肝内胆管癌分子生物学特性的研究进展_董辉

·综述·肝内胆管癌分子生物学特性的研究进展董辉(综述)　丛文铭(审校)基金项目:上海市卫生系统百名优秀跨世纪学科带头人培养计划资助项目(98BR007)作者单位:200438　上海市,第二军医大学东方肝胆外科医院病理科 肝内胆管癌(intr ahepatic cholan -g io ca rcinoma ,ICC )是仅次于肝细胞癌(hepatocellularca rcino ma ,HCC )的第二大肝脏常见恶性肿瘤,在我国约占肝脏恶性肿瘤的2.3%〔1〕,其恶性程度极高,容易转移,非手术病人的中位生存期一般仅为9个月。

相比较HCC 而言,以往对ICC 发生与发展过程中的多基因变异特征缺乏系统的研究和了解,研究水平相对滞后。

但近些年来,对ICC 的研究开始引起重视,对其分子生物学特性有了一些新的认识。

本文拟就与ICC 相关的分子生物学研究进展做一扼要综述。

一、细胞遗传学改变1.染色体不稳定:比较基因组杂交(co mpa rativ e g eno mic hy bridizatio n ,CG H )可以展现全基因组的染色体异常。

利用CG H 技术,发现在ICC 中存在着多种细胞遗传学缺陷,包括染色体的非随机性丢失和增益。

Ko o 等〔2〕用CG H 技术检测了24例H CC 和11例ICC 组织,结果发现17p 缺失在两种肿瘤中都非常常见,此与T P53基因缺失有关。

与HCC 相比,5p 、7p 、13q 和20q 的增益在ICC 更为常见,尤其是20q 。

值得一提的是,ICC 以13q 增益为主,而HCC 中则以13q 缺失为主〔3〕。

Kang 等〔4〕采用55个全基因组微卫星标志物对36例ICC 病人的癌与癌旁组织进行了杂合性缺失(loss of he te rozy -g osity ,LO H )分析,发现LO H 频率最高的是8p ,为65.6%。

进一步的研究表明,8p22存在一个候选肿瘤抑制基因(F EZ I ),并且与ICC 的恶性演进有关〔5〕。

2.CpG 岛甲基化:基因甲基化不仅与正常胚胎发育和生长发育等有关,而且还与多种肿瘤的发生发展密切相关,已逐渐成为研究热点,其中最常用的技术是甲基化特异性PCR (me thy la -tion -specific P CR ,M SP )方法,其基本原理是采用亚硫酸氢盐对基因组DN A 进行处理后,使DN A 中的C 转变成U ,而如果被检测基因已经发生CpG 岛甲基化,则不能发生这种转化。

为此,设计不同的引物做PCR ,即可检测出这种差别,从而确定目的基因有无CpG 岛甲基化。

此种方法DN A 需要量极少,敏感性很高〔6〕。

Lee 等〔7〕采用M SP 方法,对手术切除的79例ICC 和15例正常胆管上皮组织中18种基因进行了甲基化位点分析,其中包括参与细胞周期调控(p14,p16,14-3-3sigma ,和CO X -2)、信号转导路径(A PC 和PT EN )、DN A 修复(M GM T 和GST P -1)、细胞凋亡(DA P -激酶)、血管生成(T HBS1)以及与浸润和转移(E -cad -herin 和T IM P -3)相关的基因。

结果显示,发生高频(>40%)甲基化的基因为14-3-3sig ma (59.5%),M IN T 12(50.6%)和M IN T 1(40.5%),而A PC 、p16和T IM P -3的甲基化与病人预后之间有显著相关性,发生基因甲基化病人的预后较差,提示DN A 甲基化可能是导致ICC 发生的重要分子机制之一,并有可能作为预测ICC 预后的有用标志物。

二、分子遗传学改变1.癌基因激活:(1)K -r as :K -ras 是ras 基因家族的重要成员之一,其编码产物为p21ras ,属于传导分子类,在细胞质中形成后95%定位于细胞膜上,它与鸟嘌呤核苷酸有高度的亲和性,同时它本身可能也具有G T P 酶活性,在控制细胞生长和分化方面起着关键作用。

K -r as 突变热点为第12号和13号密码子,可导致第12位氨基酸由正常的GG T 转变为G T T 、CG T 或GA T ,第13位的G GC 转变为G AC 等。

T an -napfel 等〔8〕用DN A 直接测序的方法对41例ICC 癌和癌旁组织DN A 进行ras 序列分析,发现其中22例(54%)ICC 有突变。

还有人利用活检穿刺材料或胆汁标本检测K -r as 第12号密码子突变以提高胆道系统肿瘤诊断率〔9〕,当原发性硬化性胆管炎病人胆汁中出现K -ras 突变时,则为发生ICC 的高危因素〔10〕,换言之,在硬化性胆管炎病人胆汁中出现K -ras 突变常代表胆管癌发生过程中的早期分子事件。

值得注意的是,H CC 组织中很少检测到K -ras 突变。

(2)BRA F :Raf /M EK /ERK (M A PK )信号转导通路在多种细胞的生长、增殖和分化中起着重要的调控作用。

Raf 基因可以被原癌基因Ras 激活,并在相应的生长调控通路中起协同作用。

BRA F 突变在大约15%的人类肿瘤中已有发现,尤其是恶性黑色素瘤〔11〕。

T annapfel 等〔12〕对69例ICC 和25例HCC 标本利用DN A 直接测序的方法分析BRAF 和K -r as 基因,并采用免疫组化的方法评价M AP K 通路的活化状况。

结果显示,22%(15/69)ICC 发生BRA F 基因突变,所有突变都在第11和第15外显子内,突变主要部位为第1796位核苷酸,进而导致599位氨基酸由缬氨酸(V )转变为谷氨酸(E ),K -r as 的突变率为45%(31/69),而在25例HCC 中无一发现有BRAF 和K RA S 基因突变。

在有BRA F 突变的ICC 中,M A P K 蛋白免疫组化呈强阳性,表明RA S -RA F -M EK -ERK -M A PK 信号转导通路在ICC 进展过程中发挥着重要作用,但BRA F 突变与临床病理学参数及病人预后之间无显著相关性。

由RA S 或BRA F 突变引起的M A PK 信号转导通路的中断在大约62%的ICC 中可检测到,所以此通路的异常是胆管癌发生过程中最常见的缺陷之一。

2.肿瘤抑制基因缺失:(1)p53:p53位于人类染色体17p13.1,全长20kb ,是细胞生长周期中负调控因子,与细胞周期的调控、DN A修复、细胞分化、细胞凋亡等重要的生物学功能有关,是人类肿瘤中最常见的变异基因之一。

M omoi等〔13〕对ICC组织p53基因4～8外显子测序显示突变率为10.7%(3/ 28),并且只在分化差的肿瘤中出现。

ICC中mdm2基因的扩增频率为31.8%,同时伴随着mdm2蛋白表达的相应增加,而mdm2蛋白的过度表达的病例几乎都含有p53野生型基因,由此认为p53在ICC中发挥致癌作用,很可能系因mdm2蛋白与P53蛋白结合并导致后者失活所致。

Co ng等〔14〕的研究显示,ICC组织中p53基因LO H发生率为37.5%,并且与RB1和OG G1基因LO H一起提示ICC处于发展的晚期阶段,此型病人3年生存率仅为30%,与不发生此3种基因异常病人3年生存率(88.9%)相比差异有统计学意义(P<0.05)。

(2)A PC:A PC定位于5q21,与A xin,G SK-3β和β-catenin 组成复合体,在wnt/AP C信号转导通路中起重要作用。

当A PC处于非激活状态时,复合体通过磷酸化下调β-ca te-nin表达水平。

当wnt与配对受体Frizzled结合时可抑制复合体的活性,致使细胞质β-ca tenin水平升高,转运到细胞核,激活包括myc,cy clinD1等在内的多种基因的表达。

据报道〔15〕, 82%(51/71)的ICC中呈现β-catenin表达减少,15%出现核的异常表达,β-ca tenin在细胞核里表达增加也从另一个方面说明了W nt/β-catenin/T cf通路在ICC的发生中起着重要作用。

Co ng 等〔14〕对21例ICC研究显示,ICC中AP C基因L O H发生率为68.8%,提示AP C基因缺失是ICC的发病原因之一,并且根据单独发生A PC突变的ICC病人预后好于合并p53等其它基因突变ICC病人的研究结果可以推断AP C基因异常很可能出现于胆管癌发生的相对早期阶段。

(3)F HIT:该基因位于人类染色体3q14.2,F HI T蛋白是一类典型的A p3A(5',5'''-p1,p3-tripho s-phate hy drolase)水解酶,催化Ap3A的水解反应,使A p3A水平下降。

F HI T 基因异常导致Ap3A水解酶活性丧失,从而导致Ap3A或类似复合物水平升高并促使肿瘤发生。

新近,Ko ch等〔16〕利用F HIT第5和第8内含子微卫星多态性标志物(D3S1300和D3S1234)对19例ICC中F H IT的LO H状况进行分析,显示两者的LO H频率分别为20%和14%。

免疫组化染色显示,ICC中F HIT蛋白表达不同程度地减少或缺失,提示F H IT基因变异与M SI有关,并且可能还存在其他位点的突变或CpG岛甲基化改变。

FH IT等位基因的缺失在动物实验中可以增加肿瘤的易感性,其在人类肿瘤中的改变也给我们在研究ICC发生和演进的多步骤分子机制中提出新的目的基因,尽管它在DN A修复机制和基因组稳定性方面的可能作用尚有待探索。

(4)p16和Rb:这两个基因都是与细胞周期调控有关的基因,p16I NK4a位于9p21,编码一种负调控蛋白,通过与CDK4相互作用,抑制其激酶活性来控制真核细胞通过G1期,p16失活时,CDK4与cyclin D结合,磷酸化pRb,进而促使细胞进入S期。

在不同组织类型的肿瘤中,p16基因以三种方式失活,即突变、同源性缺失和甲基化。

T annapfel等〔17〕发现ICC中p16甲基化频率为76%(39/51),9p21的LO H频率为16%(8/51),3.9%(2/51)病人发生同源性缺失,肿瘤亦不表达p16蛋白。

由此表明,在ICC中肿瘤抑制基因p16失活的主要方式为基因甲基化。

Rb位于13q14.1,是第一个被克隆的抑癌基因,其调节细胞生长分化的主要形式为Rb的磷酸化状态,这一事件发生于G1期和S期交界处。

Rb在非磷酸化状态时可与E2F蛋白结合,并抑制其活化基因表达的功能,当处于磷酸化时,则不能与E2F结合。

当Rb基因异常导致功能性Rb蛋白减少时既不能与E2F形成复合体,也不能通过其本身磷酸化抑制cy-clinD1转录,可使细胞持续性增殖而发生肿瘤。