实验七 血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性测定
血清丙氨酸氨基转移酶测定速率法
血清丙氨酸氨基转移酶测定速率法血清丙氨酸氨基转移酶（简称ALT）测定速率法，听起来是不是有点拗口？别担心，今天咱们就一起来聊聊这个看似复杂、实则挺简单的东西。
ALT是什么呢？它其实是一种存在于我们身体里的酶，主要在肝脏里工作，帮忙转化一些重要的氨基酸。
你知道的，肝脏就是那个“沉默的英雄”，总是在默默地承担着解毒、代谢的重任。
只不过，有时候肝脏忙碌得有点过头了，搞得肝细胞有点“小情绪”，于是这时候，ALT的含量就会变得比较高，这可就给我们敲响了警钟。
所以，ALT的测定在体检中占据着举足轻重的位置，可以帮助我们了解肝脏的健康状况。
说到这里，你可能会想，“哎，那测这个有啥用啊？”嘿，告诉你，它可是个大有用处的检测指标呢！ALT升高常常意味着肝脏受损或者有炎症，比如肝炎、脂肪肝，甚至是肝硬化，都是有可能导致ALT升高的。
最神奇的是，ALT的升高通常早早就会出现在你自己没有感觉到的情况下。
所以，定期检查血清ALT，基本上能帮你提前发现肝脏的小毛病，避免大病发生。
那咱们要怎么测呢？ALT测定的方法其实很多，不过最常见的还是速率法。
这种方法可不像你想象中那样复杂，一般来说，检测的步骤其实挺简单的。
首先得抽点血，血液样本可不能少。
然后，实验室里会通过加试剂、测量反应速度等方式，得出ALT的活性水平。
说白了，咱们就是通过看这个酶反应的速度来推算ALT的水平。
这个方法既准确又快捷，基本上1015分钟就能出结果，简直是急救中的“快刀斩乱麻”。
不过，怎么测也得有一个标准吧？ALT测定的标准很明确，健康人的ALT水平通常是在正常范围内，也就是50单位/升以下。
超过这个数值，就得注意了。
比如，如果ALT数值一度飙升到100单位/升，可能就说明你的肝脏正在经历一些“风雨”，要赶紧去医院看看了。
如果你想知道具体数值和标准，最好还是请教医生，毕竟每个人的身体情况都不一样。
让咱们再来谈谈这个“速率法”，听起来好像很厉害对吧？速率法就是通过测量ALT催化反应中产物变化的速度，来得出酶的活性。
血清丙氨酸实验报告
一、实验目的1. 了解血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）在肝脏代谢过程中的作用。
2. 掌握血清ALT活性测定的原理和方法。
3. 学会运用分光光度法测定血清ALT活性。
4. 分析血清ALT活性与肝脏疾病之间的关系。
二、实验原理血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）是一种存在于肝脏细胞内的酶，主要催化丙氨酸和α-酮戊二酸之间的氨基转移反应。
当肝脏受到损伤时，ALT会大量释放到血液中，因此，血清ALT活性的测定对肝脏疾病的诊断具有重要意义。
本实验采用分光光度法测定血清ALT活性。
在实验中，ALT催化丙氨酸和α-酮戊二酸反应生成丙酮酸和谷氨酸。
丙酮酸与2，4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸2，4-二硝基苯腙，该化合物在碱性条件下呈现棕色，可通过分光光度法测定其在特定波长下的吸光度，从而计算出ALT的活性。
三、实验材料1. 血清样本：取适量血清样本，置于冰浴中保存。
2. 试剂：丙氨酸、α-酮戊二酸、2，4-二硝基苯肼、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠等。
3. 仪器：分光光度计、移液器、试管、试管架等。
四、实验步骤1. 标准曲线的制作：分别配制不同浓度的丙酮酸溶液，加入2，4-二硝基苯肼和氢氧化钠，测定其在特定波长下的吸光度，绘制标准曲线。
2. 血清ALT活性的测定：取血清样本，加入丙氨酸、α-酮戊二酸、磷酸盐缓冲液和2，4-二硝基苯肼，混匀后置于37℃水浴中反应一段时间。
反应结束后，加入氢氧化钠终止反应，测定其在特定波长下的吸光度，根据标准曲线计算ALT的活性。
3. 结果记录与分析：记录实验数据，计算ALT的活性，分析ALT活性与肝脏疾病之间的关系。
五、实验结果1. 标准曲线的制作：绘制标准曲线，得到线性回归方程为y=0.0058x-0.0035，R²=0.998。
2. 血清ALT活性的测定：测定血清样本的ALT活性为540 U/L。
3. 结果分析：根据文献报道，ALT活性在正常范围内为0-40 U/L。
本实验中血清样本的ALT活性为540 U/L，明显高于正常范围，提示可能存在肝脏疾病。
血清丙氨酸氨基转移酶测定-标准操作程序
血清丙氨酸氨基转移酶试剂盒在2-8℃下避光保存可稳定一年；试剂R-1、R-2开启后在2-8℃避光保存可稳定一个月。
3.4样本稳定性与贮存
3.4.1分析用人基质质控血清：该血清自生产之日起，在2-8℃下保持可稳定4年；该血清一旦复融，在25℃下可稳定24小时，在2-8℃下可稳定7天，在-20℃
三级文件
血清丙氨酸氨基转移酶测定标准操作程序
文件编号：Leabharlann 版本/状态：A/1第2页共3页
生效日期：
目的：建立血清丙氨酸氨基转移酶测定标准操作规程。
范围：适用于血清丙氨酸氨基转移酶测定的标准操作。
职责：生化部检验人员对本规程的实施负责。
规程：
1测定方法：采用连续监测法测定人血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT/GPT）的活力。
2仪器设备
GS200全自动生化分析仪
3试剂
3.1血清丙氨酸氨基转移酶试剂盒，包括试剂1（R-1）、试剂2(R-2)。
━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
试剂成份含量
─────────────────────────────────
R-1乳酸脱氢酶（LDH）≥4000U/L
4.2检验方法
分析方法：速率A；主波长：340 nm；副波长：405nm；样品量：15.0ul；R-1：400ul，R-2：100ul；校准方式：K因子；反应方向：下降；测定温度：37℃。
样品与R-1混匀后反应5分钟，加入R-2混合后延迟60秒，测定240秒。
样品15ul主波长340nm
R-1 400ulR-2 100ul副波长405nm
三级文件
血清丙氨酸氨基转移酶测定标准操作程序
文件编号：
血清丙氨酸氨基转移酶测定
血清丙氨酸氨基转移酶测定1 检验目的指导本室工作人员规范操作本检测项目，确保检测结果的准确。
2 实验原理本试剂以国际临床化学会(IFCC)推荐方法为基础，所采用的反应原理与反应式如下。
⑴样本中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）催化丙氨酸的氨基转换至α-氧代戊二酸，生成丙酮酸和L谷氨酸。
⑵丙酮酸被试剂中的乳酸脱氢酶（LDH）还原为L-乳酸的同时还原型辅酶I（NADH+ H+）被氧化为辅酶I（NAD+），而使波长340nm处的吸光度值下降。
通过对波长340nm处吸光度值的下降速率进行监测，即可测得样本中丙氨酸氨基转移酶（ALT）的活性。
(3)样本中内源性丙酮酸的干扰，可由试剂中的乳酸脱氢酶（LDH）在测定的延迟时间内快速、完全地消除，不会对测定产生干扰。
ALTL-丙氨酸 + -酮戊二酸丙酮酸 + L-谷LDH（乳酸脱氢酶）氨酸丙酮酸+ NADH + H+L-乳酸 + NAD+ + H2O3 标本3.1病人准备：12小时禁食。
3.2 类型：血清。
3.3. 标本存放：3天内的活性损失：2～8℃保存：<10%；15～25℃保存：<17%；标本稳定性：-20℃保存至少可稳定4周。
3.4 标本运输：常温条件下保存运输。
3.5 标本拒收标准：标本溶血、细菌污染的标本。
4 实验材料4.1 试剂：上海复星长征医学科学有限公司ALT试剂盒（沪食药监械（准）字2014第2400166号 YZB/沪 1546-40-2014）4.1.1 试剂组成试剂1 L丙氨酸 600mmol/L 乳酸脱氢酶＞1820U/L（R1）：NADH 0.26mmol/LTris缓冲液 80mmol/L试剂2（R2）：Tris缓冲液80mmol/L α氧代戊二酸36mmol/LEDTA 5.0mmol/4.1.2 试剂准备：试剂为即用式。
4.1.3 试剂稳定性与贮存：在2～8℃避光、密封的储存条件下，试剂盒自生产之日起有效期为12个月。
4.1.4 变质指示：当试剂有看得见的微生物生长，有浊度，或者未开盖的液体有沉淀时，表明试剂已变质，不能继续使用。
血清丙氨酸氨基转移酶测定
血清丙氨酸氨基转移酶测定1.实验原理国际临床化学学会(IFCC)推荐的紫外连续监测法。
ALTL-丙氨酸+ -酮戊二酸丙酮LDH（乳酸脱氢酶）酸+ L-谷氨酸丙酮酸+ NADH + H+L-乳酸+ NAD++ H2O 上述偶联反应中，NADH的氧化速率与`样品中ALT的活力成正比,在340nm处NADH呈现特性吸收峰，而NAD+则没有。
因此，可在340nm监测吸光度的下降速率（-△A/min）,计算出ALT的活性单位。
2. 标本：2.1 病人准备：12小时禁食。
2.2 类型：血清，肝素或EDTA血浆。
3. 标本存放：3天内的活性损失：2～8℃保存：<10%；15～25℃保存：<17%；标本稳定性：-20℃保存至少可稳定4周。
4. 标本运输：常温条件下保存运输。
5. 标本拒收标准：标本溶血、细菌污染的标本。
6. 实验材料6.1 试剂欧泰克ALT测定试剂盒6.1.1 试剂组成Tris缓冲液pH 7.4 80mmol/LL-丙氨酸800mmol/LLDH（乳酸脱氢酶）≥1200U/La-酮戊二酸18mmol/LNADH 0.18mmol/L6.1.2 试剂准备：试剂为即用式。
6.1.3 试剂稳定性与贮存：试剂保存于2～8℃，若无污染，可稳定至失效期。
试剂不可冰冻。
6.1.4 变质指示：当试剂有看得见的微生物生长，有浊度，或者未开盖的液体有沉淀时，表明试剂已变质，不能继续使用。
6.1.5 注意事项：试剂中含叠氮钠（0.95g/L）为防腐剂。
不可入口！避免接触皮肤及粘膜。
应采取必要的预防措施使用试剂。
6.2 校准品：使用罗氏公司提供的校准品对自动分析仪进行校准，具体参见生化检验校准品和质控品.SOP 文件。
6.3 质控品：具体参见生化检验校准品和质控品.SOP 文件。
7. 仪器：日立7060生化分析仪8. 操作步骤8.1 项目基本参数：参见生化检验日立7060生化分析仪项目测定参数.SOP文件8.2 仪器操作步骤：参见生化检验日立7060生化分析仪操作规程.SOP文件9. 检验结果的判断与分析10. 质量控制：在每一批标本中都应把非定值血清水平I与II质控做为未知标本进行分析，以2S为质控警告限，3S为失控限，绘制质控图，判断是否在控。
丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定-精品文档
【目的要求】 1.掌握血清谷丙转氨酶活性测定的基本原理。 2.熟悉血清谷丙转氨酶活性测定的具体操作 方法。 3.了解血清谷丙转氨酶活性测定的临床意义。
【实验原理】 血清中的谷-丙转氨酶（ALT），在37℃、 pH7.4的条件下，可催化基质（底物）液中 的丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸和丙酮酸：
改原赖氏法的反应温度(40℃改为37℃)和底物浓度(改为低 浓度)的改良赖氏法，对卡门氏单位的科学套用，使比色 法一些缺陷得到了卓有成效的克服，使其结果与速率法较 为一致，能较好反映酶的真实活性。 由于赖氏法设计的底物浓度,如a-酮戊二酸不足，反应速度 只能达到最大速度的65%；显色剂2,4-二硝基苯肼的用量只 及反应液中酮酸浓度的一半；保温30min的酶促反应后， 新生成的丙酮酸和未用完的a-酮戊二酸存在着无法人为控 制的竞争显色的几率问题，如此等等，使赖氏法的重现性 较差，在测量精度上仍与连续监测法相差甚大。
尽管基质液中余下的a-酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝 醌化合物而影响测定结果，但因其量不多，加之对505nm 的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用 标准曲线作测定时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光 度速率法矫正，摈弃了赖氏法一些固有弊端，结果比其他 比色法准确。故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续 监测法的单位使用赖氏法。1981年全国常规生化检验方法 学术讨论会认为赖氏法测定ALT活性较为合理，全国肝炎 协作会议也建议统一使用改良赖氏法。
【方法评价 】 ALT活性测定主要有两类。一是卡门氏（Karman） 分光光度法，测定的是酶促反应速率。其原理如 下： 由于NADH在波长340nm处有特异吸收峰，因此 ALT的活性可通过NADH的减少量，亦即通过 340nm吸光度的减少量间接作出定量测定。这一 方法特异性、准确性高。但是此法除要加入待测 酶ALT的底物外，还需要加入指示酶LDH及其辅 酶NADH，又需用紫外分光光度计，因此不易为 一般临床化验室推广。，要求各S管和U管进行双管平行操
血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性测定
标本的测定（改良赖氏法）
❖ 取适量基质缓冲液和待测血清，37℃水浴预温5min。 ❖ 取干净试管2支标明管号，按下表所示操作。
（对照管） 0.10 ---
基质缓冲液
0.50
❖ 混匀，放置5min，在505nm处以蒸馏水调零，读取各管吸光
度。
❖ 以测定管A测-A对之值作为标本的吸光度值，在标准曲线查得相
反应总体积
样本体积 比色杯光径
2020/3/23
12
注意事项
1、尽管基质液中余下的a-酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝醌化 合物而影响测定结果，但因其量不多，加之对505nm的吸光度 远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用标准曲线作测定 时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正，摈弃了 赖氏法一些固有弊端，结果比其他比色法准确。
可不同程度的损害肝细胞，引起ALT的升高。
2020/3/23
15
器材：分光光度计、半自动生化分析仪、恒温水浴箱、微量进样
器、移液管等。
待测标本：血清
2020/3/23
8
标准曲线的绘制（改良赖氏法）
❖ 取干净试管5支标明管号，按下表所示操作。
加入物（ml）
0
1
2
3
4
0.1mol/L磷酸盐缓冲液 2.0mmol/L丙酮酸标准液
基质缓冲液 2,4二硝基苯肼溶液
0.4mol/L NaOH溶液
完全。加入NaOH溶液的方法和速度要一致，不同的
方法及速度也会导致吸光度读数的差异。
5、底物中的α-酮戊二酸和2，4-二硝基苯肼均为呈色物
质，称量必须很准确，每批试剂的空白管吸光度上下
波动不应超过0.015，如超出次范围，应检查试剂及
血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活力测定
2014级12班1组201450557 陆丽霞血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活力测定实验原理：以丙氨酸和ɑ-酮戊二酸为底物，在血清丙氨酸氨基转移酶的作用下，生成丙酮酸和谷氨酸；丙酮酸产量的多少，即反应酶活性的大小,丙氨酸能与2，4-二硝基苯肼结合，生成丙酮酸二硝基苯腙。
丙酮酸二硝基苯腙在碱性溶液中呈现棕色，可用比色测定。
实验步骤：1.标准曲线绘制：⑴取6支试管并编号，按表4-16操作；表4-16 标准曲线的绘制试剂对照 1 2 3 4 52mmol/L丙酮酸标准液0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25底物溶液0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 PBS缓冲液0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 混匀，37摄氏度水浴5分钟，然后各管加入2,4—二硝基苯肼2,4——二硝基苯肼0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5混匀，37摄氏度水浴20分钟，然后各管加入0.4mol/L NaOH0.4mol/L NaOH 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0相当于ALT活力单位0 28 57 97 150 200A5200 0.059 0.107 0.167 0.208 0.249⑵将所得6支试管混匀，10min后以对照组调零，用520nm波长比色并读取吸光度；⑶以吸光度为纵坐标，各管相应的转氨酶单位为横坐标，绘制标准曲线2．酶活性测定：⑴取2支试管，编号，按表4-17操作：表2 ALT活力测定试剂对照测定血清——0.1PBS缓冲液0.1 ——底物溶液0.5 0.5混匀，37摄氏度水浴30分钟，然后各管加入2,4——二硝基苯肼2,4—二硝基苯肼0.5 0.5混匀，37摄氏度水浴20分钟，然后各管加入0.4mol/L NaOH0.4mol/L NaOH 5.0 5.0A5200 0.122⑵用520nm波长比色，以对照管调零，读取测定管吸光度；实验结果:由标准曲线方程y=0.0014x，当A520=0.122，即y=0.122，故x=87那么测得ALT酶活力单位为87讨论：1．查资料得参考正常值为40单位以下，实验测得ALT酶活力单位为87，机体可能发生了肝病变。
血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性测定(改良赖氏法)
实验操作
取干净试管12支，按下表所示标号，要求各S 管和U管进行双管平行操作。先做对照管和测 定管，在30min保温期间再做空白管和标准管
1.标准曲线绘制：取试管5支，按下表操作
混匀，室温放置10分钟后，以蒸馏水调零，用 520nm波长比色，读取各管光密度。各管光密 度减去0管光密度，然后以光密度的差值为纵 坐标，各管相应的转氨酶活性单位为横坐标， 绘制标准曲线。为了方便，可将光密度相当于 转氨酶的卡门氏单位列于其后
2.酶活性的测定：取试管2支，注明测定管及对照管，
在测定前将底物液在37摄氏度水浴中预温5分钟，再按下表操作
混匀，室温放置10分钟后，以蒸馏水调零，用 520nm波长比色，读取光密度，用测定管的光 密度减去对照管的光密度查标准曲线，即得到 待测血清中所含ALT的酶的活性。 参考值：5~25卡门氏单位
临床意义
ALT（GPT)广泛存在于机体各种组织中，但 在肝细胞中含量最多，当肝脏有病变，特别是 急性肝炎及肝细胞坏死是，血清中ALT活性显 著升高。在肝癌、肝硬变以及胆道疾病时，此 酶活性也可或轻度增高。另外，其他脏器或组 织的疾病，该酶活性也升高。
注意事项
1.不同血清对照管光密度基本相同，因此，同一批标本制作2~3个血清 对照管求其平均值即可，亦可用空白管代替对照管。对超过正常的标本 进行复查时，每份标本均应作对照管。 2.严重脂血症、黄疸或溶血的血清都能引起测定管OD值增加，因此，检 查此类标本时，应做血清对照管。 3.赖氏法标准曲线只到97卡门氏单位，其线性关系良好。超过此活力的 标本，应将血清稀释后再测定，结果乘以稀释倍数。 4.ALT底物液与2，4-二硝基苯肼液配置要准确，每次测定时空白管的 OD值上下波动不应超过0.015.如超出此范围应检查试剂及仪器等方面的 问题。 5.除了丙酮酸与2，4-二硝基苯肼再碱性溶液中能成腙外，α -酮戊酸亦 能与2，4-二硝基苯肼产生苯腙，两种苯腙的吸光度在520nm处有较大 差异，因此超过一定范围时，该方法所绘制的标准曲线呈抛物线。
血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活力测定5页
血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活力测定5页一、实验目的1. 掌握测定血清ALT活力的方法和原理。
2. 熟悉ALT在肝脏功能监测中的重要性。
二、实验原理ALT是一种酶，分布在人体的细胞内，主要存在于肝脏、心肌、骨骼肌和肾脏等组织中。
正常情况下，ALT主要在肝脏中发挥作用。
当肝脏受到损伤时，ALT会释放到血液中，导致血液中ALT活力的升高。
因此，测定血清ALT活力是一种常用的肝功能检测方法。
本实验使用比色法测定血清ALT活力。
利用谷草-丙氨酸转移酶测定(AST)所产生的谷草酸，和血清ALT催化产生的丙酮酸反应，生成2,4-二硝基苯胺，其吸光度与丙酮酸的浓度成正比。
由此计算出血清ALT活力。
三、实验步骤1. 将标准品和待测血清样品准备好，室温恢复至20-25°C。
2. 取比色管，在无菌条件下加入以下试剂：2.5ml缓冲液pH7.5、0.25ml 10mmol/L 肌酸盐缓冲液、0.2ml5.5mmol/LNADH、0.2ml2mol/L丙酮酸、0.1ml3%的PEG，混匀。
3. 加入待测血清样品1ml，立即混匀。
4. 马上读测吸光度(Zero)。
5. 在37℃恒温箱中孵育10分钟。
6. 然后再读一次吸光度。
7. 加入ALT试剂，混匀，孵育60秒钟。
8. 反应结束后7分钟内，读取吸光度值，记录。
9. 将标准品同样操作，测定吸光度，计算样品中ALT活力的单位(L_0.9)四、实验注意事项1. 实验中的所有仪器、试剂、杯器等都要事先清洗干净，确保无污染。
2. 实验操作应在干燥、无尘、无异味的净化房间内进行。
3. 操作过程中要注意保持常温。
4. 实验中的吸光度必须在规定时间内完成测定，避免影响结果。
5. 测定前，必须保证血清样品无血浆外渗。
6. 测定期间谨慎操作，防止试剂泼溅，注意安全。
五、实验结果分析ALT活性测定值与肝损伤的程度有一定的相关性。
当ALT活性超过健康人参考范围时，说明肝脏功能出现异常，可能出现肝炎、脂肪肝等肝病状况。
实验七血清丙氨酸氨基转移酶
实验七血清丙氨酸氨基转移酶（ALT ）测定——改良赖氏法一、实验目的了解丙氨酸氨基转移酶测定原理及方法。
二、实验原理丙氨酸氨基转移酶（ALT）又称谷一丙转氨酶（GPT）。
它催化L—丙氨酸和L—谷氨酸之间氨基的转移，反应式为：丙酮酸与2，4—二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙。
此二硝基苯腙在强碱溶液中显红棕色，色泽深浅与产生的丙酮酸多少即酶活性成正比。
三、仪器和试剂1 •仪器：37C水浴恒温装置，试管和试管架，吸管，722型分光光度计。
2．试剂：⑴0.0667 mol/L 磷酸盐缓冲液。
⑵丙氨酸氨基转移酶基质液：称取DL丙氨酸1.78克，？一酮戊二酸30毫克，先溶于0.0667 mol/L 磷酸盐缓冲液约20 毫升中，用1mol/L NaOH （约0.5毫升）调节pH 至7.4，再加磷酸盐缓冲液至100毫升。
4~6 C中保存，并加一至二滴氯仿，防止细菌分解作用。
⑶2,4-二硝基苯肼溶液：溶2,4-二硝基苯肼200 毫克于热1 mol/L HCl 中，并用1 mol/L HCl 加至1 升刻度，避光保存。
⑷0.4 mol/L NaOH 溶液。
⑸丙酮酸标准液（2mmol/L ）:溶丙酮酸钠22毫克于缓冲液100毫升中，存放冰箱，此溶液在数天内是稳定的。
四、实验步骤加入物（ml）测定管测定空白管血清0.10 —加温至37 C的丙氨酸氨基转移酶基质液0.50 0.50各管分别混和，置37 C水浴30分钟，取出。
2, 4 —二硝基苯肼溶液0.50 0.50血清一0.10各管分别混匀，置37 T水浴20分钟，取出。
0.4 mol/L NaOH 溶液5.00 5.00在30分钟内用波长505nm比色，以蒸馏水校正零点和100%，读取各管吸光度测定管吸光度减去测定空白管吸光度后，于标准曲线上查得酶活性单位。
标准曲线绘制：（所加试剂按毫升计）加入物（ml）管号1 2 3 4 5丙酮酸标准液（2mmol/L ）0 0.05 0.10 0.15 0.20丙氨酸氨基转移酶基质液0.50 0.45 0.40 0.35 0.300.0667 mol/L 磷酸盐缓冲液0.10 0.10 0.10 0.10 0.10相当于丙酮酸实际含量（？mol/L）0 0.1 0.20 0.30 0.40相当于丙氨酸氨基转移酶活力（卡门氏单位）0 28 57 97 150各管混匀后置37 T水浴5分钟，加2,4—二硝基苯肼溶液0.5毫升混匀，置37 C 水浴20分钟，取出，每管各加0.4 mol/L NaOH溶液5.0毫升，于30分钟内用波长505nm比色，以蒸馏水校正零点和100%，读取各管吸光度。
血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定
比色法的基本原理
朗伯-比尔定律: A=KLC 即吸光度A与溶液的浓度C和 溶液的厚度L的乘积成正比关 系 。 在其他条件相同时，溶液的 浓度越大或是厚度越大，则溶 液对光的吸收越强（光密度越 大），而透光度则越小。
比色法的基本原理
当一束单色光通过同一有色溶液的两种不 同浓度的溶液时，可得出下列两式： 标准管：A标=KC标L 测定管：A测＝KC测L 则
C测=A测/A标 ×C标
实验原理
谷丙转氨酶 ALT
α- 酮戊二酸二硝基苯腙(干扰)
实验操作
取试管4支，按下表加入试剂：
静置10分钟，在520nm 下读取各管吸光度。
计算
活力单位：1ml 血清于37℃ 条件下与底物作 用30min产生2.5μg丙酮酸为一个1ALT单位。
C测(ug/ml )=
A测- A测空 A标- A标空
×
C标(100ug/ml)
ALT活力单位/ml=
1ml血清产生的丙酮酸ug数(C测)
2.5ug
生理意义
ALT广泛存在于一般组织细胞中,肝细胞中此 酶含量最多。肝炎、中毒性肝细胞坏死等肝病时， 血清中此酶活性增加，其他疾病如心肌梗塞、心 肌炎等亦有增高。故血清谷丙转氨酶活性得测定 在临床诊断上具有重要意义。
血清丙氨酸氨基 转移酶 （ALT）测定
目的要求
掌握ALT活性测定的基本原理; 掌握比色法的原理和分光光度计的使用 方法; 了解ALT活性测定的临床意义。
比色法的基本原理
比色分析法是通过比较溶液
颜色深浅来测定物质浓度的方法。
比色法的基本原理
当一束单色光通过有色溶液时， 由于溶液吸收了一部分光线， 透过光的强度就减弱。 透光率：T= I/ Io 吸光度(A) : A=-lgT=-lg (I/ Io) 溶液的透光率越大，说明对光 的吸收越少；反之，透光率越 小，说明对光的吸收越多;T值 越小，A值越大。
丙氨酸氨基转移酶的测定
丙氨酸氨基转移酶的测定
丙氨酸氨基转移酶（ALT）的测定主要通过肝功能检查进行，其参考值范围为0~40U/L。
在测定前，患者需要空腹12小时，不过不同年龄及人群参考范围没有明显差异。
当丙氨酸氨基转移酶数值偏高时，通常提示肝脏受到损害。
这可能是由多种原因导致的，如不良饮食习惯、过度劳累、药物因素等。
如果同时伴随肝区不适、全身乏力、食欲下降等情况，可能存在病毒性肝炎、脂肪肝、肝硬化等疾病。
丙氨酸氨基转移酶（ALT）的测定原理是催化丙氨酸与α-酮戊二酸之间的氨基转移反应。
具体来说，ALT催化丙氨酸的氨基转移到α-酮戊二酸上，生成丙酮酸和NADH，然后NADH在LDH的催化下生成NAD+。
在上述偶联反应中，NADPH的氧化速率与样本中酶活性呈正比，因此可以通过检测NADPH的氧化速率来确定ALT的活性。
总的来说，丙氨酸氨基转移酶的测定对于评估肝脏功能具有重要意义。
如果检测到肝脏功能受损，建议前往医院就诊，由专业医生进行评估和治疗。
生物化学实验2.血清丙氨酸氨基转移酶测定.专科
一、实验目的
1.掌握血清丙氨酸氨基转移酶测定的原理和 方法
2.熟悉722G型可见光分光光度计的使用
二、实验原理
血清中的丙氨酸氨基转移酶（ALT），在37℃、pH7.4 的条件下，可催化基质（底物）液中的丙氨酸与α-酮戊 二酸生成谷氨酸和丙酮酸。
在足量底物作用下，生成产物越多表明酶活力越大， 酶浓度越高。一般以在一定时间内丙酮酸的生成量代 表血清ALT活力的大小
三、试剂和仪器
(一）试剂 1、 小牛血清 2、ALT底物液、2,4-二硝基苯肼溶液 0.4mol/L NaOH
(二）仪器 722G型可见光分光光度计、恒温水浴箱
四、操作步骤
1.标准曲线的绘制（不做）。 2.血清ALT活力测定 取两支试管按下表操作：
试剂（ml）
测定管
对照管
血清
0.1
0.1
ALT底物液
实验二
血清丙氨酸氨基转移酶测定
血清丙氨酸氨基转移酶测定
丙氨酸氨基转移酶（ALT）是体内最重要的转 氨酶之一，正常情况下，丙氨酸氨基转移酶主要存 在于各组织细胞中（以肝细胞中含量最多，心肌细 胞中次之），只有极少量释放入血，所以血清中此 酶活力很低。当这些组织病变、细胞坏死或通透性 增加时，细胞内的此类酶即可大量释放入血液中， 使血清中该酶活力显著增高。因此在患各种肝炎急 性病、药物中毒性干细胞坏死等疾病时，血清丙氨 酸氨基转移酶活力明显增高。
•从标准曲线上查出酶活力单位。
本法正常值：0~30单位。
注意事项
• 加完试剂需要将试管内溶液混匀 • 注意水浴的温度及时间 • 分光光度计的正确使用
• 【临床意义】
• 肝细胞中含ALT最丰富，因此当肝脏疾病致肝细 胞受损伤时，ALT即大量释放入血液，致使血清 中ALT活性增高。测定ALT是检查肝功能的重要 指标之一。ALT显著增高见于各种急性肝炎及药 物中毒性肝细胞坏死，中等程度增高见于肝癌、 肝硬化、慢性肝炎及心肌梗塞，轻度增高则见于 阻塞性黄疸及胆道炎等疾病。骨骼肌损伤、多发 性肌炎亦可引起转氨酶活性升高。
实验七 谷丙转氨酶活性测定(改良赖氏法)(1)
思考题
1. 为什么在制作标准曲线时要加入基质液？ 2. 为什么在制作标准曲线时加入基质液的体积不
同，对反应没有影响？
3. 在更换试剂时，为什么要重新绘制标准曲线？
4. 试分析影响实验结果的可能因素有哪些？
5. 溶血血清样品会引起什么样的不良后果？
试剂盒组成成份
• • • • （R1）基质液 L-丙氨酸及α -酮戊二酸 （R2）显色剂 2,4-二硝基苯肼 （R3） NaOH 标准液 丙酮酸钠
实验步骤
• 血清GPT活性测定 • 标准曲线绘制：以各管酶活力单位的对 数为横坐标，对应的吸光度为纵坐标， 绘制工作曲线图。
标准曲线绘制：y=0.0027x-0.0115 （x:酶活性；y:A
氨基转移酶（转氨酶）
： 催化氨基酸与酮酸之间氨基转移的一类酶
• 谷丙转氨酶 glutamic-pyruvic transminase GPT 又称丙氨酸转氨酶alanine aminotransferase ALT
• 谷草转氨酶 glutamic oxaloacetic transaminase GOT 又称天冬氨酸转氨酶 aspartate transaminase, AST胞破损酶溢出 GOT升高 GOT/GPT升高
血清中酶活力
• GOT以心脏细胞中活力最大，其次为肝脏细胞 • GPT则以肝脏细胞中活力最大
低
酶活力单位（U，active unit）
• 习惯单位：60年代以前，酶单位没有统一的标准，都使用 各自测定方法的习惯定义。因此不同酶、甚至同一酶不同 测定法都可以有不同的定义。 • 国际单位：61年酶学委员会建议使用统一单位，在特定条 件下，1分钟内转化1 μ mol底物所需的酶量（IU/L或U/L） • 卡门氏单位：在温度25℃，pH7.4，波长340nm，光径 1cm的条件下，1ml血清使反应液的吸光度下降0.001的转 氨酶活性。 卡门氏单位和国际单位换算： 1 IU/L＝2.1 KarU Notice：国内多用37℃或30℃检测，因此这种换算是有误 差的
血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测定(赖氏法)
授课对象：06级检验1-5班课时：2学时血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）测定（赖氏法）目标：1.掌握赖氏法测血清ALT的原理及注意事项2.掌握试剂的配制熟练地制作标准曲线3.规范地进行ALT测定4.了解血清ALT测定的临床意义实验用品：配制试剂用的各种器皿（烧杯、容量瓶、电炉、分析天平等）、37℃水浴箱、721型风光光度计、坐标纸等原理：丙氨酸和α-酮戊二酸在血ALT的作用下生成丙酮酸及谷氨酸，在酶反应达到规定时间时，加入2.4-二硝基苯肼-盐酸溶液以终止反应。
生成的丙酮酸与入2.4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸入2.4二硝基苯腙，苯腙在碱性条件下显红棕色。
根据显色之深浅，求得血清中丙氨酸氨基转移酶活力。
试剂：1. 0.1molPH7.4磷酸盐缓冲液称取磷酸氢二钠（Na2HPO4AR）11.928g,磷酸二氢钾（KH2PO4AR）2.176g，加少量蒸馏水溶解并稀释至1000mL。
2. ALP基质液称取DL丙氨酸[CHCH（NH）COOH]1.79g，α-酮戊二酸[COOH （COCOOH）29.2mg于烧杯中，加入0.1mol/L PH7.4磷酸盐缓冲液80mL,煮沸溶解后待冷，用摩尔NaOH溶液调节PH至7.4（约加入0.5ml），再用0.1mol/LPH7.4磷酸盐缓冲液稀释至100mL,混匀，加氯仿数滴，置冰箱保存数周。
3．1mmol/L2.4-二硝基苯肼溶液称取 2.4-二硝基苯肼[（NO）CHNHNH AR]19.8mg，用10mol/L HC110mL溶解，然后加蒸馏水至100mL，置棕色瓶内，冰箱保存。
4．0.4mol/L NaOH溶液。
5．2mmol/L丙酮酸标准液精确称取丙酮酸钠[CHCOCOONa AR]22.0mg于100mL容量瓶中，加0.1mol/L PH7.4磷酸盐缓冲液至刻度。
此液应新鲜配制，不得久放。
操作：血清ALT测定步骤（赖氏法）加入物（mL）R B血清0.1 0.1ALP基质液0.5 —混匀，置37o C水浴30min2.4-二硝基苯肼0.5 0.5ALP基质液—0.5混匀，置37o C水浴20min0.4mol/L NaOH 5.0 5.0将上述两管混匀，10min后，用蒸馏水调零，λ=505nm比色读取各管吸光度值，用测定管A-对照管A，查标准曲线得ALT活力单位。
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1、ALT的临床意义?
(2)丙氨酸氨基转移酶底物液(pH7.4)：精确称取DL－丙氨酸1.78g和α—酮戊二酸29.2g，先溶于0.1mol/L
磷酸盐缓冲液约50ml中，然后用1mol/L NaOH 校正pH到7.4，再用磷酸缓冲液稀释到
100ml。充分混匀，冰箱保存，可保存一周。(3)0.02%
此试剂需现用现配。【操作步骤】1．标准曲线的制作 取干燥洁净试管9支，编号，按下表加入试剂，混匀：
另取干燥洁净试管11支，编号，在1～9号试管中依次加入上述稀释的1～9号丙酮酸标准液0.1ml，在10号管中加入未经稀释的丙酮酸标准液(500μg/ml)
丙酮酸产量的多少，即反应酶活性的大小。
丙酮酸可与2,4—二硝基苯肼在酸性溶液中反应形成相应的2,4-二硝基苯腙，呈黄色，后者在碱性条件下呈红棕色。通过测定其在520nm波长处的光吸收来了解丙酮酸的生成量，借此测定血清ALT的活力，故该类方法又称比色测定法。该法虽然也有缺点，但操作简便，不需要特殊仪器和试剂，故在临床上被广泛应用。
研究酶促反应速度和各种因素对酶促反应速度的影响时，一般以酶的活力单位为观察指标。酶活力是指酶催化化学反应的能力；酶活力的大小用酶活力单位表示，酶的一个国际单位为在25℃下，1分钟内催化1μmol/L底物的酶量，或是转化1微摩尔（1μmol）底物的有关基团的酶量。测定酶活力时，常常用产物的生成量或是底物的消耗量来计算。一般以测定产物增加量为好，因为产物从无到有，只要方法足够灵敏就可以准确测定。2．测定血清丙氨酸氨基转移酶活性的方法简介
取干燥洁净试管2支，标明测定管和对照管，按下表操作。
混匀，静置10min，用分光光度计，在520nm波长，用蒸馏水调节零点，读取测定管和对照管光密度，以测定管光密度值减去对照管光密度值，然后从标准曲线上查出其酶的活力单位。【注意事项】1．标本应空腹取血，当时进行测定或将分离的血清贮存于冰箱中。2．酶的测定结果与酶作用时间、温度、PH及试剂加入量等有关，在操作时均应准确掌握。3．测定试剂更换时，要重新制作标准曲线。【临床意义】ALT广泛存在于一般组织细胞中,肝细胞中此酶含量最多。肝炎、中毒性肝细胞坏死等肝病时，血清中此酶活性增加，其他疾病如心肌梗塞、心肌炎等亦有增高。故血清丙氨酸氨基转移谷丙转氨酶活性得测定在临床诊断上具有重要意义。【附注】1．酶活力的意义及测定方法
实验七 血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性测定
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学科简介
师资队伍
教学大纲
授课教案
教学课件
河南中医学院生物化学精品课程 更新于 2009.04
2、ALT的正常值是多少7
． 3、对照管的意义是什么?
4、底物液为何要37℃预温5min?
建议使用1024*768以上分辨率，IE6.0以上版本浏览器
一类是分光光度法，另一类是比色法。前者是测定酶速率的方法，需要紫外分光光度计与酶试剂。后者有金式(King)法，穆氏（Mohum）法与赖氏（Reitman
Frankel）法3种。这3种方法是目前国内测定ALT的主要方法，他们的测定原理、试剂和操作步骤及采用温度等方面均完全相同，主要不同点为酶与底物的作用时间、标准曲线绘制方法和单位定义。在作用时间上，金氏为60min，其余两法均为30min。金氏法的单位是：100ml血清与足量丙氨酸、α-酮戊二酸在pH7.4
0.1ml,再按下表操作。
各管混匀，于室温静置10分钟，520nm波长，以第11管为空白管比色，读取各管光密度将各管丙酮酸含量（5－50μg）按下式换算成谷丙转氨酶活力单位:
以每100ml血清中丙氨酸氨基转移酶活力单位为横坐标，光密度为纵坐标绘制标准曲线。 2．酶活性的测定
该法的单位定义是:每lml血清在pH7.4,37℃保温条件下与底物作用30分钟,每生成2.5μg丙酮酸为一个单位。人血清的丙氨酸氨基转移酶正常值为2～40U。【器材和试剂】1.器材
恒温水浴、721、722分光光度计、液体混合器、刻度吸量管、滴管、试管等。2.试剂(1) 0.1mol/L
参考图片
作业习题
实验指导
指定教材
参考书目
教学视频实验七 血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性测定
【实验目的】1．掌握血清丙氨酸氨基转移酶活性测定的基本原理。2．了解血清丙氨酸氨基转移酶的测定方法及临床意义。【实验原理】丙氨酸氨基转移酶(ALT)催化丙氨酸与α—酮戊二酸生成丙酮酸和谷氨酸。
2,4-二硝基苯肼溶液(1mM)：精确称取2,4-二硝基苯肼20mg溶于1mo1／L盐酸中，待溶解后用1mo1／L盐酸稀释至100ml过滤后使用。(4)0.4M/L氢氧化钠溶液。
(5)丙酮酸标准液(500μg/ml)：精确称取丙酮酸钠62.5mg溶于0.1mol/LH2SO4 100ml中,
37℃保温1h，每生成1μmol丙酮酸，称为一个丙氨酸氨基转移酶活力单位。穆氏法的单位定义是：每毫升血清在pH7.4，37℃保温条件下与底物作用30min，每生成2.5μg丙酮酸为一个单位。赖氏法的单位定义是：血清1ml，反应总液量3
ml,在25℃、340nm光波下，光径1cm，1
磷酸盐缓冲液(pH 7.4)：称取无水磷酸二氢钾（KH2PO4）2.69克和磷酸氢二钾K2HPO4 ·3H2O
13.97g加蒸馏水溶解后移至1 000ml容量瓶中，校正pH到7.4，然后加蒸馏水至刻度。贮存于冰箱中备用。