第3章蛋白质的通性、纯化和表征详解

（三） 根据电荷性质的差异
1、电泳法


电泳：带电荷的蛋白质或核酸分子在电场中移动的现象称为电泳。
带正电荷向负极泳动，而带负电荷向正极泳动，分子量小的蛋白质 泳动快，分子量大的泳动慢，于是蛋白质被分离。
影响因素 ①电荷、粒子的大小和溶液的粘度 ②电场强度 ③溶液的pH
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳
基本原理 ： 以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，根据被分离物质所 带电荷的多少、分子形状、分子大小的不同， 在电场的作用下产生不同的移动速度而分离的 方法。 聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双 丙烯酰胺在催化剂和加速剂的作用下聚合而成。 网状的大小决定于单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯 酰胺的浓度及两者的比例。
透析法：将样品装在 透析袋里，半透膜 阻留pr分子，而让 小的溶质分子和水 通过，以达到除去 蛋白质溶液中小分 子（盐、低分子酸 等）。
超过滤法：施以一定的压力强迫 小分子物质通过半透膜，而 按半透膜的筛孔大小截留相 应的蛋白质分子。
②凝胶过滤法（分子筛层析法）
凝胶过滤常用的介质：
在层析柱内装填带有小孔的凝胶颗粒。
③如果提取膜蛋白：超声波或去污剂使膜解聚，然后用适当的介质提取。
2、粗分级分离（rough fractionation)
一般用选择性沉淀法。 ①（NH4）2SO4分级沉淀法（盐析） ②等电点选择性沉淀法 ③有机溶剂分级沉淀法
3、细分级分离（fine fractionation) )
★层析法：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲 和层析、疏水层析（反相HPLC） ★电泳法：自由界面电泳、区带电泳（凝胶电泳、滤纸和 薄膜电泳等）、等电聚焦、双向电泳 ★密度梯度离心
④生物碱试剂和某些酸类沉淀法：pH小于pI时，蛋白质带正电荷，易与生物 碱试剂和酸类的负离子生成不溶性沉淀。生物碱试剂：单宁酸、苦味酸、 钨酸。酸类：三氯乙酸、磺基水杨酸； ⑤加热变性沉淀法。
三、蛋白质分离纯化的一般原则

纯化的实质：增加制品的纯度或比活性

一般程序：前处理、粗分级分离、细分级分离、结晶保 存
2、 沉淀蛋白质的方法
①盐析法: 大量的中性盐（（NH4）2SO4、Na2SO4、NaCl），使蛋白质脱去 水化层而聚集沉淀；不引起变性。 ②有机溶剂沉淀法： 破坏水化膜，降低介电常数，丙酮、乙醇等； ③重金属盐沉淀： pH＞pI 时，蛋白质颗粒带负电荷，与重金属离子（ Hg2+. Pb2+. Cu2+ 等）结成不溶性沉淀；
交联葡聚糖（Sephadex，是由葡聚糖与环氧氯丙烷 交联形成的有三维空间的网状结构物）。
聚丙烯酰胺凝胶 琼脂糖凝胶
凝胶过滤的原理
（二）根据溶解度差异的分离法
蛋白质的盐溶与盐析 盐溶：是指在适当的中性盐浓度溶液中，蛋白质溶解度会提高的现象， 称盐溶。 盐析：向蛋白质溶液中加入大量中性盐（高盐浓度）时，会破坏蛋白 质分子表面的水化层（即破坏了蛋白质在水溶液的稳定性因素）导 致蛋白质的溶解度降低发生沉淀析出，称盐析。 常用的饱和硫酸铵沉淀法分离纯化蛋白质就是利用盐析的原理，不同 的蛋白质对饱和硫酸铵的要求不同，所以，可以通过饱和硫酸铵的 分级沉淀法分离各种蛋白质。
第3章
蛋白质的通性、纯化和表征
一、 蛋白质的酸碱性质和等电点
蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。

等电点：蛋白质所带净电荷为零的pH值称为等电点。
在等电点时，蛋白质在电场中不移动,溶解度最小，粘度
最大。可以用溶解度法，聚焦电泳法等测定等电点。
二、 蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀
蛋白质分子直径在 1-100nm 之间，在水溶液中具有胶体溶液 的通性。 1、 稳定蛋白质胶体溶液的主要因素： ①蛋白质表面极性基团形成的水化膜将蛋白质颗粒彼此隔开， 不会互相碰撞凝聚而沉淀； ②两性电解质非等电状态时，带同种电荷，构成稳定的双电 层，互相排斥不致聚集沉淀。 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应 用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 一旦电荷被中和或水化膜被破坏，蛋白质颗粒聚集，便从 溶液中析出沉淀。
前 处 理
生物组织
破碎、溶 解、差速离心
无细胞提取液
粗 分 离
选择性沉淀法
电泳
细 分 离
离子交 换层析
凝胶 过滤
亲和 层析
疏水 层析
吸附 层析
精制后的蛋白质
1、前处理（pretreatment）： ①将组织和细胞破碎 动物组织和细胞：电动捣碎机 、匀浆器、超声波处理； 植物组织和细胞：石英砂+提取液研磨或用纤维素酶处理； 细菌：超声波震荡、与砂研磨、高压挤压、溶菌酶处理（分解肽聚糖） ②如果所要蛋白质集中在某一细胞组分，用差速离心法收集细胞的某一组 分（表7－5）；
3.等电聚焦
（1）基本原理
根据蛋白质分子的等电点进行分离。利用这种技术分离蛋白质混合物 是在具有pH梯度的介质中进行，在外加电场作用下，各种蛋白质 将移向并聚集（停留）在等于其等电点的pH梯度处，并形成一个 很窄的区带。
4、结晶（晶体保存）
结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯。能否结晶不仅是纯度 的一个 指标，也是判断制品是否有活性的指标。纯度越高，溶液越浓，越 容易结晶。 结晶方法：使溶液略处于过饱和状态。降低温度、盐析、加有机溶剂、 调节pH。
四、 蛋白质的分离纯化方法
（一）根据分子大小的差异
①透析和超过滤法：都是利用蛋白质不能通过半透 膜 的性质除去样品中的小分子非蛋白物质
SDS(sodium dodecyl sulfate)


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若果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS ，SDS是一种阴离子表面活 性剂， 几乎能破坏蛋白质中所有的非共价键，从而使多亚基蛋白 质解聚，并使多肽链呈伸展状态，消除了蛋白质形状对迁移率的影 响； SDS能以1:2比例与肽链中的氨基酸残基结合，使变性蛋白质带上大 量的净负电荷，多肽链上带的负电荷量远超过蛋白质分子原有的电 荷量，因而掩盖了不同蛋白质间原有的电荷差别，结果所有的 SDS—蛋白质复合物，电泳时都以几乎同样的电荷质量比向正极移 动并具有相同的构象，所以同一电泳条件下，分子量成为决定蛋白 质泳动速率的唯一因素。分子量越大，受到阻力越大，泳动越慢。