第五章 细胞衰老与凋亡

胞内Ca2+浓度增高 * 胞内Ca2+浓度增高可能是凋亡的启动因素之一。 内源性核酸内切酶激活，DNA片段化 Ca2+/Mg2+依赖性内源性核酸内切酶激活 →DNA核小体连接处被水解 →形成180－200bp（X）片段 大分子如凋亡调节蛋白的合成。 * 凋亡的发生一般依赖于新的RNA和蛋白质合成。
5）膜粘度增加，流动性降低
衰老细胞膜选择通透性改变，物质进出膜的速度下降，因为衰 老或有缺陷的膜常处于凝胶相或固相，产生刚性体脂肪酸尾巴 不能运动，膜流动性差；年轻健全的细胞膜具典型的液晶相， 比较柔韧使脂肪酸尾巴可以自由运动。
6）细胞连接减少
衰老时细胞的间隙连接明显减少，用3H-U标记脲嘧啶核苷酸， 通过放射自显影来研究不同年龄细胞的间隙连接交换情况，将 带3H标记和不带标记的年轻或年老细胞分别放在一起培养，发 现培养4hr后，有70%的年轻细胞从共同培养的年轻供体细胞得 到3H-U，只有30%的年老细胞从共同体培养的年老供体细胞得到 3H-U。说明衰老时细胞间的代谢协作关系显著减少。
2、细胞凋亡
细胞死亡是生物界普遍现象，人体内细胞注定要死亡，有些死 亡是生理性的，有些是病理性的。 细胞死亡分类； 坏死（necrosis），细胞突发性病理的死亡或生理环境急骤变 化（如高热，缺氧等）所致。 凋亡（apoptosis），个体发育过程中基因调控下的细胞自杀活 动，是细胞有机体为调控机体发育，维持内环境稳定，由基因 编码程序的细胞主动性死亡过程。 细胞凋亡对机体的许多正常生理功能具有重要意义。 细胞凋亡与众多疾病发生有密切关系。研究细胞凋亡生物学机 制将可能揭示许多疾病的致病机制，为新治疗药物研发提供理 论依据。
1.1、细胞动态分类
根据细胞的增殖能力，分化程度，生存时间，组织细胞 分为4类：
①更新组织细胞：执行某种功能的特化细胞，经过一定时间后衰 老死亡，由新细胞分化成熟补充。（上皮细胞、血细胞） ②稳定组织细胞，分化程度较高的组织细胞，功能专一，正常情 况下没有明显的衰老现象，细胞分裂少见，但在某些细胞受到破 坏丧失时，其余细胞也能进行分裂，以补充失去的细胞，（肝、 肾细胞） ③恒久组织细胞，属高度分化的细胞，个体一生中没有细胞更替， 破坏或丧失后不能由这类细胞分裂来补充。（神经细胞，骨骼细 胞和心肌细胞 ） ④可耗尽组织细胞，如人类的卵巢实质细胞，在一生中逐渐消耗， 而不能得到补充，最后消耗殆尽。
细胞膜起泡，细胞体积缩小 蛋白质聚集 染色质逐渐聚集成新月状附在核膜周边，嗜碱性增强， 进而断裂，但胞膜仍完整 胞膜不断出芽、脱落，细胞变成数个大小不等的由膜包 裹的凋亡小体 凋亡小体被周围有吞噬功能的细胞如巨噬细胞、上皮细 胞等吞噬、降解
细胞凋亡的形态学变化
（3）细胞凋亡的生物化学变化
第五章 细胞衰老与凋亡
1、细胞衰老
1961年Hayflick等人研究发现，培养细胞是有一定寿命的， 它们的增殖能力有一定限度，在一个范围常数之内 ──Hayflick常数，又称Hayflick界限。
动物 培养细胞传代 寿命（年） 小鼠 12 3 鸡 25 30 龟 140 200 人（胚胎成纤维细胞） 50~60 100~ 人（新生儿成纤维细胞） 30~40 人（青年成纤维细胞） 20~30 人（成年成纤维细胞） 10~30
1998年Garman等人研究认为叙利亚仓鼠胚细胞在复制分裂各阶 段始终表达端粒酶，端粒长度并没变短，经过20-30代分裂后， 细胞依照衰老。有人将去除端粒酶基因的小鼠传了5代，止今 仍未发现寿命比一般鼠要短。故此端粒钟学说还需有更多的实 验依据。
染色体外rDNA环（ERC）的积累
以一种酵母细胞为材料进行的，认为细胞衰老的步伐是 由rDNA的变化决定的。当酵母菌达到生命“中年”的某 一时刻时，经过同源重组产生的第一份环状rDNA片段就 会冲出染色体，成为染色体外的rDNA环，随着细胞不断 分裂，这种rDNA环不断复制增加，当积累到500-1000份 拷贝时，细胞就进入了衰老。双向电泳试验也证明，衰 老细胞中积累有许多密闭的环状rDNA，而年轻细胞中含 量极少。故此染色体外rDNA的积累，导致了细胞的衰老。
衰老细胞的形态变化
核 染色质 质膜 细胞质 线粒体 高尔基体 尼氏体 包含物 核膜 增大、染色深、核内有包含物 凝聚、固缩、碎裂、溶解 粘度增加、流动性降低 色素积聚、空泡形成 数目减少、体积增大、mtDNA突变或丢失 碎裂 消失 糖原减少、脂肪积聚 内陷
（二）细胞生理变化
胞内水分减少，细胞萎缩，体积变小，与正常细胞相比 衰老细胞含水量明显下降细胞皱缩。 代谢速度减慢，生活力降低，检测发现有些酶的活性下 降。 呼吸速率减慢，衰老细胞的呼吸强度下降。
daf2（编码胰岛素受体）和age1（编码磷脂酰肌醇-3-激酶P110催化亚 基）：正常状态下两个基因表达，决定了正常的成虫发育。
daf16：编码一种转录活化剂：在饥饿或虫口过密的情况下，大量表达， 并朝着dauer幼虫方向发育。
在daf2和age1突变体中，daf2和age1部分表达，导致决定成虫发育和 dauer幼虫特异性防御机制同时表达，完成正常的成虫发育，又获得了 寿命延长特性（一般延长2-4倍）。
1.3、细胞衰老的机理
氧化损伤：氧自由基引发氧化性损伤积累。
端粒的变化：细胞衰老的“有丝分裂钟”
rDNA变化：染色体外rDNA 环（ERC）的积累。 沉默信息调节蛋白复合物：异染色质区阻断DNA转录。 SGS1基因、WRN基因： 编码解旋酶，sgs1突变体寿命明显短于野生型（平均9.5
2.1、简介及基本概念
（1）细胞凋亡：
细胞凋亡的概念最早是由病理学家Kerr于1972年正式提 出
又被称为“细胞程序性死亡”（programmed cell death, PCD）
细胞凋亡是一种具有形态特征和生化改变的细胞凋亡过 程，这些改变是一凋亡形态学变化
发育程序与衰老
线虫的生命周期:幼虫期为4天，然后达到性成熟并进入成虫期，延续数周后， 进入衰老与死亡。
幼虫发育过程中遇到不良环境（虫口过密、食物短缺和高温），引起性外激 素浓度变化，结果幼虫进入一种特殊的dauer幼虫阶段，可以延续6个月。 此时幼虫全身被以角质化的层、口紧闭、处于休眠状态； 如环境条件改善，又可发育成成虫，经过数周，完成其生活史。 遗传分析发现，存在着两种Dauer幼虫形成基因：
2）内质网的变化
糙面内质网总量减少，排列有序性下降。年轻动物细胞 中，糙面内质网发育良好，排列有序；年老动物中，内 质网成弥散状分散于核周围胞质中，不存在有序排列。 光镜下用碱性染料染色可以看到神经元细胞中呈颗粒状 的尼氏体。尼氏体是由糙面内质网和核糖体组成的混合 物。研究者发现小鼠和人的大脑及小脑某些神经元中尼 氏体中物质含量会随着动物年龄的增长而逐渐下降，表 明随年龄增大内质网量减少。
1.2、细胞衰老特征
（一）细胞结构的变化
1）细胞核的变化
细胞核增大，通过二倍体细胞培养发现，随着细胞分裂次数的 增加，细胞核会不断增大。 核膜内折，培养细胞和体内细胞，随着培养时间增加，传代次 数增加或年龄增长，核膜内折现象明显增多。 染色质固缩化，培养的晚代细胞核中，染色质固缩化明显，早 代细胞只有轻微的固缩，体内细胞亦有这种现象。 核仁裂解为小体，在sgs1酵母突变体衰老细胞中可看到核仁裂 解为小体。
线粒体DNA
随着年龄增长线粒体DNA的突变显著增加，并表现出异质 性 线粒体DNA的突变可能导致电子传递链不能执行正常功能。 如缺失突变引起细胞色素氧化酶的缺失，ATP水平和 NAD/NADH比率下降，促进ROS的生成。 mtDNA裸露于基质，缺乏结合蛋白的保护，最易受自 由基伤害，而催化mtDNA复制的DNA聚合酶γ不具有校 正功能，复制错误频率高。
Sir复合物
沉默信息调节蛋白复合物（Sir1、Sir2、Sir3、Sir4），一般 存在于异染色质中，该复合物的作用是阻止它们所在位点的 DNA转录。
1994年Kennedy肯尼迪等人在一种酵母突变体发现了Sir3蛋白 和Sir4蛋白由端粒处向着核仁处转移，这种转移伴随着酵母寿 命的延长。进一步研究发现，突变体中的Sir4蛋白的C端有121 个氨基酸被除掉了，除掉的这个区域本来是Sir4蛋白与端粒和 其他蛋白相互作用的部位，由于这个区域的去除，Sir复合物 能够自由定位，并从端粒处转移到了核仁，而Sir复合物到达 核仁，又抑制了rDNA的转录，使核仁rDNA处于沉默状态不能复 制，从而造成染色体外rDNA环（ERC）生成和积累量减少，ERC 量增加细胞衰老加快，减少则意味着细胞寿命延长。
3）线粒体的变化
细胞在衰老过程中，线粒体数量减少，体积增大。在人 类、大鼠、小鼠衰老的肝细胞中线粒体数量明显减少， 并发生膨大现象。
4）致密体的生成
致密体是衰老细胞中常见的一种结构。在不同的教科书 中对这种细胞成分还有一些其他的名称，比如脂褐质、 老年色素（斑）、血褐质、脂色素、黄色素、透明蜡体 及残体等等。研究表明，致密体是由溶酶体或线粒体转 化而来的。
最新研究认为，人体表皮的细胞衰老是由于葡萄糖代谢产生自 由基，它在细胞内乱撞导致细胞因子受损，细胞衰老死亡出现 斑块，自由基进入核撞击基因使基因改变，细胞发生癌变。有 人将小鼠的谷胱甘肽过氧化物酶基因及SOD1、SOD2和SOD3基因 中的一种剔除，并没发现引起细胞衰老。
端粒钟学说
随着细胞的每次分裂，端粒不断缩短，当缩短到一个阈值时， 细胞就进入了衰老。1998年Wright等人将人的端粒酶反转录酶 亚基的基因引入正常人的二倍体细胞，发现传染细胞的端粒长 度明显增加，分裂旺盛，同时作为细胞衰老标志的β半乳糖苷 酶的活性明显降低，细胞寿命较正常细胞增加了至少20代，这 一证据说明端粒长度与细胞衰老有着密切的关系。
SGSI基因 及WRN基因
酵母细胞中发现了一种突变体，该突变体因突变缺失了SGSI基 因，而且寿命短，野生型平均分裂24.5代，突变体平均分裂 9.5代，表明SGSI基因缺失影响了酵母的寿命。SGSI蛋白合成 后定位在核仁中，作用是阻止核仁裂解，如果缺少这种蛋白， 核仁就会裂解为小体。 人类发现了一种早衰疾病——Werner综合症（WS），病人30多 岁会出现一些正常老年人的衰老现象，如动脉硬化、骨质疏松、 Ⅱ型糖尿病、肿瘤等等。从WS病人细胞中分离出了一种突变基 因——WRN基因。WRN基因与酵母突变体SGSI基因同源，WRN蛋 白含有7个DNA解旋酶所特有的标志序列，WRN蛋白突变，可影 响其正常功能，使DNA不能正常解旋复制，由此造成DNA复制的 严重障碍。正常人皮肤的成纤维细胞中，WRN蛋白存在于核仁 中，WS病人的成纤维细胞中看不到典型的WEN蛋白。