南方红豆杉水提物抑制裸鼠A549肺癌移植瘤生长及其机制研究_崔庆丽 (1)

第 38 卷第 20 期 2013 年 10 月
Vol. 38，Issue 20 October机制研究
崔庆丽1，3 ，邵梅2，3 ，舒琦瑾3*
（ 1. 郑州大学 附属肿瘤医院 河南省肿瘤医院，河南 郑州 450008； 2. 中国人民解放军第八十一医院，江苏 南京 210002；
3. 浙江中医药大学 第一附属医院，浙江省中医院，浙江 杭州 310006）
［摘要］ 目的： 研究南方红豆杉水提物对裸鼠 A549 肺癌移植瘤生长的抑制作用和机制。方法： 建立荷 A549 肺癌移植瘤 模型，随机分为对照组、低、中、高剂量南方红豆杉水提物实验组，24 h 后以等体积生理盐水及药物灌胃，给药 7 周，每 3 d 测移 植瘤长短径，绘制移植瘤生长曲线，给药 7 周后处死裸鼠，取瘤组织，计算抑瘤率，采用 Ｒeal-time PCＲ 及 Western blot 方法检测 mＲNA 和蛋白水平。结果： 南方红豆杉水提物各剂量组均有明显抑瘤效果（ P ＜ 0. 05） 。与对照组相比，各实验组移植瘤组织 中 EGFＲ 及 Survivin mＲNA 水平明显下调（ P ＜ 0. 05） ，VEGF mＲNA 水平无明显变化。灰度值之比分析显示： 各实验组移植瘤 组织中 EGFＲ 及 VEGF 蛋白水平均有下调趋势，但差异无统计学意义，Survivin 及 p-EGFＲ 蛋白水平明显下调（ P ＜ 0. 05） 。结 论： 南方红豆杉水提物对血管生成无明显影响，可能通过抑制 Survivin 蛋白，抑制 EGFＲ 磷酸化，起到抑制移植瘤生长的效果。
第 38 卷第 20 期 2013 年 10 月
Vol. 38，Issue 20 October，2013
鼠均无死亡。各组移植瘤瘤体圆形或不规则形，色 灰白或灰红，质韧，至实验后期因瘤体增大，可见瘤 体表面血管密布，色紫红。 3. 3 南方红豆杉水提物对裸鼠 A549 移植瘤的影 响 各组初始瘤体积组间差异无统计学意义，瘤体 大小一致性 较 好，观 察 期 间，对 照 组 生 长 速 度 最 快 （ 图 1） 。裸鼠移植瘤生长曲线显示，用药至第 7 周， 低剂量和高剂量抑瘤效果好，但高、中、低剂量组间 差异无统计学意义。实验结束剥取瘤组织，称重，各 用药组瘤重明显低于对照组（ P ＜ 0. 01） ，瘤重抑制 率分别为 47. 53% ，39. 59% ，46. 47% （ 表 1） 。
［关键词］ 南方红豆杉； A549 肺癌； 移植瘤； 抑制作用
南方红豆杉 Taxus chinensis var. mairei Cheng et L. K 为红豆杉科红豆杉属，是世界上公认的濒临灭 绝的天然珍稀抗癌植物。红豆杉药用价值在中医学 中早有记载，《本草纲目》记载红豆杉功效消 肿 散 结，主治肿瘤、肾病、风湿等。从红豆杉树皮和枝叶 中提取的紫杉醇，是国际上公认的防癌抗癌的药剂。 而与紫杉醇相比，南方红豆杉水提物安全有效，是国 内临床应用的主要形式。已有研究表明南方红豆杉 水提物抗肿瘤作用机制与紫杉醇明显不同［1］，紫杉 醇抑制肿瘤细胞的机制主要为细胞毒作用，而南方 红豆杉可 能 通 过 降 低 P-jnk 蛋 白 表 达 诱 导 细 胞 凋 亡，其主要有效成分并非紫杉醇。已有体外实验表 明南方红豆杉水提物可通过抑制 Survivin 蛋白，诱 导凋亡［2］等途径抑制 A549 细胞增殖［3］起到抗肿瘤 效果，但目前尚未见南方红豆杉水提物（ AETC） 抑 制肿瘤的体内实验报道。
［收稿日期］ 2013-04-15 ［基金项目］ 浙江省自然科学基金项目（ Y2081051） ； 浙江省中医药 管理局重点项目（ 2009ZA003） ［通信作者］ * 舒琦瑾，博士，教授，博士生导师，Tel： 13605706566， E-mail： shuqijinhz@ yahoo. com. cn ［作者简介］ 崔庆丽，硕士，住院医师，Tel： 15515761098，E-mail： luotuoqingli@ 163. com
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第 38 卷第 20 期 2013 年 10 月
Vol. 38，Issue 20 October，2013
司） ，VEGF 及 β-Tubulin 一抗 （ 美国 Abcam 公司） ， 羊抗兔二抗（ 美国 Santa Cruz 公司） ，ECL 化学发光 试剂盒（ 美国 Millipore 公司） ，PVDF 膜（ 美国 Millipore 公司） ，EGFＲ，Survivin，VEGF，GAPDH 引物（ 上 海生工生物工程有限公司） ，SYBＲ Premix Ex TaqTM （ Perfect Ｒeal Time） （ Takara 公 司） ，PrimeScript ＲT reagent Kit（ Perfect Ｒeal Time） （ Takara 公司） ； 氯仿、 异丙醇、无水乙醇等试剂均为国产分析纯 （ 上海化 学试剂公司） 。 1. 3 动物 SPF 级 6 周龄雄性裸鼠，购自上海西普 尔-必凯 实 验 动 物 有 限 公 司，生 产 许 可 证 号 SCXK （ 沪） 2008-0016。由浙江中医药大学动物实验中心 提供无特定病原体（ specified pathogens free，SPF） 级 层流架中，笼具、垫料、饮水、饲料均经灭菌处理，饲 养和实验处理按照无菌操作规范操作。 2 方法 2. 1 药物制备 取适量南方红豆杉在冷水中充分 浸泡 0. 5 h，然后加药物 5 ～ 10 倍的冷水，煮沸后控 温电炉保持微沸 30 min，用滤网过滤药渣后将其作 为高剂量母液，浓煎至 208 g·L － 1 ，按照 1∶ 2 和 1∶ 4 分别稀释为中剂量和低剂量。药品保存在 4 ℃ 冷藏 冰柜中。 2. 2 细胞培养及处理 人肺腺癌细胞株 A549 购 自中国科学院上海细胞生物学研究所。用体积分数 为 10% 的胎牛血清 F12-K 培养液，在 37 ℃ ，5% 的 CO2 培养箱中培养。实验时取对数生长期细胞。 2. 3 动物模型建立及分组给药 取 1 × 107 个 / mL 的 A549 单细胞悬液，每只裸鼠颈背部皮下接种 0. 2 mL。接种后将 48 只裸鼠随机分为对照组、南方红 豆杉水提物低、中、高剂量组（ 0. 52，1. 04，2. 08 mg· g － 1 ） ，每 组 12 只。接 种 后 24 h 灌 胃 给 药，每 天 1 次，每次 0. 2 mL。中剂量为临床人用剂量按照人和 动物等效剂量折算法得出。成瘤后每 3 d 测移植瘤 长径及短径，连续给药 7 周后处死，剥取瘤组织，称 重后液氮保存。移植瘤体积按通用标准公式［4］V = a × b2 /2 计 算 肿 瘤 体 积 （ V 为 移 植 瘤 体 积，单 位 mm3 ，a 为移植瘤最长径，b 为移植瘤最短径，单位均 为 mm） 。观察肿瘤生长速度，绘制裸鼠移植瘤生长 曲线。 2. 4 Ｒeal-time PCＲ 检测 mＲNA 水平 取 50 ～ 100 mg 移 植 瘤 组 织，Trizol 法 提 取 总 ＲNA，Nanodrop 2000 分光光度计测定 ＲNA 浓度，确定 ＲNA 的纯度 ·3550·
及浓度，A260 / A280 在 1. 8 ～ 2. 0。按试剂盒说明进行 PCＲ 逆转录后，荧光定量 PCＲ 仪进行扩增。以管家 基因 GAPDH 为内参基因，设计引物如 下： Survivin 上游引物 5'-CTACCGAGAACGAGCCTGATT-3'，下游 引物 5'-AGCCTTCCAATTCCTTAAAGCAG-3'，扩增产 物长 度 60 bp； VEGF 上 游 引 物 5'-TTTGGCAAATACAACCCTTCAGA-3'，下游引物 5'-GCAGAAGATACTGTCACCACC-3'，扩增产物长度 133 bp； EGFＲ 上游引 物 5'-ATGAAAACACCTATGCCTTAGCC-3'，下 游 引 物 5'-TAAGTTCCGCATGGGCAGTTC-3'，扩 增 产 物 长 度 83 bp； GAPDH 上 游 引 物 5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，下 游 引 物 5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'，扩增产物长度 123 bp。反应条件： 95 ℃ 3 min，1 个循环进行预变性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，循环 40 次。熔解曲线分析： 95 ℃ 15 s，20 ℃ · s － 1 ； 60 ℃ 15 s，20 ℃ ·s － 1 ； 95 ℃ 15 s，0. 1 ℃ ·s － 1 。 荧光定量结果采用 2 － ΔΔCt 方法分析，统计相对表达 量 ＲQ（ relative quantification） 值。 2. 5 Western blot 检测蛋白表达 取液氮保存的肿 瘤组织，生理盐水冲洗，切取重约 20 mg 小块，加入 含有蛋白酶抑制剂和磷酸化蛋白酶抑制剂的裂解 液，碎冰上高速机械匀浆器 12 000 r·min － 1 破碎组 织，提 取 蛋 白。BCA 法 测 定 蛋 白 浓 度，等 量 上 样， 10% SDS-PAGE 电泳，转至 PVDF 膜，5% 脱 脂 奶 粉 室温封闭 1 h，一抗（ 1 ∶ 1 000 ） 4 ℃ 摇床孵育过夜， TBST 洗膜 10 min × 3 次，二抗（ 1 ∶ 3 000） 室温摇床 孵育 1 h，TBST 洗膜 10 min × 3 次，ECL 显色后化学 发光成像系统成像。以 Quatity one 图像分析软件进 行积分吸光度值分析。 2. 6 统计学方法 用 SPSS 17. 0 统计软件进行分 析处理。计量资料数据用 x珋± s 表示，各组间差别选 用单因素方差分析，P ＜ 0. 05 为有显著性差异，P ＜ 0. 01 为有非常显著性差异。 3 结果 3. 1 裸鼠 A549 皮下移植瘤模型的建立 接种后 4 ～ 5 d，可见接种部位处皮下小结节，质韧，游标卡 尺测量结节大小相近，最长径约 3 ～ 5 mm，最短径约 2 ～ 4 mm。之后每日观察，结节缓慢增大，至接种第 10 天，最长径约 4 ～ 6 mm，最短径约 3 ～ 5 mm。48 只裸鼠全部成瘤，瘤体大小相近，成瘤率 100% 。 3. 2 荷瘤裸鼠一般生长状况 接种后 24 h 开始灌 胃，灌胃 7 周后结束实验，至实验结束时各组荷瘤裸