５ᶄ端编码２ａ复制酶蛋白ꎬ３ᶄ端编码２ｂ蛋白[６]ꎮ前人研究发现植物受ＣＭＶ侵染后的症状表现是由１ａ和２ａ复制酶蛋白共同决定的ꎬ二者具有协同作用[７]ꎮＲＮＡ３的５ᶄ端编码胞间运动蛋白(ＭＰ)ꎬ３ᶄ端编码外壳蛋白(ＣＰ)ꎬ与病毒扩散㊁长距离运输和包被作用有关[８]ꎮ目前生产上防治烟草黄瓜花叶病毒病通常以化学防治为主ꎬ容易造成药剂残留和环境污染等问题[９ꎬ１０]ꎮ培育抗病品种也是防治烟草黄瓜花叶病的有效方式之一[１１]ꎬ但至今还没有从烟草上克隆出ＣＭＶ抗性基因[１２]ꎬ育种工作进展缓慢ꎬ而生物防治技术已经逐渐成为病害防治的新方法[１３]ꎮ病毒诱导基因沉默(ｖｉｒｕｓ－ｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉ￣ｌｅｎｃｅꎬＶＩＧＳ)是一种对植物进行反向遗传操作的技术[１４]ꎬ是植物防御机制的表现[１５]ꎮ农杆菌介导的ＶＩＧＳ技术通过农杆菌将携带目的基因片段的病毒载体转移到植物细胞中[１６]ꎬ介导靶向同源基因的ｍＲＮＡ降解ꎬ引起目的基因沉默[１７]ꎮ烟草脆裂病毒(ＴｏｂａｃｃｏｒａｔｔｌｅｖｉｒｕｓꎬＴＲＶ)载体是使用最广泛的ＶＩＧＳ载体ꎬ具有沉默效率高㊁持久性长㊁不会对宿主造成明显伤害等优点[１８]ꎮ目前ＶＩＧＳ技术多用于基因功能鉴定和抗病抗虫[１９ꎬ２０]研究上:如龚攀[２１]构建的甜菜ＶＩＧＳ体系验证了抗旱相关基因功能ꎻ刘天波等[２２]沉默马铃薯Ｙ病毒脉坏死株系外壳蛋白基因有效防治马铃薯Ｙ病毒病ꎮ有研究表明ꎬＣＭＶ在不同作物中起关键作用的基因是不同的[２３]ꎮ因此本研究根据ＣＭＶ基因组及其编码蛋白的组成特征ꎬ构建靶向相关基因片段的ＴＲＶ载体ꎬ比较烟株接种ＶＩＧＳ载体后对ＣＭＶ的抗性ꎬ以期筛选适用于大田防治烟草黄瓜花叶病的最佳ＶＩＧＳ体系ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀试验材料试验于２０２２年４ ５月进行ꎮ参试烤烟品种为中烟１００ꎬ由河南农业大学烟草学院育种实验室提供ꎮｐＴＲＶ２载体购自武汉淼灵生物科技有限公司ꎬ根癌农杆菌ＧＶ３１０１感受态细胞购自上海唯地生物技术有限公司ꎮＣＭＶ病毒叶片由河南农业大学烟草学院育种实验室提供ꎮ１.２㊀试验方法１.２.１㊀引物设计㊀根据已测定的ＣＭＶ(ＧｅｎＢａｎｋ登录号:ＧＣＡ＿０００８６４７４５.１)序列ꎬ选取适合用来构建ＶＩＧＳ载体的片段ꎬ使用Ｏｌｉｇｏ７软件设计特异性引物ꎬ其序列如表１所示ꎮ㊀㊀表１㊀本研究使用的引物序列引物名称引物序列(５ᶄ－３ᶄ)扩增产物大小(ｂｐ)ＣＭＶ－１ａ－ＦｇｔｇａｇｔａａｇｇｔｔａｃｃｇａａｔｔｃＧＣＴＧＣＧＧＡＴ￣ＴＧＣＡＡＡＧＴＡＣＡＡ６８６ＣＭＶ－１ａ－ＲｃｇｔｇａｇｃｔｃｇｇｔａｃｃｇｇａｔｃｃＴＣＣＡＴＣ￣ＣＡＣＧＣＴＴＴＣＴＴＡＴＣＡＴＴＣＭＶ－２ａ－ＦｇｔｇａｇｔａａｇｇｔｔａｃｃｇａａｔｔｃＴＡＡＡ￣ＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＧＣＴＧＡＧＡＧ５５３ＣＭＶ－２ａ－ＲｃｇｔｇａｇｃｔｃｇｇｔａｃｃｇｇａｔｃｃＡＡＴＣＴＣＴ￣ＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＴＴＴＡＣＴＣＡＣＭＶ－ＭＰ－ＦｇｔｇａｇｔａａｇｇｔｔａｃｃｇａａｔｔｃＧＧＴＣＧＴＡＴＴ￣ＧＣＴＴＣＣＴＴＣＴＴＴＡＡＧＴ３０３ＣＭＶ－ＭＰ－ＲｃｇｔｇａｇｃｔｃｇｇｔａｃｃｇｇａｔｃｃＡＡＣＴＧＴＴＴＣ￣ＣＡＴＡＧＧＡＣＡＡＴＣＡＴＡＣＧＣＭＶ－ＣＰ－ＦｇｔｇａｇｔａａｇｇｔｔａｃｃｇａａｔｔｃＡＡＧＡＣＧＴ￣ＴＡＧＣＡＧＣＴＧＧＴＣＧＴＣ３６４ＣＭＶ－ＣＰ－ＲｃｇｔｇａｇｃｔｃｇｇｔａｃｃｇｇａｔｃｃＧＴＡＣＣＧＧＴ￣ＧＡＧＧＣＴＣＣＧＴＣＣＴＲＶ２－ＦＡＡＡＣＡＴＴＧＣＡＣＣＴＡＴＧＧＴＧＴＴ￣ＧＣＣ７４４ＴＲＶ２－ＲＧＣＣＧＣＴＡＧＴＡＡＣＣＣＡＧＴＧＡＴＣＴ￣ＣＡＴＣ㊀㊀注:下划线部分为酶切位点ꎬ所用限制性内切酶为ＥｃｏＲⅠ㊁ＢａｍＨⅠꎬ酶切位点前的小写字母为保护碱基ꎮ１.２.２㊀ＶＩＧＳ载体的构建㊀利用ＴＲＩｚｏｌ法提取感染了ＣＭＶ病毒的烟叶总ＲＮＡꎬ参照北京全式金７３１㊀第６期㊀㊀㊀㊀郭玉鸽ꎬ等:基于ＶＩＧＳ技术干扰病毒ＲＮＡ防控烟草黄瓜花叶病毒病生物技术有限公司ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔＯｎｅ－ＳｔｅｐｇＤＮＡＲｅｍｏｖａｌａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｕｐｅｒＭｉｘ说明书反转成ｃＤＮＡꎮ以获得的ｃＤＮＡ为模板ꎬ按照表１引物利用诺唯赞生物技术有限公司的Ｐ５０５高保真酶进行ＰＣＲ扩增ꎮ扩增体系:２ˑＰｈａｎｔａＭａｘＢｕｆｆｅｒ２５μＬꎬｄＮＴＰＭｉｘ(１０ｍｍｏｌ/Ｌ)１μＬꎬＰｈａｎｔａＭａｘＳｕｐｅｒ－ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ１μＬꎬ上下游引物(１０μｍｏｌ/Ｌ)各２μＬꎬｃＤＮＡ(２０μｍｏｌ/Ｌ)模版１μＬꎬｄｄＨ２Ｏ补至５０μＬꎮ反应条件:９５ħ预变性３ｍｉｎꎻ９５ħ变性１５ｓꎬ６８ħ退火１５ｓꎬ７２ħ延伸３０ｓꎬ３５个循环ꎻ７２ħ终延伸５ｍｉｎꎬ琼脂糖凝胶电泳检测后纯化回收目的片段ꎮ对ｐＴＲＶ２空载体质粒进行ＥｃｏＲⅠ/ＢａｍＨⅠ双酶切后获得线性化载体ꎮ将扩增产物与线性化载体进行连接ꎬ随后转化至大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞ꎮ将测序正确的单克隆菌株扩繁并提取质粒保存ꎮ１.２.３㊀重组表达载体转化㊀参照上海唯地生物技术有限公司的农杆菌ＧＶ３１０１感受态细胞的使用说明书ꎬ将重组表达载体ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－１ａ㊁ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－２ａ㊁ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－ＭＰ和ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－ＣＰ转化农杆菌ＧＶ３１０１感受态细胞ꎮ将菌液均匀涂抹在ＬＢ(含有浓度为２５ｍｇ/ｍＬ利福平和５０ｍｇ/ｍＬ卡那霉素)固体培养基上ꎬ２８ħ下倒置培养４８ｈꎻ挑取单菌落经ＰＣＲ扩增后ꎬ使用琼脂糖凝胶电泳检测验证后分别扩繁ꎮ１.２.４㊀农杆菌转化烟草㊀将ｐＴＲＶ１㊁ｐＴＲＶ２㊁ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－１ａ㊁ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－２ａ㊁ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－ＭＰ和ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－ＣＰ分别接种到ＬＢ液体培养基上ꎬ２８ħ㊁２００ｒ/ｍｉｎ过夜培养后ꎬ调整浓度ＯＤ６００值为０.８~１.０ꎬ用ｐＴＲＶ１分别与ｐＴＲＶ２㊁ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－１ａ㊁ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－２ａ㊁ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－ＭＰ和ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－ＣＰ等比混合ꎬ离心后弃上清液ꎬ将沉淀重悬于等体积的侵染缓冲液(５０ｍｍｏｌ/ＬＭｇＣｌ２㊁５０ｍｍｏｌ/ＬＭＥＳ㊁０.１ｍｍｏｌ/Ｌ乙酰丁香酮)中ꎮ选取长势均匀一致的六叶一心烟苗ꎬ用１ｍＬ注射器注射侵染液于烟株嫩叶背面ꎬ每株烟注射２片叶ꎬ每片叶注射１ｍＬꎮ１.３㊀试验设计共设置６个处理ꎬ分别为ＣＫ:不注射烟株ꎻ空载:注射接种含ｐＴＲＶ２的侵染液(空载体对照)ꎻＣ１:注射接种含ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－１ａ的侵染液ꎻＣ２:注射接种含ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－２ａ的侵染液ꎻＣ３:注射接种含ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－ＭＰ的侵染液ꎻＣ４:注射接种含ｐＴＲＶ２－ＣＭＶ－ＣＰ的侵染液ꎮ每个处理注射接种２０株烟ꎬ每株烟接种２ｍＬꎬ接种载体后１４ｄ各处理均用金刚砂摩擦接种ＣＭＶ病毒ꎮ１.４㊀测定指标１.４.１㊀ＶＩＧＳ载体接种效果及基因沉默效果的测定㊀在接种ＶＩＧＳ载体后１０ｄꎬ各处理随机选择两株烟ꎬ取新长出的叶片ꎬ充分消毒后提取ＲＮＡꎬ按照表１中ＴＲＶ２扩增引物进行ＲＴ－ＰＣＲ检测ꎮ在接种病毒后７㊁１４㊁２１ｄ时ꎬ各处理分别选择３株烟ꎬ取心叶向下第二片叶ꎬ充分消毒后提取ＲＮＡꎬ反转录成ｃＤＮＡꎬ以烟草２６ＳｒＲＮＡ为内参基因ꎬ根据ＧｅｎＢａｎｋ发布的相关基因序列设计扩增引物(表２)ꎮ按照ＱｕａｎｔｑＲＴ－ＰＣＲｋｉｔ(ＳＹＢＲＧｒｅｅｎꎬＴＩＡＮＧＥＮ公司)使用说明在ＳｔｅｐＯｎｅＴＭＲｅ￣ａｌ－ＴｉｍｅＰＣＲ仪(Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司)上进行ｑＲＴ－ＰＣＲ检测ꎮ根据已得到的Ｃｔ值ꎬ采用２－ΔΔＣｔ法分析ＣＭＶ和ＴＲＶ基因的相对表达量ꎮ基因沉默效率(％)计算公式:(对照组ＣＭＶ累积量－处理组ＣＭＶ累积量)/对照组ＣＭＶ累积量ˑ１００ꎮ㊀㊀表２㊀ｑＲＴ－ＰＣＲ所用引物引物名称引物序列(５ᶄ－３ᶄ)ＣＭＶ－ＦＡＡＣＣＡＣＣＣＡＡＣＣＴＴＴＧＴＡＧＧＣＭＶ－ＲＧＡＡＴＧＣＧＣＧＡＡＡＣＡＡＧＣＴＴＣＴＲＶ－ＦＴＧＴＴＴＣＡＡＡＣＣＣＧＧＣＡＧＣＴＴＴＲＶ－ＲＴＣＧＡＴＡＣＡＧＧＣＡＧＣＣＣＡＴＣＡ２６ＳｒＲＮＡ－ＦＧＡＡＧＡＡＧＧＴＣＣＣＡＡＧＧＧＴＴＣ２６ＳｒＲＮＡ－ＲＴＣＴＣＣＣＴＴＴＡＡＣＡＣＣＡＡＣＧＧ１.４.２㊀病毒浓度的测定㊀在接种病毒后３０ｄꎬ各处理选择发病情况一致的３株烟ꎬ取心叶向下第二片叶ꎬ液氮速冻后保存于冰箱ꎬ使用黄瓜花叶病毒(ＣＭＶ)酶联免疫分析试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)测定烟株内ＣＭＶ病毒浓度ꎮ１.４.３㊀发病情况的测定㊀在接种病毒后第７天观察发病情况ꎮ根据«烟草病虫害分级及调查方法»(ＧＢ/Ｔ２３２２２ ２００８)以株为单位进行病级鉴定ꎬ根据下列公式计算发病率㊁病情指数和防治效果ꎮ发病率(％)＝发病株数/调查总株数ˑ１００㊀ꎻ８３１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀病情指数＝(Σ各级病株数ˑ病级代表值)/(调查总株数ˑ最高病级代表值)ˑ１００㊀ꎻ防治效果(％)＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数ˑ１００㊀ꎮ１.５㊀数据分析采用ＳＰＳＳ１６.０软件对数据进行差异显著性分析(Ｄｕｎｃａｎᶄｓ)ꎬ采用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ２００７整理分析数据ꎮ２㊀结果与分析２.１㊀ＶＩＧＳ载体构建由图１可知ꎬＰＣＲ扩增得到的基因片段大小与表１一致ꎮ分别将这些基因片段同ｐＴＲＶ２的线性化载体相连接ꎬ获得对应的表达载体ꎬ将测序正确的表达载体转化农杆菌ＧＶ３１０１感受态细胞ꎮＡ:ＣＭＶ－１ａ的扩增产物ꎻＢ:ＣＭＶ－２ａ的扩增产物ꎻＣ:ＣＭＶ－ＭＰ的扩增产物ꎻＤ:ＣＭＶ－ＣＰ的扩增产物ꎻＭ:２０００＋ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ１~６:ＰＣＲ扩增产物ꎮ图１㊀目的基因的ＰＣＲ扩增２.２㊀ＶＩＧＳ载体接种效果以ＴＲＶ２－Ｆ/ＴＲＶ２－Ｒ为引物ꎬ进行ＲＴ－ＰＣＲ检测(图２)ꎬ产物大小约为７４４ｂｐꎬ说明ＶＩＧＳ载体成功导入烟株ꎮＭ为ＤＬ２０００ＭａｒｋｅｒꎻＣ１:接种ＣＭＶ－１ａ载体ꎻＣ２:接种ＣＭＶ－２ａ载体ꎻＣ３:接种ＣＭＶ－ＭＰ载体ꎻＣ４:接种ＣＭＶ－ＣＰ载体ꎮ图２㊀ＶＩＧＳ载体接种烟株后的ＲＴ－ＰＣＲ检测２.３㊀基因沉默效果分析从图３可以看出ꎬ空载体处理的ＣＭＶ相对表达量在接种病毒后７ｄ和２１ｄ与对照相比有一定程度的降低ꎮ接种病毒７ｄ后ꎬＣ２处理的ＣＭＶ相对表达量最低ꎬ基因沉默效率最高ꎬ为４６.２５％ꎻ接种病毒１４ｄ后ꎬ空载体处理的病毒相对表达量较对照有一定程度的升高ꎬＣ２和Ｃ３处理的病毒相对表达量均显著低于对照ꎬ基因沉默效率分别为３９.３８％和２６.２４％ꎻ接种病毒２１ｄ后ꎬ接种载体的处理ＣＭＶ相对表达量均显著低于对照和空载体处理ꎬＣ２处理基因沉默效率仍最高ꎬ为３６.８％ꎬＣ４处理次之ꎮ柱上不同小写字母表示不同接种天数不同处理间差异显著(Ｐ<０.０５)ꎮ图３㊀接种病毒后ＣＭＶ相对表达量从图４可以看出ꎬＴＲＶ相对表达量不同处理间差异显著ꎬＣ２处理的ＴＲＶ表达量显著高于空９３１㊀第６期㊀㊀㊀㊀郭玉鸽ꎬ等:基于ＶＩＧＳ技术干扰病毒ＲＮＡ防控烟草黄瓜花叶病毒病载体处理ꎬＣ４次之ꎬＣ１最少ꎮ２.４㊀基因沉默后病毒浓度接种病毒３０ｄ后ꎬ各处理ＣＭＶ浓度表现出与ＣＭＶ相对表达量相似的变化趋势ꎬＣ２㊁Ｃ３㊁Ｃ４处理的ＣＭＶ浓度均显著低于对照和空载体处理ꎮ其中Ｃ２处理的病毒浓度最低ꎬ仅为对照的７２.８％ꎻＣ４次之ꎬ病毒浓度为对照的８６.５％ꎻＣ３处理为对照的９１.３％(图５)ꎮ柱上不同小写字母表示不同处理间差异显著(Ｐ<０.０５)ꎬ下同ꎮ图４㊀接种病毒后ＴＲＶ相对表达量图５㊀接种病毒后３０ｄＣＭＶ浓度变化２.５㊀基因沉默后抗病效果分析由表３可知ꎬ发病初期Ｃ２处理的发病率㊁病情指数最低ꎬ防治效果最好ꎻＣ４处理次之ꎻ空载体的发病情况略轻于对照ꎮ发病高峰期ꎬ除Ｃ２处理发病率为９５％外ꎬ其它处理的发病率均为１００％ꎬＣ２的病情指数最低ꎬ防治效果最好ꎮ㊀㊀表３㊀不同处理的发病情况处理发病初期发病率(％)病情指数防治效果(％)发病高峰期发病率(％)病情指数防治效果(％)ＣＫ１００.０６３.３１００.０７２.０空载体８５.７５０.８１００.０６６.０Ｃ１８４.２３８.６３９.１１００.０６２.０１３.９Ｃ２４０.０１６.７７３.７９５.０４１.０４３.１Ｃ３８５.０４５.０２８.９１００.０５６.０２２.２Ｃ４６５.０２８.３５５.３１００.０４８.０３３.３３㊀讨论Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ等[２４]将马铃薯Ｙ病毒蛋白酶基因片段转入烟草中ꎬ获得抗马铃薯Ｙ病毒的转基因烟草ꎮ程英豪等[２５]将黄瓜花叶病毒(ＣＭＶ)外壳蛋白转入烟草ꎬ获得的转基因烟草对ＣＭＶ抗性增强ꎮ目前烟草的大多数抗病毒研究都是通过将病毒的外壳蛋白基因导入烟草来提高抗性[２６ꎬ２７]ꎬ该过程会产生病毒蛋白ꎬ因此其安全性存在争议[２８]ꎮ病毒诱导的基因沉默(ＶＩＧＳ)属于转录后水平的基因沉默(ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｇｅｎｅｓｉｌｅｎ￣ｃｉｎｇꎬＰＴＧＳ)ꎬ利用植物固有的ＲＮＡ干扰和病毒免疫应答机制[２９]ꎬ避免了翻译为蛋白的安全性问题ꎮ目前ＶＩＧＳ技术已成功应用到病虫害防治中ꎬ也被称为寄主诱导的基因沉默(ｈｏｓｔ－ｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇꎬＨＩＧＳ)ꎮＮｏｗａｒａ等[３０]首次发现ꎬ将病原体基因导入病毒载体并感染寄主植物后ꎬ寄主植物细胞中会产生ｄｓＲＮＡꎬ并在病原体感染寄主时进入病原体中ꎬ从而引发病原体发生ＰＴＧＳꎮ前人将线虫基因片段导入ＴＲＶ载体后侵染拟南芥ꎬ成功抑制了根部寄生线虫体内目标基因的表达[３１]ꎮ基因沉默的关键是找到起关键作用的靶标基因ꎮＣＭＶ的１ａ和２ａ蛋白共同组成ＲＮＡ聚合酶ꎬ并与寄主因子结合形成复合物ꎬ在病毒的复制中起作用[３２]ꎮ位于胞间连丝的胞间运动蛋白(ＭＰ)参与了ＣＭＶ的胞间运转和系统运转[３３]ꎮ外壳蛋白(ＣＰ)是一个多功能蛋白ꎬ其主要功能是组装病毒ꎬ此外该蛋白还是关键的致病因子ꎬ参与复制㊁翻译㊁运动㊁蚜传等多个过程[３４]ꎮ由于ＣＭＶ在不同作物中起关键作用的基因不同ꎬ因此本研究分别在ＣＭＶ的４个关键蛋白上构建ＶＩＧＳ载体ꎮ本研究建立的ＶＩＧＳ体系中ＣＭＶ－２ａ(Ｃ２)的基因沉默效果最好ꎬ接种病毒后７ｄ基因沉默效率最高ꎬ病毒累积量最低ꎮ这与前人的研究结果相似:将ＣＭＶ的２ａ基因转化入烟草ꎬ获得的烟草植株发病率降低ꎬ发病时间推迟[３５]ꎮ此外ꎬ空载体处理的ＣＭＶ累积量与对照相比也有所下降ꎬ接种病毒后２１ｄ达到显著性差异ꎮ前人研究认为病毒是植物的应激因素ꎬ推测接种空载体后引起０４１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀了植物一系列的防御反应[３６]ꎬ抑制了ＣＭＶ病毒在烟株内的传播ꎮ接种病毒３０ｄ后ꎬＣ２处理的ＣＭＶ病毒浓度最低ꎬ即ＣＭＶ－２ａＶＩＧＳ载体对ＣＭＶ的抑制作用最好ꎬ且ＴＲＶ载体的含量在各处理中最高ꎮＣ２处理发病初期的发病率最低ꎬ仅为对照的４０％ꎬ发病时间推迟ꎬ有效抑制了ＣＭＶ在烟株内的传播ꎮ通过ＶＩＧＳ技术沉默ＣＭＶ－２ａ基因可以很好地防治烟草黄瓜花叶病ꎬ下一步将进行大规模田间试验ꎬ为后期大田应用提供理论基础ꎮＶＩＧＳ技术具有成本低㊁方法操作简单等优点[３７]ꎬ并且对植物无伤害ꎬ对环境无污染ꎬ是一种具有较好应用前景的方法ꎮ然而温度是限制ＶＩＧＳ技术应用的主要因素[３８]ꎬ因此开发出耐高温的载体是ＶＩＧＳ技术未来需要努力的重点和方向ꎮ４㊀结论本研究建立的ＣＭＶ－２ａＶＩＧＳ体系能够有效沉默外源侵入的ＣＭＶ基因的表达ꎬ基因沉默效率高达４６.２５％ꎬ有效抑制了ＣＭＶ在烟株内的传播ꎬ发病时间推迟ꎬ防治效果最好ꎬ为防治烟草黄瓜花叶病毒病提供了新的思路与方法ꎮ参㊀考㊀文㊀献:[１]㊀张俊.我国不同生态区烟草病毒病的分布与检测技术研究[Ｄ].荆州:长江大学ꎬ２０１８.[２]㊀李正风ꎬ刘勇ꎬ夏玉珍.黄瓜花叶病毒及抗病转基因烟草研究进展[Ｊ].生物技术ꎬ２００６(５):８０－８２. [３]㊀乔文婕ꎬ雷荣ꎬ蒋弘山ꎬ等.离子对高效液相色谱法分析黄瓜花叶病毒侵染烟草的总ＲＮＡ水平变化[Ｊ].生物技术通报ꎬ２０１３(４):９０－９５.[４]㊀金大伟.我国主要烟区烟草黄瓜花叶病毒的鉴定及全基因组序列分析[Ｄ].武汉:华中农业大学ꎬ２０１４. [５]㊀夏烨.三种烟草病毒在烟田土壤中的分布动态及在烟草中的互作[Ｄ].广州:华南农业大学ꎬ２０１７.[６]㊀姚敏ꎬ张天奇ꎬ田志超ꎬ等.农杆菌介导的ＣＭＶ侵染性克隆及２ｂ缺失突变体构建[Ｊ].中国农业科学ꎬ２０１１ꎬ４４(１４):３０６０－３０６８.[７]㊀郭依.双链ＲＮＡ介导的烟草抗病毒病(ＴＭＶꎬＣＭＶꎬＰＶＹ)和靶斑病(Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ)的研究[Ｄ].沈阳:沈阳农业大学ꎬ２０２０.[８]㊀张璐.黄瓜花叶病毒外壳蛋白与番茄光合作用相关蛋白的互作研究[Ｄ].南宁:广西大学ꎬ２０１７.[９]㊀王兴兴.辣椒抗ＣＭＶ相关ＱＴＬ定位[Ｄ].北京:中国农业科学院ꎬ２０１６.[１０]潘旭浩ꎬ程立锐ꎬ陈小翠ꎬ等.基于ＳＬＡＦ－ｓｅｑ技术的烟草抗ＣＭＶ主效ＱＴＬ定位[Ｊ].中国烟草科学ꎬ２０１８ꎬ３９(５):１－８.[１１]范静苑ꎬ王元英ꎬ蒋彩虹ꎬ等.烟草ＣＭＶ抗性鉴定及抗性基因的ＳＳＲ标记研究[Ｊ].分子植物育种ꎬ２００９ꎬ７(２):３５５－３５９.[１２]程亚增.ＣＭＶ侵染烟草的细胞学观察及表达谱分析[Ｄ].北京:中国农业科学院ꎬ２０１６.[１３]迟孟山.酵母拮抗菌形态转变对逆境耐受性和生防效力的影响研究[Ｄ].合肥:合肥工业大学ꎬ２０１７.[１４]ＲｕｉｚＭＴꎬＶｏｉｎｎｅｔＯꎬＢａｕｌｃｏｍｂｅＤＣ.Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎａｎｄｍａｉｎｔｅ￣ｎａｎｃｅｏｆｖｉｒｕｓ￣ｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇ[Ｊ].ＴｈｅＰｌａｎｔＣｅｌｌꎬ１９９８ꎬ１０(６):９３７－９４６.[１５]ＲａｔｃｌｉｆＦꎬＭａｒｔｉｎ￣ＨｅｒｎａｎｄｅｚＭꎬＢａｕｌｃｏｍｂｅＤＣꎬｅｔａｌ.Ｔｏｂａｃ￣ｃｏｒａｔｔｌｅｖｉｒｕｓａｓａｖｅｃｔｏｒｆｏｒａｎａｌｙｓｉｓｏｆｇｅｎｅｆｕｎｃｔｉｏｎｂｙｓｉｌｅｎ￣ｃｉｎｇ[Ｊ].ＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌꎬ２００１ꎬ２５(２):２３７－２４５.[１６]ＢａｕｌｃｏｍｂｅＤ.ＲＮＡｓｉｌｅｎｃｉｎｇｉｎｐｌａｎｔｓ[Ｊ].Ｎａｔｕｒｅꎬ２００４ꎬ４３１(７００６):３５６－３６３.[１７]ＰａｎｇＪＨꎬＺｈｕＹꎬＬｉＱꎬｅｔａｌ.ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ￣ｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇａｎｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｅｖａｌｕａ￣ｔｉｏｎｏｆｆｏｕｒｍａｒｋｅｒｇｅｎｅｓｉｎＧｏｓｓｙｐｉｕｍｂａｒｂａｄｅｎｓｅ[Ｊ].ＰＬｏＳＯＮＥꎬ２０１７ꎬ８(９):ｅ７３２１１.[１８]李杰ꎬ罗江宏ꎬ万子龙ꎬ等.ＶＩＧＳ技术在辣椒基因功能研究中的应用进展[Ｊ].河南农业科学ꎬ２０２１ꎬ５０(６):９－１５. [１９]ＣｈａｎｄａｎＲＫꎬＳｉｎｇｈＡＫꎬＰａｔｅｌＳꎬｅｔａｌ.ＳｉｌｅｎｃｉｎｇｏｆｔｏｍａｔｏＣＴＲ１ｐｒｏｖｉｄｅｓｅｎｈａｎｃｅｄｔｏｌｅｒａｎｃｅａｇａｉｎｓｔｔｏｍａｔｏｌｅａｆｃｕｒｌｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｌａｎｔＳｉｇｎａｌｉｎｇ＆Ｂｅｈａｖｉｏｒꎬ２０１９ꎬ１４(３):ｅ１５６５５９５.[２０]ＺｈｏｕＸＨꎬＬｉｕＪꎬＢａｏＳＹꎬｅｔａｌ.Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｃｈａｒ￣ａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｗｉｌｄｅｇｇｐｌａｎｔＳｏｌａｎｕｍａｃｕｌｅａｔｉｓｓｉｍｕｍＮＢＳ－ＬＲＲｇｅｎｅꎬｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｐｌａｎｔｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏＭｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅｉｎｃｏｇｎｉ￣ｔａ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０１８ꎬ１９(２):５８３.[２１]龚攀.甜菜病毒诱导基因沉默体系建立及抗旱基因功能验证[Ｄ].哈尔滨:哈尔滨工业大学ꎬ２０１５.[２２]刘天波ꎬ蔡海林ꎬ滕凯ꎬ等.病毒诱导的基因沉默防控烟草马铃薯Ｙ病毒病研究[Ｊ].中国烟草学报ꎬ２０２０ꎬ２６(５):８２－８９.[２３]魏颖颖ꎬ王凤龙ꎬ钱玉梅.植物与黄瓜花叶病毒互作的研究[Ｊ].植物保护ꎬ２００５(１):１５－１８.[２４]ＷａｔｅｒｈｏｕｓｅＰＭꎬＧｒａｈａｍＭＷꎬＷａｎｇＭＢ.ＶｉｒｕｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｎｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｉｎｐｌａｎｔｓｃａｎｂｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｅｎｓｅａｎｄａｎｔｉｓｅｎｓｅＲＮＡ[Ｊ].ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａꎬ１９９８ꎬ９５(２３):１３９５９－１３９６４.[２５]程英豪ꎬ吴光ꎬ王继伟ꎬ等.表达黄瓜花叶病毒外壳蛋白的１４１㊀第６期㊀㊀㊀㊀郭玉鸽ꎬ等:基于ＶＩＧＳ技术干扰病毒ＲＮＡ防控烟草黄瓜花叶病毒病转基因番茄抗黄瓜花叶病毒侵染[Ｊ].植物学报ꎬ１９９７ꎬ３９(１):１６－２１.[２６]ＦｕｃｈｓＭꎬＭｃＦｅｒｓｏｎＪＲꎬＴｒｉｃｏｌｉＤＭꎬｅｔａｌ.ＣａｎｔａｌｏｕｐｅｌｉｎｅＣＺＷ￣３０ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅｓｏｆｃｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉ￣ｒｕｓꎬｚｕｃｃｈｉｎｉｙｅｌｌｏｗｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓꎬａｎｄｗａｔｅｒｍｅｌｏｎｍｏｓａｉｃｖｉ￣ｒｕｓ￣２ｉｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｔｈｅｓｅｔｈｒｅｅｖｉｒｕｓｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄ[Ｊ].Ｍｏｌ.Ｂｒｅｅｄ.ꎬ１９９７ꎬ３(４):２７９－２９０.[２７]牛颜冰ꎬ王德富ꎬ姚敏ꎬ等.应用ＲＮＡ沉默技术获取抗黄瓜花叶病毒(ＣＭＶ)和烟草花叶病毒(ＴＭＶ)转基因烟草[Ｊ].作物学报ꎬ２０１１ꎬ３７(３):４８４－４８８.[２８]颜培强ꎬ李丽杰ꎬ康宏ꎬ等.应用ＲＮＡｉ技术培育抗２种病毒病的转基因烟草[Ｊ].中国生物工程杂志ꎬ２００７(１１):２７－３１.[２９]郝梦媛ꎬ杭琦ꎬ师恭曜.ＶＩＧＳ基因沉默技术在作物基因功能研究中的应用与展望[Ｊ].中国农业科技导报ꎬ２０２２ꎬ２４(１):１－１３.[３０]ＮｏｗａｒａＤꎬＧａｙＡꎬＬａｃｏｍｍｅＣꎬｅｔａｌ.ＨＩＧＳ:ｈｏｓｔ￣ｉｎｄｕｃｅｄｇｅｎｅｓｉｌｅｎｃｉｎｇｉｎｔｈｅｏｂｌｉｇａｔｅｂｉｏｔｒｏｐｈｉｃｆｕｎｇａｌｐａｔｈｏｇｅｎＢｌｕｍｅ￣ｒｉａｇｒａｍｉｎｉｓ[Ｊ].ＰｌａｎｔＣｅｌｌꎬ２０１０ꎬ２２(９):３１３０－３１４１. [３１]ＶａｌｅｎｔｉｎｅＴＡꎬＲａｎｄａｌｌＥꎬＷｙｐｉｊｅｗｓｋｉＫꎬｅｔａｌ.Ｄｅｌｉｖｅｒｙｏｆｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓｔｏｐｌａｎｔｐａｒａｓｉｔｉｃｎｅｍａｔｏｄｅｓｕｓｉｎｇａｔｏｂａｃｃｏｒａｔｔｌｅｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒ[Ｊ].ＰｌａｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＪｏｕｒｎａｌꎬ２００７ꎬ５(６):８２７－８３４.[３２]田桂英ꎬ乔亚红ꎬ向本春ꎬ等.双抗ＣＭＶ和ＴｏＭＶＲＮＡｉ载体的构建及烟草遗传转化[Ｊ].石河子大学学报(自然科学版)ꎬ２０１２ꎬ３０(６):６８９－６９４.[３３]蒙姣荣ꎬ彭好文.植物病毒系统运转研究进展[Ｊ].安徽农业科学ꎬ２００６ꎬ３４(１３):２９６３－２９６５.[３４]于海龙ꎬ张正海ꎬ曹亚从ꎬ等.辣椒抗黄瓜花叶病毒病研究进展[Ｊ].园艺学报ꎬ２０１９ꎬ４６(９):１８１３－１８２４. [３５]ＷｉｎｔｅｒｍａｎｔｅｌＷＭꎬＺａｉｔｌｉｎＭ.Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｔｒａｎｓｌａｔａｂｉｌｉｔｙｉｎｃｒｅａ￣ｓｅｓｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓｏｆｒｅｐｌｉｃａｓｅ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏＣｕｃｕｍｂｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＧｅｎｅｒａｌＶｉｒｏｌｏｇｙꎬ２０００ꎬ８１(Ｐｔ３):５８７－５９５.[３６]ＴｒｅｔｉａｋｏｖａＰꎬＶｏｅｇｅｌｅＲＴꎬＳｏｌｏｖｉｅｖＡꎬｅｔａｌ.Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｓｉｌｅｎ￣ｃｉｎｇｏｆｔｈｅｍｙｃｏｔｏｘｉｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｇｅｎｅＴＲＩ５ｉｎＦｕｓａｒｉｕｍｃｕｌｍｏ￣ｒｕｍａｎｄｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｒｅｄｕｃｅｄｖｉｒｕｌｅｎｃｅｉｎＶＩＧＳａｎｄＳＩＧＳｅｘ￣ｐｅｒｉｍｅｎｔｓ[Ｊ].Ｇｅｎｅｓꎬ２０２２ꎬ１３(３):３９５.[３７]魏正欣ꎬ孙虎ꎬ向艳涛ꎬ等.病毒诱导基因沉默技术在豆科植物中的应用[Ｊ].中国油料作物学报ꎬ２０２２ꎬ４４(３):４９７－５０２.[３８]张新华ꎬ季娜娜ꎬ闵德栋ꎬ等.ＶＩＧＳ载体在果树中的应用研究进展[Ｊ].果树学报ꎬ２０１７ꎬ３４(４):５０７－５１４.２４１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀。
黄瓜花叶病毒研究进展
黄瓜花叶病毒研究进展摘要综述了黄瓜花叶病毒（cmv）的生物学特性、基因组、病害防控等方面的研究进展，并对国内外当前研究中存在的问题作了相关探讨。
关键词黄瓜花叶病毒；生物学特性；基因组；病害防控中图分类号 s436.421 文献标识码 a 文章编号 1007-5739（2013）03-0121-03黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus，cmv）是雀麦花叶病毒科（bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（cucumovirus）的代表性成员，为单链正义rna（+ssrna）病毒。
cmv能侵染包括单、双子叶植物在内的1 000多种植物，是很多农作物和观赏植物的重要毁灭性病原之一[1]。
cmv在自然界主要通过寄主植物种子或繁殖材料及昆虫传播，是目前所知的寄主最多、分布最广、最具经济危害的植物病毒[2]。
自1916年首次报道cmv是黄瓜花叶病的病原以来，国内外学者相继报道了该病毒在不同寄主上的危害[3-4]。
cmv严重抑制许多作物的正常生长，如引起黄瓜叶片花叶黄化、番茄叶片丝状畸形、香蕉花叶（心腐）、辣椒叶片斑驳畸形及顶死等，这给世界各国的农作物生产造成严重的经济损失。
根据地区分布、寄主范围及症状表现的差异，可以把该病毒划分为不同的株系（strain）。
例如，fny、pf、a9和ls等株系都能够侵染烟草和黄瓜，但它们在侵染茄科作物时，其症状表现存在很大的差异[5]。
近几十年来，国内外学者对该病毒进行过系统研究，特别是对该病毒病害的防控方面提出了相关见解。
本文着重介绍cmv的生物学特性、基因组、病害防控等方面的研究进展，并对当前研究中存在的问题作相关探讨。
1 生物学特性1.1 寄主症状cmv具有很宽的寄主范围，能导致绝大多数寄主发生系统侵染并表现出各种典型症状。
如生长迟缓、节间矮化、叶片斑驳黄化，甚至引起叶片畸形和果实发育不良。
例如，侵染番茄时最典型的症状是引起番茄叶片呈丝线状畸形。
但在一些少数寄主作物（如苜蓿）上却不表现出症状。
黄瓜花叶病毒基因沉默载体的病毒含量和症状分析
第2卷第6期植物医学2023年12月V o l.2N o.6P l a n tH e a l t h a n dM e d i c i n e D e c.2023D O I:10.13718/j.c n k i.z w y x.2023.06.003黄瓜花叶病毒基因沉默载体的病毒含量和症状分析吴娟,李佳燕,李伟,曾紫怡,竺锡武湖南人文科技学院农业与生物技术学院,湖南娄底417000摘要:病毒诱导的基因沉默(V i r u s-i n d u c e dG e n eS i l e n c i n g,V I G S)已被广泛应用于植物基因功能研究,具有操作容易㊁较短时间内即可观察到沉默效果㊁成本较低的特性.黄瓜花叶病毒(C u c u m b e rM o s a i cV i r u s,C MV)V I G S载体已经应用于沉默辣椒㊁烟草㊁大豆等植物基因,对于研究植物基因功能有重要作用.研究以C MV的F n y株系(C MV-F n y)R N A2中2b基因缺失载体C MV-F209ә2b和表达2b基因N端61个氨基酸的载体C MV-F2092b61a a为对象,插入不同长度的外源基因g f p片段后,分析C MV V I G S载体在本氏烟植株上的病毒表达含量及诱导产生的病毒症状.结果表明,插入外源基因片段后,病毒外壳蛋白(C o a tP r o t e i n,C P)基因R N A表达水平均明显降低.携带不同长度g f p序列的重组病毒C MV F2092b61a a-g f p100㊁C MV F2092b61a a-g f p200和C MV F2092b61a a-g f p350其C P R N A 含量比装载最适长度g f p序列的C MV F209ә2b-g f p350高10倍左右,且同样不引发明显病毒症状.由此可见,C MV F2092b61a a相比C MV-F209ә2b更适合作为高效的V I G S载体,且初步探明它的最适插入片段长度为200~350n t.关键词:病毒诱导的基因沉默;黄瓜花叶病毒;2b;病毒含量中图分类号:S432文献标志码:A文章编号:20971354(2023)06002107A n a l y s i s o fV i r u sC o n t e n t a n dS y m p t o m s o fC u c u m b e rM o s a i cV i r u s-b a s e dG e n e S i l e n c i n g V e c t o rWUJ u a n, L I J i a y a n, L IW e i,Z E N GZ i y i,Z HU X i w uI n s t i t u t eo f A g r i c u l t u r ea n dB i o t e c h n o l o g y,H u n a nU n i v e r s i t y o f H u m a n i t i e s,S c i e n c ea n dT e c h n o l o g y,L o u d i H u n a n417000,C h i n a收稿日期:20230923基金项目:湖南省教育厅科研创新平台开放基金(18K100).作者简介:吴娟,博士,讲师,主要从事植保生物技术研究.通信作者:竺锡武,研究员.22植物医学h t t p://x b b j b.s w u.e d u.c n第2卷A b s t r a c t:V i r u s-i n d u c e d g e n e s i l e n c i n g(V I G S)h a s b e e nw i d e l y u s e d f o r p l a n t g e n e f u n c t i o n a l a-n a l y s i s.I t i s e a s y t o o p e r a t e,t o o b s e r v e t h e s i l e n c i n g e f f e c t i n s h o r t t i m e a n d l o wc o s t.C u c u m-b e rM o s a i cV i r u s(C MV)h a s b e e n s u c c e s s f u l l y d e p l o y e d a s aV I G S v e c t o r i n p l a n t s s u c h a s c h i l-i,t o b a c c o a n d s o y b e a n,p l a y i n g a n i m p o r t a n t r o l e i n p l a n t g e n e f u n c t i o n a l a n a l y s i s.I n t h i s s t u d-y,G F P g e n e f r a g m e n t s o f d i f f e r e n t l e n g t h sw e r e i n s e r t e d i n t o t h e2b g e n e d e l e t i o n v e c t o r C MV-F209ә2ba n dC MV-F2092b61a aw i t h t r u n c a t e d2b t o a n a l y z e t h e v i r u s e x p r e s s i o n l e v e l a n d i n-d u c e dv i r u s s y m p t o m s o f t h e s eC MV V I G S v e c t o r s i n N i c o t i a n a b e n t h a m i a n a.T h e r e s u l t s i n d i-c a t e d t h a t t h ea c c u m u l a t i o no fC P R N A w a ss i g n i f i c a n t l y r e d u c e da f t e r i n s e r t i n g f o r e i g n g e n e f r a g m e n t s.T h e C P R N A c o n t e n t s o f r e c o m b i n a n t v i r u s e s C MV F2092b61a a-g f p100,C M-V F2092b61a a-g f p200,a n d C MV F2092b61a a-g f p350c a r r y i n g d i f f e r e n t l e n g t ho fG F Ps e q u e n c e s w e r e a b o u t10t i m e sh i g h e r t h a nt h a to fC MV F209ә2b-g f p350c a r r y i n g t h eo p t i m a l l e n g t ho f G F P s e q u e n c e,a n d t h e y a l s o d i d n o t c a u s e o b v i o u s v i r u s s y m p t o m s.T h e r e f o r e,C M-V F2092b61a a i sm o r e s u i t a b l e a s a n e f f i c i e n tV I G S v e c t o r t h a nC MV-F209ә2b,a n d i t s o p t i m a l f r a g m e n t l e n g t ho f i n s e r t i o nh a s b e e n p r e l i m i n a r i l y d e t e r m i n e d t ob e200~350n t.K e y w o r d s:v i r u s-i n d u c e d g e n e s i l e n c i n g;c u c u m b e rm o s a i c v i r u s;2b;v i r u s c o n t e n t病毒诱导的基因沉默(V i r u s-i n d u c e dG e n eS i l e n c i n g,V I G S)是指携带目的基因片段的病毒侵染植物后在植物体内产生d s R N A,被宿主的R N A干扰(R N A i n t e r f e r e n c e,R N A i)体系将携带有植物基因片段的重组病毒的转录产物降解为21~30n t的s i R N A s,然后s i R N A s靶向降解与其序列同源的植物内源靶基因的转录产物,瞬间下调靶基因的表达,从而使植物在2~3周内快速出现功能缺失表型[1].它是一种转录后水平的基因沉默现象,病毒介导的基因沉默技术与转基因介导的基因沉默技术因其双链R N A来源不同而作为R N A干扰(R N A i)技术的两个分支存在.这种方法操作简便㊁快速㊁有效,适用于进行高通量操作,所以V I G S成为进行大规模靶基因功能筛选的重要研究工具,尤其对于那些难以进行转基因的物种.研究发现,至少有50多种来自不同科属的病毒能作为各种模式植物和一些农作物的V I G S载体[2].黄瓜花叶病毒(C u c u m b e rM o s a i cV i r u s,C MV)是一种球形的二十面体病毒,直径为28~ 30n m,存在于细胞的细胞质和细胞核中[3].黄瓜花叶病毒属于雀麦花叶病毒科㊁黄瓜花叶病毒属的一个典型成员.它可以感染1200多种植物,是自然界分布最广㊁宿主最多的植物病毒之一[4].黄瓜花叶病毒是三分体病毒类型,其遗传信息库包括有3条正单链(R N A1㊁R N A2和R N A3),可合成1a蛋白㊁2a蛋白㊁3a蛋白㊁外壳蛋白(C o a t P r o t e i n,C P)等;2b蛋白翻译自亚基因组R N A4A,参与病毒细胞间移动㊁R N A沉默的抑制及对抗植物体S A诱导的抗性,也与病毒症状的产生密切相关[5].2b蛋白是C MV最小的蛋白,只有约110个氨基酸,它是最早被称为病毒R N A沉默抑制子(V i r a lS u p p r e s s o ro fR N A S i l e n c i n g,V S R)的病毒蛋白,其N端61个氨基酸就是抑制活性部位,对于结合s i R N A双链是必需的[6-7].目前C MV病毒载体的研究都已将C MV的R N A s1㊁2和3的全长c D N A片段分别连入p C B301等植物表达载体双35S 启动子的下游,构建C MV侵染性克隆,该侵染性克隆可以通过农杆菌浸润的方法接种至植物,造成系统侵染[8].C MV V I G S载体的构建主要是对R N A2进行改造,去掉部分或全部2b基因序列,引入终止密码子和M C S,由于改造过程中,2b蛋白遭到破坏,降低了其对R N A沉默的抑制,使其更适合于病毒诱导基因沉默[9-10].姚敏等[8]的研究表明,2b缺失突变体C MV-F n yΔ2b在本氏烟上虽然早期有微弱的曲叶症状,但中后期无任何症状,R T-P C R检测表明F n y2b缺失突变体可系统侵染本氏烟,这与D i n g等[11]早期报道2b 缺失后能够系统侵染普通烟相一致.2b 基因缺失后,C MV -F n yΔ2b 能系统性侵染寄主植物,但病毒基因组R N A 大大降低[12].程晓东等[10]用C MV 不同株系的R N A 2与C MV -F n y 基因组R 1和R 3进行组合接种,获得在本氏烟中症状轻的病毒组合F 1T s h R 2F 3,T s h R 2的2b 基因缺失3'端的95n t 碱基(T s h 2V I G S )后病毒能系统性侵染寄主植物,但降低病毒外壳蛋白(C o a t P r o t e i n ,C P )含量.2b 基因完全缺失也有可能影响C MV V I G S 载体在一些植物上的复制和系统移动,导致无侵染性,所以报道的C MV 载体一般保留了2b 蛋白的N 端60~94个氨基酸序列[9].也有观点认为,保留的2b 序列内含R N A 沉默抑制子活性的功能域,有可能会影响病毒诱导的基因沉默[9].向志丹等[13]的研究发现,基于沉默的效率和稳定性,完全缺失2b 基因的载体C MV -F n yΔ2b 的最适插入片段是350n t 左右.本试验分析了C MV -F n y Δ2b 载体插入350b p 的g f p 外源基因片段,以及C MV -F 2092b 61a a 载体分别插入100b p ㊁200b p 和350b p 的g f p 外源基因片段,其病毒外壳蛋白R N A 水平的变化,及诱导产生的病毒症状的变化.1 材料与方法1.1 试验试剂限制性内切酶㊁T a q P C R 酶㊁P y r o b e s t D N A 聚合酶㊁M -M L V 反转录酶(R N a s e H -)㊁重组R N a s e 抑制剂㊁T 4D N A 连接酶购于宝日医生物技术(北京)有限公司;D N A 清洁回收试剂盒㊁D N A 凝胶回收试剂盒㊁质粒提取试剂盒购于爱思进生物技术(杭州)有限公司;2ˑq P C RM i x (S Y B R G r e e n Ⅰ)㊁引物购于北京擎科生物科技股份有限公司;T r i z o l 试剂购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司;其他试剂购于生工生物工程(上海)股份有限公司.1.2 寄主植物本氏烟幼苗于25ħ㊁16h 光照/8h 黑暗的植物培养室中培养,生长至5~7叶期接种病毒.1.3 质粒及其构建C MV F n y 基因组R N A 1-3的侵染性克隆(p C B 301-C MV F 109,p C B 301-C MV F 209和p C B 301-C MV F 309)和2b 基因缺失质粒p C B 301-C MV F 209ә2b -M C S 由浙江理工大学赠与.p C B 301-F 2092b 61a a -M C S 是以质粒p C B 301-F 209ә2b -M C S 为基础构建的.以本实验室已有的p C B 301-C MV F 209质粒为模板,采用引物2b N c o I F 2和2b 61a a M l u R 通过P C R 扩增2b 61a a 的D N A 序列片段,大小为750b p 左右,p C B 301-C MV F 209ә2b -M C S 质粒用N c o I 和M l u I 双酶切后,切下570b p 左右片段后,约7400b p 载体片段与同样经过酶切的PC R 产物连接,获得pC B 301-C MV F 2092b 61a a -M C S 质粒.为了构建含不同长度的g f p 基因片段的重组质粒,采用不同的下游引物与G F P 350M l u F 组合,P C R 扩增获得100b p ,200b p 和350b p 的g f p 基因片段.经M l u I 和B a mHI 酶切,克隆至预先经M l u I /B a mHI 酶切的p C B 301-C MV F 209ә2b -M C S 和p C B 301-C MV F 2092b 61a a -M C S质粒,构建产生重组质粒p C B 301-C MV F 209ә2b -g f p 350,p C B 301-C MV F 2092b 61a a -g f p 100,p C B 301-C MV F 2092b 61a a -g f p 200和p C B 301-C MV F 2092b 61a a -g f p 350.所有重组质粒均测序正确,C MV 载体构建过程见图1.32第6期 吴娟,等:黄瓜花叶病毒基因沉默载体的病毒含量和症状分析图1 C MV 载体构建示意图1.4 农杆菌浸润接种病毒p C B 301-C M V F 109~F 309,p C B 301-C M V F 209ә2b -M C S ,p C B 301-C M V F 2092b 61a a -M C S ,p C B 301-C M V F 209ә2b -g f p 350,p C B 301-C M V F 2092b 61a a -g f p 100,p C B 301-C M V F 2092b 61a a -g f p 200和p C B 301-F 2092b 61a a -g f p 350质粒采用冻融法转入农杆菌GV 3101中,农杆菌浸润接种本氏烟参考张斯(2014)的方法,农杆菌G V 3101(p C B 301-C MV F 109)㊁G V 3101(p C B 301-C MV F 209,p C B 301-C MV F 209ә2b -M C S 等)和G V 3101(pC B 301-C MV F 309)等比例混合,用无针头注射器浸润接种于6~7叶龄本氏烟中间叶位相对的两叶片,接种后的本氏烟25ħ黑暗处理24h 后,继续25ħ㊁16h 光照/8h 黑暗温室培养.1.5 q R T -P C R 分析接种烟草C MVC P 基因m R N A 含量提取C M V ,C M V F 209ә2b -M C S ,C M V F 209ә2b -g f p 350,C M V F 2092b 61a a -M C S ,C M V F 2092b 61a a -g f p 100,C M V F 2092b 61a a -g f p 200和C M V F 2092b 61a a -g f p 350侵染本氏烟相同叶位系统叶的总R N A ,并用R N a s e -F r e eD N a s e 消化以除去D N A.总R N A 经n a n o d r o p 初步定量和1ˑTB E 琼脂糖电泳进行质量检测.以本氏烟A c t i n 为内参基因,C MV C P 基因特异的q R T -P C R 引物为F 309C P q F 2和F 309C P q R 2,具体引物序列见表1.总R N A 用M -M L V 反转录酶进行反转录,q R T -P C R 按照试剂盒的说明书进行.C P 基因的m R N A 相对表达水平通过2-ΔC t 法计算获得.表1 引物信息引物名称引物序列(5'~3')用途2b N c o I F 2C A T G C C A T G G C T G A G T T T G C C T G p C B 301-C MV F 2092b 61a a -M C S 质粒构建2b 61a a M l u RA C T C C G C C A C G T T C A C A T G A T C C A C T T G A T A G A A C G G T A G G F P M l u F C G A C G C G T G A G C T G A A G G G C A T C G A C T g f p 片段克隆共用正向引物G F P 350B a mH RC G G G A T C C T T A C T T G T A C A G C T C G T C C A T g f p 350克隆G F P 200B a mH R C G G G A T C C T C G C C G A T G G G G G T G T T C g f p 200克隆G F P 100B a mH RC G G G A T C C T C T T C T G C T T G T C G G C C A T G g f p 100克隆F 309C P q F 1G A A G C T T G T T T C G C G C A T T C q R T -P C R F 309C P qR 1C A C C T A T A T C A G C G C G C A T C q R T -P C R N b A c t i n F 1C C A C A T G C C A T T C T C C G T C T q R T -P C R N b A c t i n R 1T C C C T G A C A A T T T C C C G C T C qR T -P C R 42植物医学 h t t p ://x b b jb .s w u .e d u .c n 第2卷1.6 数据处理与统计学分析本研究所收集数据采用S P S S26.0软件进行分析.2 结果与分析2.1 C MVF n y 及重组病毒在本氏烟上的症状反应将C M VF n y RN A 2进行改造后,只表达2b 基因N 端61个氨基酸的病毒C M V F 2092b 61a a 在接种后的本氏烟上的病毒症状反应与C MV F n y 相比轻很多,植株无严重矮化和叶片卷曲症状,只是幼叶呈现浓绿与淡绿不均匀的斑驳即轻花叶症状,而完全缺失2b 基因的病毒C M -V F 209ә2b 则无明显病毒症状(图2).携带100b p ~350b p 的外源基因片段的重组病毒C M -V F 2092b 61a a -g f p 100,C MV F 2092b 61a a -g f p 200,C MV F 2092b 61a a -g f p 350和C MV F 209ә2b -g f p 350都不表现明显病毒症状反应(表2).图2 本氏烟接种病毒或缓冲液(M o c k )15d 的症状表2 C MVF n y 及重组病毒在本氏烟上的症状反应病毒本氏烟症状C MVF n y 植株严重矮化和叶片卷曲C MV F 2092b 61a a轻花叶C MV F 209ә2b 无明显病毒症状C MV F 209ә2b -g f p 350无明显病毒症状C MV F 2092b 61a a -g f p 100无明显病毒症状C MV F 2092b 61a a -g f p 200无明显病毒症状C MV F 2092b 61a a -g f p 350无明显病毒症状2.2 病毒在本氏烟上的含量分析为了分析改造后的C MV V I G S 载体C MV F 209ә2b ,C MV F 2092b 61a a 和携带外源基因片段的重组病毒是否会影响病毒基因组含量,将100n t ~350n t 不等的外源基因片段插入改造后的C MV V I G S 载体,并将C MVF n y ㊁改造后的病毒载体及重组病毒C MV F 2092b 61a a -g f p 100,C MV F 2092b 61a a -g f p 200,C MV F 2092b 61a a -g f p 350和C MV F 209ә2b -g f p 350通过农杆菌浸润法接52第6期 吴娟,等:黄瓜花叶病毒基因沉默载体的病毒含量和症状分析种本氏烟.在接种后15d ,通过荧光定量P C R 方法,对成功接种的本氏烟相同叶位的上部系统叶(非顶部叶片)中的C MVC P 基因m R N A 水平进行相对定量.结果如图3所示,与野生型病毒C M VF n y 相比,改造后的病毒C M V F 2092b 61a aC P 基因表达量下降了52%,而C M V F 209ә2b 下降96%;与C M V F 2092b 61a a 相比,插入外源基因片段的重组病毒2b 61a a -g f p 100,2b 61a a -g f p 200和2b 61a a -g f p 350分别下降了90%,32%和78%.已有报道C MV F 209ә2b 作为基因沉默载体,最适插入片段为350n t 左右,而装载350n t 片段后C P 基因表达量下降了66%.C P 基因的表达量代表了病毒基因组R N A 水平,以上结果说明,作为基因沉默载体,C MV F 2092b 61a a 比C MV F 209ә2b 在本氏烟上病毒含量高10倍以上,且装载外源基因片段的2b 61a a -g f p 350和2b 61a a -g f p 200其病毒量也是C M V F 209ә2b -g f p 350的10倍以上.由于C M V F 2092b 61a a 装载100~350n t 不等的外源基因片段后,在本氏烟上也不表现明显病毒症状,但其具有更高的表达量,将会产生更高的沉默效率,所以比C MV F 209ә2b 更适合作为基因沉默载体,且本研究初步发现它的最适插入片段是200n t 左右.图3 q R T -P C R 分析病毒侵染烟草中C P m R N A 含量3 结论与讨论病毒诱导基因沉默(V I G S )已经成为一种常用的基因功能研究工具,大约有50多种病毒能用于植物的基因沉默.其中,烟草脆裂病毒(T o b a c c oR a t t l eV i r u s ,T R V )㊁马铃薯X 病毒(P o -t a t oV i r u sX ,P V X )㊁苹果潜隐球形病毒(A p p l eL a t e n t S ph e r i c a lV i r u s ,A L S V )等已经建立起了稳定的用于双子叶植物基因沉默的体系.但是,在单子叶植物中,V I G S 的应用还是非常有限.黄瓜花叶病毒属于雀麦花叶病毒科㊁黄瓜花叶病毒属的一个典型成员.它可以感染1000多种植物,因此是分布最广㊁宿主最多的植物病毒之一.C MV -F n y 属于C MV 中S u b g r o u p Ⅰ,是强致病性的株系.本研究将C MV -F n y 接种于本氏烟,7d 后植株开始呈现叶片蜷曲㊁皱缩的症状,随后症状还有加重的趋势,15d 后植株还明显矮化.以植物病毒作为V I G S 载体,首先该病毒载体在寄主植物上引发的症状反应要轻微,以免引发的严重症状干扰目标基因沉默后植株表型.对C MV -F n y R N A 2进行改造后,2b 基因完全缺失的载体C MV F 209ә2b 在本氏烟上不表现明显病毒症状,保留2b 基因N 端61个氨基酸的载体C MV F 2092b 61a a 虽然表现一定的病毒症状,62植物医学 h t t p ://x b b jb .s w u .e d u .c n 第2卷但插入100~350n t 不等的外源基因g f p 片段后,也都不表现明显病毒症状.由于缺失基因沉默抑制子2b 蛋白,C MV F 209ә2b 能系统侵染本氏烟,但影响病毒C P 含量,病毒基因组含量显著降低,而C MV F 2092b 61a a 的病毒基因组C PR N A 含量高很多,这可能与2b 蛋白其抑制活性位于其N 端61氨基酸有关.虽然装载外源基因片段后,病毒C P 含量都明显降低,重组病毒C MV F 2092b 61a a -g f p 100,C MV F 2092b 61a a -g f p 200和C MV F 2092b 61a a -g f p 350均比装载最适长度的C MV F 209ә2b -g f p 350高很多,且同样不引发明显病毒症状.作为高效的V I G S 载体,不仅在寄主植物上引发的病毒症状轻微,且病毒表达含量高.所以,C MV F 2092b 61a a 更适合作为高效的V I G S 载体,且它的最适插入片段是200~350n t .参考文献:[1]郭惠珊,高峰,赵建华,等.发展基因沉默技术,控制作物土传真菌病害[J ].中国科学院院刊,2017,32(8):822-829.[2] A B R A HAM I A NP ,HAMMO N DR W ,HAMMO N DJ .P l a n tV i r u s -D e r i v e dV e c t o r s :A p p l i c a t i o n s i nA gr i c u l -t u r a l a n d M e d i c a l B i o t e c h n o l o g y [J ].A n n u a lR e v i e wo fV i r o l o g y ,2020,7(1):513-535.[3] P A L U K A I T I SP ,G A R C ÍA -A R E N A LF .C u c u m o v i r u s e s [J ].A d v a n c e s i nV i r u sR e s e a r c h ,2003,62:241-323.[4] S A L ÁN K IK ,G E L L ÉR T Á,N E M E SK ,e t a l .M o l e c u l a rM o d e l i n g f o rB e t t e rU n d e r s t a n d i n g o fC u c u m o v i r u s P a t h o l o g y [J ].A d v a n c e s i nV i r u sR e s e a r c h ,2018,102:59-88.[5] J A C Q U E MO N D M.C u c u m b e rM o s a i cV i r u s [M ]//A d v a n c e s i nV i r u sR e s e a r c h .A m s t e r d a m :E l s e v i e r ,2012:439-504.[6] HWA N G M S ,L I N D E NMU T H BE ,M C D O N A L D K A ,e t a l .B i p a r t i t e a n dT r i p a r t i t eC u c u m b e rM o s a i cV i -r u s -B a s e dV e c t o r s f o rP r o d u c i n g t h eA c i d o t h e r m u sC e l l u l o l y t i c u sE n d o -1,4-β-G l u c a n a s ea n do t h e rP r o t e i n s i n N o n -T r a n s g e n i cP l a n t s [J ].B M CB i o t e c h n o l o g y ,2012,12:66.[7] D U A N C G ,F A N G Y Y ,Z HO U BJ ,e t a l .S u p p r e s s i o no fA r a b i d o p s i sA R G O N A U T E 1-M e d i a t e dS l i c i n g,T r a n s g e n e -I n d u c e dR N AS i l e n c i n g ,a n dD N A M e t h y l a t i o nb y D i s t i n c tD o m a i n so f t h eC u c u m b e rM o s a i cV i r u s 2bP r o t e i n [J ].T h eP l a n tC e l l ,2012,24(1):259-274.[8] 姚敏,张天奇,田志超,等.农杆菌介导的C MV 侵染性克隆及2b 缺失突变体构建[J ].中国农业科学,2011,44(14):3060-3068.[9] 王蓉.用于玉米基因功能研究的黄瓜花叶病毒基因沉默载体的创建[D ].北京:中国农业大学,2016.[10]程晓东,施伟,杜志游,等.基于黄瓜花叶病毒(C MV )基因沉默载体的构建[J ].农业生物技术学报,2015,23(12):1550-1558.[11]D I N GS W ,L IW X ,S YMO N SR H.A N o v e lN a t u r a l l y O c c u r r i n g H y b r i dG e n eE n c o d e db y aPl a n tR N A V i -r u sF a c i l i t a t e sL o n g Di s t a n c eV i r u sM o v e m e n t [J ].T h eE M B OJ o u r n a l ,1995,14(23):5762-5772.[12]朱品,常发光,杜志游,等.基于黄瓜花叶病毒基因组R N A 2的外源基因表达载体研究[J ].浙江理工大学学报(自然科学版),2017,37(2):265-269.[13]向志丹,张震霄,李超,等.黄瓜花叶病毒基因沉默载体的效率和稳定性分析[J ].浙江农业学报,2017,29(4):625-630.责任编辑 苏荣艳72第6期 吴娟,等:黄瓜花叶病毒基因沉默载体的病毒含量和症状分析。
黄瓜花叶病毒自然重组株Tsh基因组RNA的功能研究
中 图 分 类 号 ：５ ７２ ￥６ ． 文 献 标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ １ ７ １ （０ ０ ０ — ４ ２ ０ １０ — １ ９ ２ １ ） ３ ０ ０ — ５
Ｉ ｄ ｎ ｉ ｃ ｔ ｇ Ｇｅ ｏ ｃ ＲＮＡ ｕ ｃｉ ｎ ｆａ Ｃｕ ｕ ｂ ｒ ｎ ｅ ｔ ｉａ ｉ ｎ ｍｉ ｆ ｎ Ｆ ｎ ｔ ｓｏ ｃ ｍ ｅ ｏ
Ｖ０ ．６ Ｎｏ ３ １２ ． Ｍ ａ ２ ０ ｖ ０１
科 技 通 报
Ｂ Ｌ Ｔ Ｎ ０Ｆ Ｓ ＥＮＣ ＵＬ Ｅ Ｉ ＣＩ Ｅ ＡＮＤ Ｅ Ｔ ＣＨＮ０Ｌ Ｙ ０Ｇ
第２ ６卷 第 ３ 期
２ ０年 ５月 ０１
黄瓜花 叶病毒 自然重组株 Ｔ ｈ基 因组 ｓ Ｒ Ａ的功 能 研 究 Ｎ
（ ｓｔｔ ｏ ｉｅｇ ｅｒ ｇ Ｚ ｅｉ ｇ ｃ Ｔ ｃ ｎｖｒ ｔ， ａｇｈｕ３０ １ ，ｈｎ ） Ｉ ｔｕｅ ｆ ｏｎ ｉ ｅ ｎ ，ｈｊ ｎ ｉ ｅｈＵ ｉ ｓｙ Ｈ ｎｚｏ １０ ８ Ｃ ｉ ｎｉ Ｂ ｎ ｉ ａ Ｓ— ｅｉ ａ
Ａｂ ｔａ ｔＴ ｈＣＭＶ，ｎ ｉｔ ｓｅ ｉ ｃｒａ ｓｒ ｎ ｅｗ ｅ ｃ ｍｂ ｒｍｏａｃ ｖｒ ｓ （ ＭＶ）ｓ ｂ ｒｕ Ａ ａ ｄ Ｉ， ａ ｂ ｓｒ ｃ ：ｓ — ａ ｎｒ ｐ ｃｆ ｅ ｓｏｔ ｔｂ ｔ ｅ ｎ Ｃｕ ｕ ｅ ｓｉ ｉ ａ ｉ ａ ｕ Ｃ ｕ ｇｏ ｐ Ｉ ｎ Ｉｗ ｓｏ －
ｔ ｉ ｅ ｒ ｍ ａ ｕ ａ — ｆ ｃｅ ｏ ｔ ｏｌ ｃｅ ｒ ｍ ｈ ｎ ｈ ｉ Ｃ ｉ ａ ｎ ｅ ｔ ｕ ＤＮＡ ｌ ｎ ｓ ｏ ｓ — ＭＶ Ａ２ ｎ ａｎ ｄ ｆｏ ｎ ｔ ｒ ｌｉ ｅ ｔｄ ｔ ｍａｏ ｃ ｌ ｔｄ ｆ ｎ ｅ ｏ Ｓ ａ ｇ ａ ， ｈ ｎ ．Ｉｆ ｃ ｉ ｓ ｃ ｏ ｃｏ ｅ ｆ Ｔ ｈ Ｃ ＲＮ ａ ｄ
黄瓜花叶病毒
播种前对种子进行消毒处理， 杀灭种子携带的病毒。
田间管理
合理密植，科学施肥，定期浇 水，及时清除病株和杂草，减 少病毒传播途径。
病虫害防治
定期喷洒杀虫剂、杀菌剂等化 学药剂，控制黄瓜病虫害的发 生，减轻病毒病的危害。
采收与贮藏
采收时避免损伤黄瓜，贮藏前对 贮藏环境进行消毒处理，降低病
毒在贮藏过程中的传播风险。
04 农业防治方法
选用抗病品种
选择经过认证的抗病品种
选择经过农业部门或专业机构认证的抗病品种，这些品种在遗传上对黄瓜花叶病 毒具有较强的抗性。
考虑当地气候和土壤条件
在选择抗病品种时，还需要考虑当地的气候和土壤条件，以确保品种能够适应当 地的生长环境。
加强田间管理
定期巡查田间
定期巡查田间，及时发现 并处理感染黄瓜花叶病毒 的植株，以减少病毒在田 间的传播。
和危害。
案例二
某科研机构利用生物防治技术， 如天敌昆虫的利用、病毒弱毒株 系的筛选等，有效减少了黄瓜花
叶病毒的发生和扩散。
案例三
某农户在发现黄瓜花叶病毒病株 后，立即采取拔除病株、喷洒药 剂等措施，及时控制了病情的蔓
延。
防治过程中的问题与解决方案
问题一
病毒变异导致防治效果下降。解决方案：加强病毒监测和预警，及 时发现和应对病毒变异，同时推广使用广谱抗病毒药剂。
黄瓜花叶病毒
contents
目录
• 黄瓜花叶病毒概述 • 黄瓜花叶病毒的症状与识别 • 黄瓜花叶病毒的防治原则与策略 • 农业防治方法 • 生物防治方法 • 化学防治方法 • 黄瓜花叶病毒防治的实践与经验
01 黄瓜花叶病毒概述
定义与特点
黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，简称CMV）是 一种非常普遍且具有破坏性的植
黄瓜花叶病毒卫星RNA研究进展
。
Ｔｋ ｒ ７等 。亚组 里 Ｃ ＭＶ 株 系 间 的关 系 比不 同亚 组
问 的关 系 更 为 密 切 。
Ｃ ＭＶ是 三 组 分 单 链 、 义 Ｒ 正 ＮＡ 病 毒 ， 有 含
ＲＮＡ１ ＲＮＡ２ ＲＮＡ３三 条 基 因 组 Ｒ ］ 这 三 个 ， ， ＮＡ ， ＲＮＡ 组 分 分 布 于 不 同 的 粒 子 中 ｌ 。 Ｒ ５ ］ ＮＡ１含 有 一
黄 瓜 花 叶病毒 （ ｕ ｕ ｂ ｒ ｓｉ ｖｒ ｓ ｃ Ｃ ｃ ｍ ｅ ａｃ ｉｕ ， ＭＶ） ｍｏ 是雀 麦花 Ｉ 病 毒科 （ ｒ ｍｏ ｉｄ ｅ ，黄 瓜 花 叶 病 毒 １ － ｒ Ｂ ｏ ｖｒ ａ ） ｉ 属 （ ｕｕ ｖｒ ｓ的典 型成 员 。 自从 １ １ Ｃ ｃ ｍｏ ｉｕ ） ９ ６年在 黄瓜 上 被首次 发现 以来 ， 已发 现 黄瓜 花 叶病 毒 与 世界 上 所 有 的温 度带 上 的许 多植 物 病 害 有 关 。Ｃ ＭＶ 的寄 主范 围相 当广 泛 ， 能侵 染 ８ ５科 ３ ５属 １ ０ ６ ０ ０多种 植 物 ， 中包 括 许 多经 济 上 很 重 要 的作 物 如 番 茄 、 其． 黄 瓜 、 草 、 椒 、 菜 、 苣 、 瓜 和 果 树 如 香 蕉 等 烟 辣 白 莴 西
山 东林 业 科技
２１ 第 ６ ００年 期
总 １１ ９ 期
Ｓ Ｎ Ｏ Ｏ Ｅ Ｔ Ｙ Ｓ ＩＮＣ Ｎ Ｅ ＨＮ Ｉ Ｇ ＨＡ Ｄ ＮＧ Ｆ Ｒ Ｓ Ｒ ＣＥ Ｅ Ａ Ｄ Ｔ Ｃ Ｏ Ｙ Ｏ
２ １． ｏ ０ ０ Ｎ ．
文章编号 ：０ ２ ２ ２ （ ０ ０ ０ — ０ ８ ～ ０ １０ — ７４ ２ １）６ ０６ ３
知 多数 Ｃ ＭＶ 株 系 包含 卫 星 Ｒ ＮＡ， ＭＶ 卫 星 ＲＮ 能 够修 饰 Ｃ Ｃ Ａ ＭＶ 感 染 寄 主植 物后 的症 状 。 目前 对 于 Ｃ ＭＶ 卫 星 Ｒ ＮＡ 与 辅 助病毒 Ｃ ＭＶ 互作 机 制 的研 究还 很 不 深 入 ， 文 简要 综述 黄 瓜 花 叶病 毒 卫 星 Ｒ Ａ 研 究 进展 。 本 Ｎ 关 键 词 ： 瓜 花 叶病 毒 ； 星 Ｒ 黄 卫 ＮＡ ； ＮＡ 沉 默 Ｒ
抗黄瓜花叶病毒活性化合物的研究新进展
抗黄瓜花叶病毒活性化合物的研究新进展黄瓜花叶病毒是寄主植物最多、分布最广、为害经济作物最重的作物病毒之一，本文就近年来通过半叶枯斑法筛选的抗黄瓜花叶病毒化合物进行综述。
标签：黄瓜花叶病毒；生物活性；研究进展黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）引起的植物病毒病是寄主植物最多、分布最广、为害经济作物最重的作物病毒之一，给作物生产造成了巨大的经济损失。
通过半叶枯斑法是筛选和发现高活性抗病毒化合物的主要手段之一。
近年来，通过活性测试筛选的抗黄瓜花叶病毒化合物主要分为以下几类，即微生物源类、海洋生物源类、天然产物源类和杂环类，本文就近几年具有代表性的新型抗CMV病毒剂的结构和生物活性进行综述。
一、抗黄瓜花叶病毒活性化合物1.微生物源类。
宁南霉素的有效成分是从诺尔斯链霉菌西昌变种（Strepcomcesnourseivar. xichangensis）中分离得到的胞嘧啶核苷类化合物。
严等在田间药效试验中发现2 %宁南霉素水剂对CMV具有一定防治效果；2.海洋生物源类。
苏等研究发现2.0 %氨基寡糖素水剂可用于防治烟草病毒病（TMV、CMV），防治效果达到72.4 %～77.9 %，使用2.0 % 氨基寡糖素不但可以控制病毒病危害，对烟草生长还有促进作用；3.天然产物源类。
云芝多糖由云芝或从其发酵液中分离提取，具有突出的药食用功效和生物活性。
沈等人，用云芝多糖处理普通烟NC-89后，对其主要病毒病（TMV、CMV和PVY）具有良好的防治效果，最高防效均在50 %以上，实验还发现云芝多糖可以延迟烟草病毒病的发病时间，有利于烟苗的生长。
4.杂环类。
2015年，龙等研究发现含有喹唑啉酮的新型戊二烯类衍生物7a （如图2）对CMV具有很好的保护活性和治疗活性，其EC50值分别为124.3 和365.5 μg/mL，对照药剂宁南霉素的保护活性和治疗活性分别为195.1 和404.9 μg/mL。
江西省莲花县百合病毒病分子鉴定
胶回收试剂盒说明书进行回收纯化。
·148·
生物灾害科学
第 44 卷第 2 期
将 PCR 纯化回收产物连接至载体 pMD18-T，转化感受态大肠杆菌 DH5α，以通用引物 M13F/R 进行 菌落 PCR 鉴定，鉴定得到的阳性克隆菌液送北京新业擎科公司测序，测序结果与 GenBank 数据库已登 录的序列进行 BLAST 比对。
收稿日期：2021-04-20 基金项目：国家自然科学基金项目（31860494） 作者简介：叶晓梦（1997—），硕士生，主要从事植物病理学研究，xiaomeng_ye@；通信作者：崔汝强，教
授，博士，cuiruqiang@。
2021 年第 2 期
叶晓梦等：江西省莲花县百合病毒病分子鉴定
·147·
合后症状表现为轻型花叶、斑驳和扭曲，病叶最后脱水变褐；花畸形，花瓣开裂呈现长条纹状。重病 株矮化，鳞片短不开花。百合斑驳病毒为马铃薯 Y 病毒属（Potyvirus）成员，侵染百合后一般无症状 表现或产生褪绿斑，与黄瓜花叶病毒复合侵染时产生花叶和坏死斑[5-8]。百合无症病毒单独侵染百合时 一般无明显症状出现，但在一定温度下，某些品种会出现特异症状。如在 15 ℃下侵染麝香百合幼苗一 定时间，幼苗出现卷曲条纹（白色斑纹和叶片扭曲状）[8]。在自然侵染状态下，百合无症病毒和黄瓜 花叶病毒复合侵染引起百合坏死斑病[4]。【拟解决的关键问题】本研究对江西省莲花县坊楼镇东边村 百合谷的疑似病毒病花叶、卷曲等症状的百合病株，进行室内分子检测鉴定，采用多重 RT-PCR 技术 实现了百合病毒病毒源检测。
2 µL、引物 CMV-R（10 mmol/ L）2 µL、ddH2O 14 µL、cDNA 2 µL。PCR 扩增程序为 95 ℃，3 min；95 ℃， 30 s；57 ℃，15 s；72 ℃，30 s；共 35 个循环；72 ℃，5 min。除扩增引物及退火温度有所变化，下文
黄瓜花叶病防治方法
防治效果影响因素
1 2
药剂因素
药剂的种类、剂型、浓度等都会影响防治效果。
环境因素
气候、土壤、水质等环境条件也会影响防治效果 。
3
农业措施
种植制度、水肥管理、病虫害防治等农业措施也 会影响防治效果。
提高防治效果的措施
选择高效药剂
选择针对黄瓜花叶病的高效药 剂，确保防治效果。
科学施药
按照药剂使用说明进行科学施 药，注意药剂的浓度、使用时 间等。
综合防治
现有的防治方法主要以化学防治为主，缺乏综合防治措施，因此需 要加强生物防治、物理防治等方面的研究。
发展方向与建议
加强抗病品种选育
针对CMV的生物学特性和传播途径，应加强抗病品种的选育，提高 黄瓜的抗病性。
综合防治措施
应采取综合防治措施，包括生物防治、物理防治等手段，以降低 CMV的传播和感染风险。
强化农业措施
采取科学的种植制度、水肥管 理、病虫害防治等农业措施， 降低黄瓜花叶病的发病率。
提高植物免疫力
通过加强植物保健措施，提高 黄瓜的免疫力，降低发病率。
05
结论与展望
研究成果总结
生物学特性
传播途径
黄瓜花叶病毒（CMV）是一种双链RNA病 毒，具有较为复杂的基因组结构和生物学 特性。
CMV主要通过蚜虫传播，也可通过机械摩 擦传播。
病原与传播途径
病原
黄瓜花叶病的病原是一种病毒，称为 黄瓜花叶病毒（Cucumber Mosaic Virus，简称CMV）。
传播途径
黄瓜花叶病毒可以通过蚜虫、蓟马等 昆虫传播，也可以通过接触摩擦传播 。
对黄瓜生长的影响
生长发育受阻
患有黄瓜花叶病的黄瓜植株生长 发育会受到严重影响，植株矮小 、叶片皱缩、花朵畸形，导致产
黄瓜花叶病毒基因沉默抑制子2b蛋白的结构和功能的开题报告
黄瓜花叶病毒基因沉默抑制子2b蛋白的结构和功能的开题报告一、研究背景黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus, CMV）是广泛分布于全球的植物病毒，会感染多种植物，包括黄瓜、番茄、辣椒等经济作物。
CMV感染的植株表现为叶片变黄、畸形、矮化等症状，导致产量和品质下降，给农业生产带来严重的损失。
因此，研究CMV的致病机理和防治策略具有重要的意义。
黄瓜花叶病毒基因组由正链单股RNA分子组成，含有四个开放阅读框（ORF）。
其中，ORF2编码一个分子量为28 kDa的蛋白，称为黄瓜花叶病毒基因沉默抑制子2b（2b）蛋白。
研究表明，2b蛋白能够抑制植物的基因沉默机制，干扰植物的反病毒防御反应，从而增加病毒在植物体内的复制和传播能力。
因此，2b蛋白成为研究CMV感染机制和防治的重要靶点。
二、研究内容本研究旨在揭示黄瓜花叶病毒基因沉默抑制子2b蛋白的结构和功能。
具体研究内容如下：1. 通过生物信息学方法对CMV 2b蛋白的结构进行预测，确定其潜在功能区域，并进行跨物种序列比对，进一步确认其保守性和功能域。
2. 利用重组蛋白技术表达纯化CMV 2b蛋白，并进行蛋白质结晶试验，通过X射线晶体学分析获得其高分辨率结构，揭示其分子构象和空间结构。
3. 研究CMV 2b蛋白的功能，包括其对基因沉默机制的抑制作用、与植物宿主因子的相互作用以及其对植物的致病性等方面的研究。
三、研究意义本研究有助于深入了解黄瓜花叶病毒基因沉默抑制子2b蛋白的结构和功能，揭示其与CMV感染机制的关系，为制定协同防治策略提供理论依据。
同时，研究结果也将为基因沉默机制的研究提供新的思路和平台。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
２ ＶａｎＲｅｇｅｎｍｏｒｔｅｌ Ｍ Ｈ Ｖ’Ｆａｕｑｕｅｔ Ｃ Ｍ，Ｂｉｓｈｏｐ Ｄ Ｈ Ｌ Ｖｉｒｕｓ Ｔａｘｏｎｏｍｙ－Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆＶｉｒｕｓｅｓ．Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００５． ３０７～３２６
反应［２１，２２１，ＣＭＶ．Ｆｎｙ在豇豆ｔ＿（Ｖｉｇｎａ ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ）引 起过敏性坏死反应由其２ａ蛋白决定，其机制是由 于２ａ蛋白ｍｏｔｉｆＤ磷酸化作用导致病毒不能长距离 运输所引起，而与病毒复制没有关系阻２４１．这一结 论与本研究所取得结果相吻合．
参考文献
ｌ Ｅｄｗａｒｄｓｏｎ Ｊ ｌ乙Ｃｈｒｉｓｔｉｅ Ｒ Ｇ．ＣＲＣ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ Ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ
４德旆缸孙机＃≈鼯｛｝赫☆批‰ｏ≯鼢嘶ｔｇ。‰魄ｔ‰＃。慨撕“｛ｄ∞晦％《ｋ“槲。《馥ｍ协甜懈％‰船挣∥＊嘶☆ｐ。，ｗｗｎ．哪，…
Ｒａｐｉｄ ＣＯｍｍＵｎｊＣａｌｉＯｎＳ
ｍ
１
Ｐｌ Ｉ］１３裁蔫攀毛…如
ｗｗｗ．ｐｉｂｂ．ａｃ．ｃｎ
黄瓜花叶病毒ＣＢ７株系引起 心叶烟坏死反应与ＲＮＡ２相关幸
廖乾生ｔ，∞杜志游∞ 张华荣２） 朱丽萍２） 吴鹏∞ 陈集双２）．． （１惭江大学生命科学院，杭州３ｌ００２９；嘶江理工大学生物工程研究所，杭州３１００１８）
ＣＭＶ妒ｎ删ｃ Ｆｉｇ．４
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ
ＲＮＡｓ ｉｎ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ甩ｇｌｕｔｉｎｏｓａ
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｅｑｕａｌ ｔｉｓｓｕｅ ｏｆ慰ｇｌｕｔｉｎｍａ砒７ ｄｐｉ，ａｎｄ ２８ Ｓｒｌ心ｌＡ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎＵ＇０１．
·８２５·
①Ｃｌ、ｐＣ２和ｐＣ３）筛选与鉴定按照精编分子生物 学实验指南０５，１６１．经鉴定的阳性克隆（ｐＣｌ、ｐＣ２和 ｐＣ３）各取５个测序． １．３嵌合型ＣＭＶ ＲＮＡ２构建
采用表１引物通过Ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ．ＰＣＲ方法，在 ｅＤＮＡ水平上构建ＣＭＶ．ＣＢ７ ＲＮＡ２中２ｂ基因及 ３’端ＵＴＲ区与ＣＭＶ－Ｆｎｙ ＲＮＡ２相应部分进行互换 嵌合型ＲＮＡ２．具体构建策略如下：以ＣＭｖ－ＣＢ７ ＲＮＡ２的ｅＤＮＡ为模板，通过引物ＣＭＶｌ２Ｆ／ Ｃ２ｂ５Ｒ扩增出Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｉ Ｃ，通过引物Ｃ２ｂＦ／
非编码区决定其在心叶烟上表型（图３）．尽管
ＣＣＭＭＶＶ－．ＦｎＣｙＢ和７和ＣＭＣＶＭ．Ｖ．酽Ｆ重ｎ严，在但寄是主４个所毒产株生在症心状叶比
烟上基因组含量相差不明显．由此可见，ＣＭＶ－ＣＢ７ 在心叶烟上产生坏死反应，并不是因为其在寄主中 病毒含量高所引起（图４）．２ａ蛋白除了作为ＲＮＡ聚 合酶对病毒进行复制外，还参与病毒对寄主的致病
和模板，通过引物ＣＭＶｌ２Ｆ／ＣＭＶｌ２３Ｒ扩增出嵌合
型ＲＮＡ２哟．分别回收ＲＮＡ２咖和ＲＮＡ２９鼢ＰＣＲ产
物 载体，上并，经获勋得＾Ｉ侵和染Ｓｍ性ａ克Ｉ双 隆酶 ｐ删切娜，和克ｐ隆 ＲＮ到 Ａ２ｐ巧ＵＣ－ｌｏｌ．８
嵌合型ＲＮＡ２经测序验证．
ＣＭＶｌ２Ｆ
Ｃ２ｂ５Ｒ Ｃ２ｌ＇Ｆ ＣＭＶｌ２３Ｒ ａⅥＶ１２Ｆ Ｆ２ｂ５Ｒ Ｆ２ｂＦ ＣＭＶｌ２３Ｒ ａⅥＶ３Ｆ
和 ＣＴ３Ｔ共 ＴＴ同Ａ３Ｇ’ ＡＧ端 ＡＣ互Ｃ补 ＣＣ序 ＣＡ列ＣＧ：Ａ５Ａ’ ＡＧＴＴＧＧＧＴＧＣ㈣ＴＣＡ．Ｃ
ＣＣＧＴＡＣ ３’．
万方数据
万方数据
２００７；３４（８）
廖乾生等：黄瓜花叶病毒ＣＢ７株系Ｃ引现ＭＶ，－起ＦＣｎＭ心ｙＶ咖－叶Ｃ在Ｂ７心烟、叶坏烟Ｃ上死ＭＶ基－反因 Ｆｎ组ｙ应踟含与、量ＣＲ无ＭＮＶ明— Ａ显２Ｆ相ｎ差ｙ异和关
ＣＭＶｌ２３Ｒ扩增出Ｆｒａｇｍｅｎｔ １Ｉ Ｃ．以ｐＦ２０９为模板通
过相应引物对分别获得Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｉ Ｆ和 Ｆｒａｇｍｅｎｔ ＩＩ Ｆ．以Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｉ Ｃ和Ｆｒａｇｍｅｎｔ ＩＩ Ｆ为混
合模板，通过引物ＣＭＶｌ２Ｆ／ＣＭＶｌ２３Ｒ扩增出嵌合
型ＲＮＡ２嘲，以Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｉ Ｆ和ＦｒａｇｍｅｎｔｌＩＣ为混
作者从杭州地区获得一株在心叶烟（舭ｏｆｏ伽
∥眦ｉ眦Ｄｓ曲上产生坏死症状株系ＣＭｖ－ｃＢ７．本研究 通过构建ｃＭＶ．ＣＢ７分离物侵染性克隆以及与标准
株ＣＭＶ—Ｆｎｙ进行基因组ＲＮＡ假重组交换，确定 ＲＮＡ２是引起心叶烟坏死症状反应的决定因子．
１材料与方法
１．１毒源与寄主植物 ｃＭＶ．Ｆｎｙ侵染性克隆ｐＦｌ０９、ｐＦ２０９和ｐＦ３０９
，
５’ＣＡＣＴＡＡＧＣＡＧＣＧＡＡＡＧＡＡＧＡＡＡＧ ｔ ＡＴＧＧＡＡＴＴＧＡＡＣＧＴＡＧＧＴＧＣＡＡＴＧ ３’ （ｃｍ ＲＮＡ２ ｎｔ ２３９１～２４１３）但ｎｙ ＲＮＡ ｎｔ ２１９～２４４２）
Ｆｒａｇｍｅｎｔ ＩＩ Ｆ
５’ＡＡＴｒＧＧＧＣＣＣｒｌ３‘加’ＣＴＣＣｌｌｎＴＧＧＡＧＧＣＣ ３’
ｓ‘ＡＡｌｃＧＣＡＴＧｅ℃ＡＡ飞＾ＣＧＡ（Ｘｃ糨ａａ氏Ｇ Ｇｔ煳Ｃｎ＾Ｃቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ＾蚬ｍＧｔＧＩ（ｎＧ ３ｌ
（图４）．这表明，ＣＭＶ．ＣＢ７及其假重组毒株引起心 叶烟系统性坏死与其基因组含量的高低没有直接 关系．
２．３系统寄主中假重组毒株基因组含量的分析
坏死反应是否因为在系统寄主中其基因组积累
ｄｐｉ，ＣＭＶ－ＣＢ７、
ＣＭＶ－Ｆ删晨妨、
量高于ＣＭＶ．Ｆｎｙ／ＣＭＶ－Ｆｎｙ嘲所引起，７
为研究ＣＭＶ．ＣＢ７和ＣＭＶ．酽引起心叶烟
物５斗ｌ，接种于４－ｖ５叶期心叶烟，重复接种一次． 接种植物在２８℃、光照１４ ｈ植物培养箱中培养． １．５ ＲＮＡ印迹分析
ＣＭＶ－胪和ＣＭＶ－ 接种７天，用４ ｎｌｉｉｌ打孔器等量采集侵染
ＣＭＶ．ＣＢ７、 ＣＭＶ．Ｆｎｙ、
Ｆｎ俨心叶烟系统叶．用Ｔｒｉｚｏｌ提取总ＲＮＡ，测定
样品Ａ狮和Ａ瑚值，确定样品浓度和纯度．ＲＮＡ甲 醛变性电泳、转膜和印标记探针以及杂交参考文 献［１６］．所用探针为４５ ｎｔ的ＣＭＶ基因组ＲＮＡｌ、２
５’ＡＡＴＴＧＣＣＣ０朗＇ＧＧＴＣＴＣＣＴＩＴｒＧＧＡＧＧＣＣ ３’
Ｓｍａ Ｉ（ＣＭＶ ＲＮＡ２ ｎｔ ３０３２～３０５ｍ
譬§忒ｔＣＧＣＡ飞ＧＣｔ｝●忑嫩暇ｃ§足气峨ＡＧＧＴＩ＇ＴＡＴＴｒＡＣＡＡＧＡＧＣＧＴＡＣＧＧ ３＋
ＦｒａｇｍｅｎｔⅡＣ ＦｒａｇｍｅｎｔＩ Ｆ
？５’ＡＡＴＴＣＴＴＴＣＧＣＴＧＴＩＷＧＴｒＧＧ ３’
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
＆ｍ Ｉ
Ｔ７ ｐｒｏｍｏｔｏｒ
５７ Ｃ１１ｎ℃ＴｒＩ卫．ＩＴＣＧＣＴ０（Ｘ－ｒＡＧＴＧ ３’ ＣＢ７ ＲＮＡ２ ａｔ ２３９１～２４１３
ＣＭＶｌ２Ｆ ｍ １－２０
５’ＡＧＡ ＴＧＣＧＧＡＡＧＧＧＧＡＧＧｌ７＂Ｔ ＡＴＧＧＡＡＴｒＧＡＡＣＧＣＡＧＧｃＧｃ ３’ （Ｆｎｙ ＲＮＡ２ ｌｉｔ ２３９６～２４１８）（ＣＢ７ ＲＮＡ２ ｎｔ ２４１４～２４３３）
关键词黄瓜花叶病毒，心叶烟，坏死，ＲＮＡ２ 学科分类号ｓ４
黄瓜花叶病毒（Ｃ眦ｕ，硒ｅｒ舢懂ａ幻秽ｉ九岱，ＣＭⅥ 为正义、单链、三分体ＲＮＡ病毒，其寄主范围极
其广泛，是世界性危害最严重的植物病毒之一【１１．
ｃＭＶ在系统性寄主上常见症状反应为花叶 （ｍｏｓａｉｃ）、矮化（ｓｔｕｎ缅ｇ）和褪绿（ｃｈｌｏｒｏｓｉｓ），而这些 症状往往是复合出现．随着病害的发展，ｃＭＶ侵染
摘要采用Ｉ玎．ＰＣＲ获得黄瓜花叶病毒ＣＭＶ￡Ｂ７株系全长基因组ｃＤＮＡ，经克隆测序发现该ＣＭＶ的ｍ叮Ａ１、２和３分别为 ３ ３５６ ｎｔ、３ ０４５ ｍ和２ ２１８ ｎｔ（序列登录号为：ＥＦ２１６８６６、ＤＱ７８５４７０和ＥＦ２１６８６７）．ＣＭＶ．ＣＢ７基因组ｃＤＮＡ克隆体外转录 砌队接种心叶烟引起坏死症状，而ＣＭＶ．Ｆｎｙ则产生典型花叶．由ａ讧ｖＣＢ７和ＣＭＶ．Ｆｎｙ基因组ＲＮＡ相互交换而构建６个 假重组型病毒（Ｃ１Ｃ２Ｆ３、ｃｌＦ２Ｃ３、Ｆ１Ｃ２ｃ３、ＦｌＦ２Ｃ３、Ｆ１Ｃ２Ｆ３和ｃｌＦ２ｃ３）活性分析表明：ｃＭ、厂－ＣＢ７基因组ＲＮＡ２决定其 在寄主上的症状反应．嵌合型ＲＮＡ２（Ｉ淤Ａ２哟和ＲＮＡ２删≈的寄主侵染活性测定表明：２ｂ基因或ＲＮＡ２ ３’端非编码序列决定 ＣＭｖ￡Ｂ７在心叶烟坏死症状．砌呵Ａ印迹分析结果显示：ＣＭＶＣＢ７和ＣＭＶ．Ｆｎｙ舯引起寄主坏死与基因组ＲＮＡ积累没有直 接关系．
ＣＭＶ在寄主上最常见症状为花叶、矮化和褪 绿【ｌ，３，ｓ硼，在已报道ＣＭＶ中，目前还没有发现引 起系统寄主产生坏死表型的株系．Ｘｕ等ｆ，７～１９］发现， ＣＭＶ－Ｆｎｙ与Ｄ．ｓａｔＲＮＡ混和接种于番茄上，接种 植株表现为坏死反应，但该症状不是由ＣＭＶ—Ｆｎｙ 所引起，是因为Ｄ．ｓａｔＲＮＡ介导了番茄产生细胞程 序性死反应所致．ＣＭＶ的Ｙ．ｓａｔＲＮＡ也引起番茄出 现坏死症状［２０１．本研究发现，ＣＭＶ．ＣＢ７在心叶烟上 引起坏死，并进一步确定其症状由基因组ＲＮＡ２ 决定（图ｌ，２和表２）．嵌合体ＲＮＡ２侵染性分析发 现，ＣＭＶ—ＣＢ７ ＲＮＡ２的２ｂ基因或ＲＮＡ２的３’端
蛋白；ＲＮＡ２含有２个ＯＲＦ，５’端Ｏｌ讧编码２ａ蛋
白，３ ７端ＯＲＦ编码２ｂ蛋白，ｌａ蛋白和２ａ蛋白形
成病毒复制酶复合体【４瑚；ＲＮＡ３编码移动蛋白
（３ａ）和外壳蛋白（ＣＰ），但ＣＰ是从ＲＮＡ３亚基因组 （１ｌＮＡ４）翻译而来【４—部￣１哪．２ｂ蛋白是从ＲＮＡ２亚基因 组（ＲＮＡ４Ａ）翻译而来，其大小在１１～１３ ｋｕ之 间【１１￣１３１．
由苏格兰作物所Ｐａｌｌｌｋａｉｔｉｓ提供．ＣＭＶ．ＣＢ７分离自
杭州番茄，并保存于三生烟ｍ优泐ｍ渤ａｃ啪“．
Ｘ粕ｔ１１ｉ．ｎｃ）上．寄主植物为心叶烟（Ⅳ．∥眦ｉ舢哪力． １．２ ＣＭＶ．ＣＢ７基因组全长克隆
从ＣＭＶ．ＣＢ７侵染三生烟组织提取ＣＭＶ—ＣＢ７ 病毒粒子【均，按照Ｔｒｉｚｏｌ使用说明书纯化病毒 砌叮Ａ，并以此为模板进行ＲＴ．ＰＣＲ，采用 ＣＭＶｌ２ⅣＣＭＶｌ２３Ｒ对和ＣＭＶ３Ｆ／ＣＭｖｌ２３Ｒ对分 别扩增ＣＭＶ．ＣＢ７基因组对叮Ａｌ、２与ＲＮＡ３全长 基因，ＰｃＲ反应参数按照文献【１５】．目的ＤＮＡ片段 经回收、却＾Ｉ和ｓ，嬲Ｉ双酶切，克隆至ｐＵＣｌｌ８ 载体；ＣＭＶ．ＣＢ７基因组鼢她１、２和３阳性克隆