固相萃取结合GC_O_MS分析威代尔冰葡萄酒中的香气活性化合物_马玥

摘 要 以威代尔冰葡萄酒为研究对象，利用固相萃取法（ SPE） 提取冰葡萄酒中香气化合物，通过气相色谱-闻 香法（ GC-O） 结合气相色谱质谱（ GC-MS） 对香气化合物进行了分析。结果： 从同一年份不同等级的威代尔冰葡 萄酒中共检测出 65 种对冰酒香气有贡献的化合物，其中酯类、醇类、萜烯类、硫化物、呋喃酮类及内酯类是重要 的香气物质，主要表现为水果味，植物清香，花香，烘焙类香气及甜香。在所有已知的香气化合物中，异丁酸乙 酯、2-甲基丁酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、异戊醇、2-庚醇、1-庚醇、顺式-玫瑰醚、3-甲硫基丙醛、脱氢芳樟醇、β-大 马酮及菠萝酮对冰酒的香气贡献较大。这几种香气化合物在 3 个等级的冰酒中均能检测到，但香气强度存在一 定差异，表明酿造工艺可对冰酒的香气轮廓产生一定影响。 关键词 冰葡萄酒； 威代尔； 气相色谱-闻香法（ GC-O） ； 气相色谱质谱（ GC-MS） ； 固相萃取； 香气化合物
冰葡萄酒（ icewine） 又被称作冰酒，是以自然结 冰的葡萄为原料，采用特殊酿造工艺酿成的一种甜型 葡萄酒［1 － 2］，酸甜平衡，香气浓郁，呈现出蜂蜜、桃子、 焦糖、杏等香气特征［3 － 4］，其独特的风味受到消费者 的喜爱。
葡萄酒的风味在很大程度上取决于葡萄酒中的 香气成分，葡萄酒香气也是葡萄酒品质中重要的评价 指标。目前对冰酒的香气研究主要集中在对不同国 家、地域及不同葡萄品种的感官评价及挥发性成分的 检测上。加拿大及德国是主要的冰酒生产国，其中加 拿大冰酒具有水果及花香味，而德国冰酒则具有明显 的坚果香［4 － 5］。在冰葡萄酒中已检测到 360 余种挥 发性成分，其中主要包括酯类、醇类、酸类、醛酮类、萜 烯类、硫 化 物、呋 喃 类、内 酯 类 及 芳 香 族 化 合 物［6］。 每一类甚至每一种化合物对于葡萄酒香气贡献都不 相同，在这些化合物中，目前仅发现几十种化合物对 冰酒香气有重要贡献，其在不同的冰酒中也具有不同 的表现［3］。目前我国冰酒的香气研究则主要集中在 挥发性化合物检测上。王玉峰等采用溶剂萃取法在 赤霞珠冰葡萄酒中获得了 38 种挥发性成分，其中，乙
GC-O 分析： AEDA 法。冰酒香气萃取样品用二 氯甲烷按 1∶ 2比例等比稀释，通过 GC-O 在色谱柱上 分析样品，直到无法嗅辨到香气化合物。每种物质的 稀释因子值为无法感知到该种香气的最高稀释度。 每种样品由 2 名经过半年以上闻香培训的闻香员进 行嗅辨分析，每个样品的每个稀释度进样 3 次。3 次 中出现 2 次以上则保留该稀释因子数值。香气化合 物通过 使 用 DB-FFAP 及 HP-5MS 两 种 色 谱 柱 来 定 性。
极性色谱柱为 DB-FFAP （ 60 m × 0. 25 mm i. d. × 0. 25 μm，美国 Agilent 公司） 。柱温采用程序升温， 初温 50 ℃保持 2 min，以 6 ℃ / min 速率升温至 230 ℃并 保持 15 min； 进样口温度为 250 ℃ ； 不分流进样，进样 量 1μL； 载气为氦气，流速 2mL / min。［0］
非极性色谱柱为 HP-5MS（ 30 m × 0. 25 mm i. d. × 0. 25 μm，美国 Agilent 公司） 。柱温采用程序升 温，初温 50 ℃ 保持 2 min，以 5 ℃ / min 速率升温至 240 ℃ 并保持 15 min； 进样口温度为 250 ℃ ； 不分流 进样，进样量 1μL； 载气为氦气，流速 2mL / min。［0］
描述词
苹果 苹果 菠萝 苹果 甜瓜 苹果 菠萝 香蕉 麝香葡萄 果皮 坚果 荔枝 花香
溶剂 醇香 指甲油 蘑菇 松子 松柏 松柏 蘑菇 松子 蘑菇 烤肉 青草 雪松
DOI： 10． 13995 / j． cnki． 11 － 1802 / ts． 201504029
分析与检测
固相萃取结合 GC-O / MS 分析威代尔冰葡萄酒中的 香气活性化合物*
马玥1 ，唐柯1 ，徐岩1 ，李记明1，2 ，于英2 ，李兰晓2
1（ 工业生物技术教育部重点实验室，江南大学生物工程学院酿酒微生物与酶技术研究室，江苏 无锡，214122） 2（ 烟台张裕葡萄酿酒股份有限公司，山东 烟台，264000）
10. 21 10. 21 12. 38 14. 98 18. 78 19. 79
表 1 威代尔冰酒香气化合物 AEDA 闻香结果
Table 1 Important aroma compounds in Vidal icewine detected by GC-O / MS
化合物b
酯类 乙酸乙酯# 丙酸乙酯# 异丁酸乙酯# 乙酸异丁酯# 丁酸乙酯# 2-甲基丁酸乙酯# 异戊酸乙酯# 乙酸异戊酯 戊酸乙酯 己酸乙酯 庚酸乙酯 辛酸乙酯 十六酸乙酯 醇类 丙醇# 异丁醇 异戊醇 2-庚醇 己醇 反式-3-己烯-1-醇 顺式-3-己烯-1-醇 2-辛醇 3-辛醇 1-辛烯-3-醇 1-庚醇 2-乙基己醇 3-庚烯醇* 萜烯类 1，4-桉叶素* 松油烯 γ-松油烯 顺式-玫瑰醚 反式-里那醚* 4-萜烯醇
酯类化合物是发酵类饮品中重要的香气化合物，
RTa
6. 34 6. 89 7. 12 7. 59 8. 12 8. 42 8. 50 10. 04 10. 45 12. 12 14. 16 15. 70 30. 90
6. 89 9. 32 11. 32 13. 85 14. 42 15. 28 15. 38 15. 78 15. 88 16. 40 16. 68 17. 80 18. 26
酸乙酯、2-羟基丙酸乙酯、3-甲基丁醇、苯乙醇、2，3-丁 二醇等 含 量 较 高［7］。李 艳 霞 等 采 用 固 相 微 萃 取 技 术，在威代尔冰酒中定性到 59 种挥发性成分［1］。王 蓓等采用搅拌棒吸附萃取了威代尔冰酒中的挥发性 成分，定性得到 108 种挥发性化合物［8］。
由于不同化合物的阈值不同，高含量的化合物其 感官贡献并不一定高，有些低阈值化合物在仪器上也 无法检测到。采用气相色谱-闻香法（ GC-O） 结合气 相色谱质谱法（ GC-MS） 分析样品中风味化合物可以 用于寻找对样品香气贡献较高的化合物。GC-O 分 析中常用到时间强度法、稀释分析法与频次法，又以 稀释分析法中的 AEDA （ aroma extraction dilution analysis） 最为常见［9］。辽宁桓仁是中国重要的冰酒产 区，所生产的威代尔冰酒具有怡人的香气，但是其重 要香气成分仍不明确，因此探究形成冰酒感官特性的 主要化合物并找出它们对于酒感官特性的贡献对于 冰酒的品质控制有重要意义。本研究以同一年份不 同等级的 威 代 尔 冰 酒 为 研 究 对 象，采 用 固 相 萃 取 法 （ SPE） 对香气进行富集，在极性与非极性柱上通过 GC-O 结合 GC-MS 分析，来确定威代尔冰酒中重要的 香气成分，为指导冰酒的酿造及品质控制提供理论依 据及支撑。
图 1 黑钻级冰酒挥发性成分极性柱 GC-MS 总离子流色谱图
Fig． 1 GC-MS total ion chromatogram of volatile components of Vidal icewine （ Black） separated by
polar column
图 2 蓝钻级冰酒挥发性成分极性柱 GC-MS 总离子流色谱图
Gerstel ODP2 闻香装置，德国 Gerstel 公司； 气相 色谱质谱联用仪 GC 6890N-MSD 5975，美国 Agilent 公司； 萃取固相小柱为 LiChrolut EN （ 0. 5 g 填料） ， Merck 公司。 1. 3 实验方法 1. 3. 1 固相萃取方法
固相萃取柱润洗活化后，以 1 mL / min 的速率上 样，样品体积为 60 mL。样品吸附结束后，用 20 mL 超纯水洗去柱子上可能残存的糖、色素等小分子极性 化合物，用 10 mL 二氯甲烷洗脱柱上吸附的香气化合 物。用氮气将萃取有机相浓缩至 250 μL，进行 GC-O 及 GC-MS 分析。 1. 3. 2 分析条件
Fig． 2 GC-MS total ion chromatogram of volatile components of Vidal icewine （ Blue） separated by
polar column
由表 1 可以发现，同一年份 3 种等级的威代尔 冰酒在闻香获得的香气化合物的种类上有一定差别， 但最重要的香气化合物（ 至少在一种酒中，其稀释因
第一作者： 硕士研究生（ 徐岩教授及李记明研究员为通讯作者， E-mail 分别为： yxu@ jiangnan. edu. cn 和 7948907@ qq． com） 。 * 中央高校基本科研业务费专项资金资助（ JUSRP1002） ； 山东省 泰山学者计划项目 收稿日期： 2014 － 12 － 05，改回日期： 2015 － 01 － 12
质谱条件： 电子轰击 （ EI） 离子源； 电子能量 70 eV； 离子源温度 230 ℃ ； 质量扫描范围 m / z 35 ～ 500。 1. 3. 3 定性方法
香气 活 性 成 分 的 定 性 通 过 与 NIST 05 质 谱 库
（ Agilent Technologies Inc. ） 中标准谱图匹配、与文献 报道的保留指数比对、香气化合物香气特征及标准品 来确定。保留指数根据改进的 Kovats 法计算得到， 在待测酒样中加入 C5-C30 烷烃的混标，进 GC-MS 分 离，通过烷烃的保留时间来计算未知化合物的 RI。
polar column
子在 81 以上） 基本相同，只是在其香气强度上有一 定差异，说明不同等级冰酒主要香气成分构成上具有 一致性，同时酿造工艺又对冰酒的香气轮廓产生一定 影响，也构成了不同等级冰酒所特有的香气特征。这 些重要的香气化合物主要为酯类、醇类、萜烯类、硫化 物及呋喃酮类化合物，包括异丁酸乙酯、2-甲基丁酸 乙酯、庚酸 乙 酯、辛 酸 乙 酯、异 戊 醇、2 -庚 醇、1 -庚 醇、 顺式-玫瑰醚、3-甲硫基丙醛、脱氢芳樟醇、β-大马酮、 菠萝酮及 3 种未知香气化合物。 2. 2 不同活性香气化合物分析 2. 2. 1 酯类