实时荧光定量PCR技术原理 ppt课件
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实时荧光定量PCR实验原理与技术 ppt课件
非特异的双链如引物二聚体或非特异性扩增产物等结合。
要避免这些非特异荧光信号对定量精确性的影响，可以利
用热循环仪内设定的熔解反应程序对扩增产物进行熔解曲 线分析。
熔解曲线峰为 单一峰形，未 见其他峰值， 并且峰的形状 也比较锐利。 扩增产物特异 性好。
qRT-PCR技术实验操作（优化）
有研究建议在每一个循环中 PCR 延伸后增加一步，即
水解探针法
分子信标
Scorpion引物/探针 复合探针
qRT-PCR技术影响因素
① 样品RNA 的完整性 ② RNA 样品中的基因组 DNA污染
③ 特异性良好的引物
④ PCR反应体系的优化 ⑤ 反转录所得 cDNA 的量必须精确地等于相应的
mRNA的量 ⑥ 可靠的内标基因：
TEF-2
热循环参数的设置 上机前样本的制备 检测程序的设置 运行检测程序果分析 扩增曲线 结果的显示与输出
qRT-PCR技术实验操作
qRT-PCR技术实验操作（优化）
qRT-PCR技术实验操作（优化）
qRT-PCR技术实验操作（优化）
假阳性：荧光染料能和任何 ds DNA 结合，因此它也能与
qRT-PCR技术实验操作（优化）
1、同管扩增：减少操作误差，引物间影响大
2、异管扩增：扩增结果真实可信，具有操作误差
总RNA提取； 2. 模板cDNA制作； 3. 半定量PT-PCR：
1.
1. 引物设计及选择：a)上下游引物设计在跨内含子的
2.
3. 4. 5.
一个外显子的5’端和下一个外显子的3’端。b)设计在 两个离得远的外显子上。 引物的长度：严格配对17-19bp。最后一个碱基为C或 G；GC含量为40％-60％之间。如此，管家基因与目 的基因的退火温度基本一致。长度一般设计为 350bp-600bp之间 内参的选择 同管扩增或异管扩增的选择 PCR循环数的选择
实时荧光定量PCR的原理、操作及其应用PPT课件
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它利用荧光染料或荧光探针标记特异性引物，在PCR反应过 程中，随着DNA或RNA的扩增，荧光信号被逐渐释放，通过 检测荧光信号的强度，可以实时监测DNA或RNA的扩增量。
实时荧光定量PCR的原理概述
实时荧光定量PCR的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，这些荧光物质 与DNA或RNA结合后，在特定波长光的激发下产生荧光信号。
环介导等温扩增技术
在恒温条件下进行核酸扩增，具有快速、特异性强和灵敏度高等优 点。
纳米材料与PCR的结合
利用纳米材料的特性，提高PCR的检测效率和灵敏度。
提高检测灵敏度与特异性
信号放大技术
通过使用信号放大系统，提高检测信号，从而提高检测灵 敏度。
特异性引物和探针的设计
针对目标基因设计特异性引物和探针，降低非特异性扩增 和交叉污染的风险。
选择合适的内参基因
选择稳定的内参基因
01
内参基因应具有稳定的表达水平，不受实验处理的影响。
验证内参基因的稳定性
02
通过实时荧光定量PCR技术，对候选内参基因进行稳定性评估。
使用多个内参基因参基因进行数据校正。
数据解读与报告
标准化处理
对原始数据进行标准化处理，消 除不同样本间的差异。
样本处理
对样本进行破碎、离心、 提取核酸等处理，以获得 待测的DNA或RNA。
浓度和纯度测定
使用紫外分光光度计等设 备测定核酸浓度和纯度， 确保符合实验要求。
引物设计与选择
引物设计
根据目标基因序列，利用 引物设计软件进行引物设 计。
引物筛选
根据实验需求，筛选出特 异性好、扩增效率高的引 物。
实时荧光定量PCR (realtime PCR) 技术原理(Roche公司 PPT)
实时荧光定量PCR (realtime PCR) 技术原理(Roche公司PPT)Real Real--time time PCRPCR Principle 罗氏诊断产品罗氏诊断产品((上海上海广州办事处应用科学部实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR PCR技术原理技术原理普通 PCR 技术原理基于嵌入式染料的荧光定量 PCR 原理基于探针的荧光定量 PCR 原理荧光定量 PCR 技术平台的功能开发实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR PCR技术原理技术原理普通 PCR 技术原理基于嵌入式染料的荧光定量 PCR 原理基于探针的荧光定量 PCR 原理荧光定量 PCR 技术平台的功能开发PCR 原理信号放大原理PCR 产物的电泳检测和分析SYBR Green IHybProbe TaqMan Real-time PCR原理实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR PCR技术原理技术原理普通 PCR 技术原理基于嵌入式染料的荧光定量 PCR 原理基于探针的荧光定量 PCR 原理荧光定量 PCR 技术平台的功能开发Green ICp(Crossingpoint or Ct (Cyclerthreshold实时荧光定量 PCR 的原理公式N =N 02n =N0(1+En logN= log(1+En +logN0 logN 0= -nlog(1+E+logN Cp =n= -logN 0/log(1+E +logN/log(1+E(Y=kX+b结论:Cp 值与模板起始浓度的负对数成线性关系N :扩增产物量 ;N 0:启始模板量 ; N :循环数 ; E :扩增效率(0 ≤E ≤1实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR PCR技术原理技术原理普通 PCR 技术原理基于嵌入式染料的荧光定量 PCR 原理基于探针的荧光定量 PCR 原理荧光定量 PCR 技术平台的功能开发FRET 现象 (Fluorescence resonanceenergy transferTaqMan probeTaqMan probe principle Roche Applied Science 16杂交探针HybProbe－罗氏专利性技术－杂交探针 for sequence specific detection of DNA Fluorescein LC Red Denaturation Annealing Elongation End of Elongation Roche Applied Science 17实时荧光PCR检测结果 Roche Applied Science 18New Probe Format : SimpleProbe Format -高效低成本的新型探针 Denaturation phase: SimpleProbe free in solution; emission of reporter dye is quenched R Q R = Reporter (Fluorescein Q = Quencher 5‘ 3‘-p Annealing phase: Fluorescence from reporter dye increases when probe is annealed to it‘s complementary target R primer 3‘ Q 3‘-p 5‘ 5‘ Roche Applied Science 19实时荧光PCR技术的优势实时荧光PCR技术的优势 PCR 特异性强：引物和探针“双”，避免检测的假阳特异性强性。
最新实时荧光定量PCR介绍PPT课件
Probe设计要求高 Probe合成费用高
常用于mRNA表达量分析等
实时荧光定量PCR介绍
常用于SNP解析，病毒、病源菌检测
3/12/2024 • 11
主要内容
2
Real Time PCR实验方法
反转录反应
Real Time PCR反应
实时荧光定量PCR介绍
3/12/2024 • 12
RT Primer的选择
体外转录RNA标准品构建流程
目的基因
RT
目的基因
Total RNA cDNA
T7 Promoter
PCR
目的基因
TTTT•••T
PCR产物
T7 RNA polymerase
AAAA•••A
体外转录RNA
AAAA•••A
RNA纯化后，测OD定量。将RNA梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。
• Random Primer • Oligo dT Primer • Gene Specific Primer
Random 6mer Primer Gene Specific Primer
Oligo dT Primer
PCR F-Primer PCR R-Primer
实时荧光定量PCR介绍
3/12/2024 • 13
进行相对表达量分析。
实时荧光定量PCR介绍
3/12/2024 • 32
相对定量解析方法
管家基因
维持细胞基本代谢活动所必须的基因, 如：GAPDH、β-actin等。
筛选方法
• 根据文献提供 • 通过具体实验筛选
实时荧光定量PCR介绍
3/12/2024 • 33
主要内容
-实时荧光定量PCRppt课件
标准品的稀释 Real-time PCR 数据的分析 Real-time PCR产物的电泳
荧光定量 PCR 所使用的荧光化学可分为两种：荧光 探针和荧光染料。
荧光定量 PCR 最常用的方法是 DNA 结合染料 SYBR GreenⅠ的非特异性方法和 Taqman 水解探针 的特异性方法，
新疆医科大学第一附属医院
The First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University
解曲线来分析产物的均一性有助于分析由 SYBR Green I 得到定量结果。另外， 因为 SYBR Green I 不能区分不同扩增子发出的荧光而导致它不能用于多重反
应。
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-实时荧光定量 PCR
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（一）实时荧光定量PCR原理 和应用
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PCR 定量PCR 荧光化学监测物质 实时荧光定量PCR应用
ＰＣＲ技术
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实时荧光定量PCR(qPCR,RT-PCR)的原理及应用ppt课件
内标（Endogenous Control） 通常是18S、28S、β-actin、GAPDH基因等看家基因
在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定， 受环境因素影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数 量
15
RT-PCR技术的数据分析
PCR分四个阶段
16
RT-PCR技术的数据分析如何定量？-ΔΔCt
实时荧光定量PCR技术 的原理及应用
（Real Time Quantitative PCR）
2013-11-26
1
实时荧光定量PCR目录 Contents
一、实时荧光定量PCR的定义 二、RT-PCR技术的原理及试验流程 三、RT-PCR技术的数据分析
四、RT-PCR技术的应用
2
实时荧光定量PCR的定义
RT-PCR技术的数据分析
21
RT-PCR技术的数据分析
相对定量分析方法 -ΔΔCt
前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近100％ 且偏差在 5％以内 1、用目标基因的CT值减内参基因的CT值：
ΔCT（test)= CT （target, test) - CT （ref, test) ΔCT（control)= CT （target, control) - CT （ref, control)
2、用试验样本的ΔCT值减校准样本的ΔCT值：
ΔΔCT= ΔCT（test/control) - ΔCT（calibrator)
3、计算表达水平比率： 相对表达量RQ= 2 –ΔΔCT
22
RT-PCR技术的数据分析
SYBR Green 熔解曲线分析
23
RT-PCR技术的应用
• 临床疾病诊断：各型肝炎、艾滋病、禽流感等传染病诊断 和疗效评价；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断； 遗传基因检测实现遗传病诊断。
在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定， 受环境因素影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数 量
15
RT-PCR技术的数据分析
PCR分四个阶段
16
RT-PCR技术的数据分析如何定量？-ΔΔCt
实时荧光定量PCR技术 的原理及应用
（Real Time Quantitative PCR）
2013-11-26
1
实时荧光定量PCR目录 Contents
一、实时荧光定量PCR的定义 二、RT-PCR技术的原理及试验流程 三、RT-PCR技术的数据分析
四、RT-PCR技术的应用
2
实时荧光定量PCR的定义
RT-PCR技术的数据分析
21
RT-PCR技术的数据分析
相对定量分析方法 -ΔΔCt
前提:目标序列和内参序列的扩增效率接近100％ 且偏差在 5％以内 1、用目标基因的CT值减内参基因的CT值：
ΔCT（test)= CT （target, test) - CT （ref, test) ΔCT（control)= CT （target, control) - CT （ref, control)
2、用试验样本的ΔCT值减校准样本的ΔCT值：
ΔΔCT= ΔCT（test/control) - ΔCT（calibrator)
3、计算表达水平比率： 相对表达量RQ= 2 –ΔΔCT
22
RT-PCR技术的数据分析
SYBR Green 熔解曲线分析
23
RT-PCR技术的应用
• 临床疾病诊断：各型肝炎、艾滋病、禽流感等传染病诊断 和疗效评价；肿瘤标志物及瘤基因检测实现肿瘤病诊断； 遗传基因检测实现遗传病诊断。
实时荧光定量PCR技术原理ppt课件
样本处理与RNA提取
外界刺激 –10min – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 –2min– 裂解、固定细胞 TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 阴性对照
逆转录
逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？
传统PCR检测
Real-time qPCR
激发光
发射光
-- 在PCR反应体系中加入荧光基团。 -- 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 -- 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。
荧光基团
扩增曲线（primary curve）
扩增曲线： 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。 纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）
lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数 起始拷贝数越多，Ct值越小。
Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线
LogDNA vs. Ct -- 标准曲线
.
未知
104
103
106
105
102
10
标准曲线 (standard curve)
标准曲线分析 -- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释
主要内容
Real-time qPCR的定量原理
2
Real-time qPCR的检测方法
3
Real-time qPCR的基本概念
外界刺激 –10min – 可检测的表达改变 样品离开定义环境 –2min– 裂解、固定细胞 TRIzon（酚、异硫氰酸胍） 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸胍， SDS） 液氮 RNA保存液 小心DNA污染！ 使用DNase 阴性对照
逆转录
逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰：mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？
传统PCR检测
Real-time qPCR
激发光
发射光
-- 在PCR反应体系中加入荧光基团。 -- 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 -- 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。
荧光基团
扩增曲线（primary curve）
扩增曲线： 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。 纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）
lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数 起始拷贝数越多，Ct值越小。
Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线
LogDNA vs. Ct -- 标准曲线
.
未知
104
103
106
105
102
10
标准曲线 (standard curve)
标准曲线分析 -- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释
主要内容
Real-time qPCR的定量原理
2
Real-time qPCR的检测方法
3
Real-time qPCR的基本概念
实时荧光定量PCR技术全面分析ppt课件
定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR 扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终 精确的对起始模板的定量分析
4
常规vs实时
优缺点比较 定量PCR
常规PCR
灵敏度高 高精确度 安全省时
只能进行半定量或定性 分析 不安全易污染 费时费力
5
定量PCR三个基本概念
扩增曲线
背景期
指数增 长期
相关系数(R2) ---大于0.99
平行管重复性 ---SD小于0.167
58
标准曲线差
可能的影响因素
稀释精度 加样精度 反应体系的优化 模板降解
59
定量PCR的新 运用
60
等位基因分型（SNP研究) MicroRNA分析 基因拷贝数（CNV)分析 蛋白质分析
61
62
相对定量的问题 样品材料不均一造成的差别
内标基因 内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因 （内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响） 对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的 误差
19
SYBR Green I法进行相对定量的问
题
问题：
SYBR Green I可以与非特异性双链结合 信号 结果不准确
理想的PCR反应： 非X理n=X想0×的2PnCR反应：
Xn=X0(1+Ex)n
方程式两边同时取对数得:
log Xn=log (X0 (1+Ex)n)
整理方程式得:
n：扩增反应的循环次数
Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn
结合双链DNA分子小沟 延伸结束，形成双链DNA，SYBR Green结合到双螺旋小沟中，当受到适 合光源激发，发射出荧光，反映产物 浓度
4
常规vs实时
优缺点比较 定量PCR
常规PCR
灵敏度高 高精确度 安全省时
只能进行半定量或定性 分析 不安全易污染 费时费力
5
定量PCR三个基本概念
扩增曲线
背景期
指数增 长期
相关系数(R2) ---大于0.99
平行管重复性 ---SD小于0.167
58
标准曲线差
可能的影响因素
稀释精度 加样精度 反应体系的优化 模板降解
59
定量PCR的新 运用
60
等位基因分型（SNP研究) MicroRNA分析 基因拷贝数（CNV)分析 蛋白质分析
61
62
相对定量的问题 样品材料不均一造成的差别
内标基因 内标通常是b-actin、GAPDH、18SrRNA等看家基因 （内标基因的表达要相对恒定，表达不受处理因素影响） 对目的基因进行均一化：去除样本间加样量不同带来的 误差
19
SYBR Green I法进行相对定量的问
题
问题：
SYBR Green I可以与非特异性双链结合 信号 结果不准确
理想的PCR反应： 非X理n=X想0×的2PnCR反应：
Xn=X0(1+Ex)n
方程式两边同时取对数得:
log Xn=log (X0 (1+Ex)n)
整理方程式得:
n：扩增反应的循环次数
Xn：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
log X0= (- log(1+Ex) )×n+ log Xn
结合双链DNA分子小沟 延伸结束，形成双链DNA，SYBR Green结合到双螺旋小沟中，当受到适 合光源激发，发射出荧光，反映产物 浓度
实时荧光定量PCR原理与分析方法46页PPT
25、学习是劳动，是充满思想的劳动。——乌申斯基
谢谢！
33、如果惧怕前面跌宕的山岩，生命 就永远 只能是 死水一 潭。 34、当你眼泪忍不住要流出来的时候 ，睁大 眼睛， 千万别 眨眼!你会看到 世界由 清晰变 模糊的 全过程 ，心会 在你泪 水落下 的那一 刻变得 清澈明 晰。盐 。注定 要融化 的，也 许是用 眼泪的 方式。
35、不要以为自己成功一次就可以了 也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
实时荧光定量PCR原理与分 析方法
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
谢谢！
33、如果惧怕前面跌宕的山岩，生命 就永远 只能是 死水一 潭。 34、当你眼泪忍不住要流出来的时候 ，睁大 眼睛， 千万别 眨眼!你会看到 世界由 清晰变 模糊的 全过程 ，心会 在你泪 水落下 的那一 刻变得 清澈明 晰。盐 。注定 要融化 的，也 许是用 眼泪的 方式。
35、不要以为自己成功一次就可以了 也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
实时荧光定量PCR原理与分 析方法
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
21、要知道对好事的称颂过于夸大，也会招来人们的反感轻蔑和嫉妒。——培根 22、业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。——韩愈
23、一切节省，归根到底都归结为时间的节省。——马克思 24、意志命运往往背道而驰，决心到最后会全部推倒。——莎士比亚
实时荧光定量PCR技术PPT课件(模板)
大多数荧光定模量板PCRD实N验的AC量T值越在1多8-30，之间荧。 光达到 荧rea光lm定阈a量steP值rCmRix的参数循解析环-- C数T值越少，即Ct值越小。
-引物和扩增产物二级结构的预测
乙1v肝标病准人品血ii+液9Lv中稀oHg释B模缓V的冲板绝液对，起定得量标始准浓品iii度与Ct值呈线 性关系。 已知在50%的乳腺肿瘤样本中, ERBB2表达异常, 因此可以作为一个检测标准
Sample
2 5
绝对定量分析几要素
✓ 一个目的基因 ——即需要确定其量值的核酸序列。 ✓ 一组标准样本 ——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、
PCR产物、基因组DNA等。 ✓ 重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计
显著性。 ✓ 标记方法的选择——SYBR Green法或探针法均可。 ✓ 实验结果显示——扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不需要）。
SYBR Green I 染料法——优缺点
优点
缺点
使用方便，不必设计复杂 探针
具有价格优势
无模板特异性 对引物特异性要求较高 不能进行多重定量 灵敏度相对较低
Taqman探针法——原理
5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等
3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
乙肝病人血液中HBV的绝对定量
PBMioeTr1－-FLAinMegdeenteecstieornie- sERBB2 双SY标BR准法曲实线验法流—程—及结注果意分事析项 样延本伸的 时采间集：、产处物理长和度制决备定；
-引物和扩增产物二级结构的预测
乙1v肝标病准人品血ii+液9Lv中稀oHg释B模缓V的冲板绝液对，起定得量标始准浓品iii度与Ct值呈线 性关系。 已知在50%的乳腺肿瘤样本中, ERBB2表达异常, 因此可以作为一个检测标准
Sample
2 5
绝对定量分析几要素
✓ 一个目的基因 ——即需要确定其量值的核酸序列。 ✓ 一组标准样本 ——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、
PCR产物、基因组DNA等。 ✓ 重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计
显著性。 ✓ 标记方法的选择——SYBR Green法或探针法均可。 ✓ 实验结果显示——扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不需要）。
SYBR Green I 染料法——优缺点
优点
缺点
使用方便，不必设计复杂 探针
具有价格优势
无模板特异性 对引物特异性要求较高 不能进行多重定量 灵敏度相对较低
Taqman探针法——原理
5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等
3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
乙肝病人血液中HBV的绝对定量
PBMioeTr1－-FLAinMegdeenteecstieornie- sERBB2 双SY标BR准法曲实线验法流—程—及结注果意分事析项 样延本伸的 时采间集：、产处物理长和度制决备定；
相关主题
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实时荧光定量PCR技术 原理、应用及实践
Real tim(ReealQtimueaQnutainttaitatitivveePPCRC)R
1
ppt课件
主要内容
1
Real-time qPCR的基本概念
2
Real-time qPCR的定量原理
3
Real-time qPCR的检测方法
4
Real-time qPCR的解析方法
▪Ct值则极具重现性
பைடு நூலகம்
10
ppt课件
Ct值可以确定初始模板量？
Rn=RB+ X0 (1+E)N * RS 第n个循环的总信号
=本底信号 + 起始DNA数目 * PCR扩增效率 * 单位信号强度
当循环次数n=Ct时 RCt=RB+ X0 (1+E)Ct * RS 两边同时取对数得: lg(RCt-RB)=lgX0+Ctlg(1+E)+lgRS Ct=-lgX0/lg(1+E)+ lg(RCt-RB)-lgRS/lg(1+E)
Ct=-klgX0+b
lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数
起始拷贝数越多，Ct值越小。
11
ppt课件
标准曲线 (standard curve)
10 6 105
104
103
102
未知
.
10
Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线
LogDNA vs. Ct -- 标准曲线
纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）
7
ppt课件
荧光阈值（threshold）
基线(baseline)：一般以PCR反应前15个循环的荧光信号作为本底信号 荧光阀值(threshold)：扩增曲线上人为设定的一个值 -- 缺省设置：PCR反应前3-15个循环荧光本底信号标准偏差的10倍 -- 手动设置：大于样本的荧光背景值
❖ 传统PCR--终点检测：
❖ Real time PCR--起点检测：
-- 终点产物量经过PCR放大的DNA量 -- 起点量是样本中起始的DNA量
-- “生成了500，0000，0000个拷贝” -- “加入了500个拷贝”
-- 不恒定，误差大
-- 具有重现性，误差小
5
ppt课件
Real-time qPCR
探针标记： ✓水解探针： TaqMan ✓非水解探针：Molecular beacon
14
ppt课件
SYBR Green I 工作原理
SYBR Green I 是一种与双链DNA 小沟结合的荧光染料。
SYBR Green I只与双链DNA结合才 能发出荧光。
荧光信号与双链DNA分子数成正 比，随着扩增产物增加而增加。
荧光基团 激发光
发射光
-- 在PCR反应体系中加入荧光基团。 -- 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 -- 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。
6
ppt课件
扩增曲线（primary curve）
线性图
对数图
扩增曲线：
随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。 每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩 增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。
8
ppt课件
Ct 值(Cycle Threshold)
Ct值：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到
设定的阈值时，荧光值所对应的PCR循环次数。
起始模板量 基线 阈值 Ct值
9
ppt课件
Ct 值(Cycle Threshold)
Ct值的特点：
▪相同模板进行96次扩增，平台期DNA拷贝数波动 很大，但Ct值相对固定；
标准曲线分析 -- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释
12
ppt课件
标准曲线分析
y = -ax+b 测定荧光定量PCR反应的有效性 -- 线性的标准曲线：相关系数R2 -- 扩增效率：
扩增效率(E)=10-1/斜率-1
13
ppt课件
荧光定量PCR检测方法
染料标记： ✓ SYBR Green I
确认PCR反应产物的特异性
原始图谱
对数图谱
将温度对荧光强度的变化求导。(-dI/dT)
18
ppt课件
融解曲线分析
-- 非特异性产物 -- 引物二聚体
19
ppt课件
Taqman 工作原理
RQ
R Reporter Q Quencher
❖ 探针与靶序列配对 （一段序列，两个基团，5’ 报告基团、3’淬灭基团）
优点： ❖ 使用方便，成本低 -- 仅需设计两个引物
❖ 通用性好 -- 对DNA模板没有选择性
缺点：
❖ SYBR Green与所有双链 DNA结合
-- 引物二聚体或错误扩增产 物造成假阳性
-- 只能检测单一模板，无法 进行多重检测
需要在反应结束时，对产物做融解曲线分析。
17
ppt课件
融解曲线 (dissociation curve)
•理想的PCR反应： N=N0*2n
•实际的PCR反应： N=N0* (1+E)n
•N0：初始模板量 •N：第n次循环后的产物量 •n：扩增反应的循环次数 E：扩增效率
S形曲线，具有平台效应
4
ppt课件
传统PCR检测
与普通PCR的对比
同一个样本进行96次重复
传统PCR检测
Real time PCR 检测
❖ 完整的探针，报告基团R发射的荧光被淬灭基团Q淬灭， 没有荧光产生。
❖ 聚合酶的5’外切酶活性 ❖ 报告基团R与淬灭基团Q分离，发射荧光。
荧光信号强度与结合探针的DNA分子成正比。
20
ppt课件
Taqman 工作原理
在退火过程中，探针与靶序列结合
在延伸过程中，探针部分与靶序列分离
探针被Taq酶的5’- 3’ 外切酶活性剪切成片断
2
ppt课件
PCR：基本原理
基本要素： • Template • Primers • DNA polymerase • dNTP, N=A,G,C or T
Denaturation: 94 – 96°C
Annealing: 50 – 65°C
Extension: 70 – 75°C
3
ppt课件
PCR：基本原理
荧光信号强度与反应体系中 所有双链DNA分子成正比。
15
ppt课件
SYBR Green I 工作原理
5’
3’ SG SG
SG
3’
5’ SG
5’
SG
3’
Excitation
SG
SG
3’
SG
5’
Emission
-- 变性时，DNA双链分开，无荧光信号。 -- 延伸结束时，采集荧光信号。
16
ppt课件
SYBR Green I
Real tim(ReealQtimueaQnutainttaitatitivveePPCRC)R
1
ppt课件
主要内容
1
Real-time qPCR的基本概念
2
Real-time qPCR的定量原理
3
Real-time qPCR的检测方法
4
Real-time qPCR的解析方法
▪Ct值则极具重现性
பைடு நூலகம்
10
ppt课件
Ct值可以确定初始模板量？
Rn=RB+ X0 (1+E)N * RS 第n个循环的总信号
=本底信号 + 起始DNA数目 * PCR扩增效率 * 单位信号强度
当循环次数n=Ct时 RCt=RB+ X0 (1+E)Ct * RS 两边同时取对数得: lg(RCt-RB)=lgX0+Ctlg(1+E)+lgRS Ct=-lgX0/lg(1+E)+ lg(RCt-RB)-lgRS/lg(1+E)
Ct=-klgX0+b
lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数
起始拷贝数越多，Ct值越小。
11
ppt课件
标准曲线 (standard curve)
10 6 105
104
103
102
未知
.
10
Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线
LogDNA vs. Ct -- 标准曲线
纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）
7
ppt课件
荧光阈值（threshold）
基线(baseline)：一般以PCR反应前15个循环的荧光信号作为本底信号 荧光阀值(threshold)：扩增曲线上人为设定的一个值 -- 缺省设置：PCR反应前3-15个循环荧光本底信号标准偏差的10倍 -- 手动设置：大于样本的荧光背景值
❖ 传统PCR--终点检测：
❖ Real time PCR--起点检测：
-- 终点产物量经过PCR放大的DNA量 -- 起点量是样本中起始的DNA量
-- “生成了500，0000，0000个拷贝” -- “加入了500个拷贝”
-- 不恒定，误差大
-- 具有重现性，误差小
5
ppt课件
Real-time qPCR
探针标记： ✓水解探针： TaqMan ✓非水解探针：Molecular beacon
14
ppt课件
SYBR Green I 工作原理
SYBR Green I 是一种与双链DNA 小沟结合的荧光染料。
SYBR Green I只与双链DNA结合才 能发出荧光。
荧光信号与双链DNA分子数成正 比，随着扩增产物增加而增加。
荧光基团 激发光
发射光
-- 在PCR反应体系中加入荧光基团。 -- 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 -- 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。
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扩增曲线（primary curve）
线性图
对数图
扩增曲线：
随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。 每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩 增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。
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Ct 值(Cycle Threshold)
Ct值：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到
设定的阈值时，荧光值所对应的PCR循环次数。
起始模板量 基线 阈值 Ct值
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Ct 值(Cycle Threshold)
Ct值的特点：
▪相同模板进行96次扩增，平台期DNA拷贝数波动 很大，但Ct值相对固定；
标准曲线分析 -- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释
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标准曲线分析
y = -ax+b 测定荧光定量PCR反应的有效性 -- 线性的标准曲线：相关系数R2 -- 扩增效率：
扩增效率(E)=10-1/斜率-1
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荧光定量PCR检测方法
染料标记： ✓ SYBR Green I
确认PCR反应产物的特异性
原始图谱
对数图谱
将温度对荧光强度的变化求导。(-dI/dT)
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融解曲线分析
-- 非特异性产物 -- 引物二聚体
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Taqman 工作原理
RQ
R Reporter Q Quencher
❖ 探针与靶序列配对 （一段序列，两个基团，5’ 报告基团、3’淬灭基团）
优点： ❖ 使用方便，成本低 -- 仅需设计两个引物
❖ 通用性好 -- 对DNA模板没有选择性
缺点：
❖ SYBR Green与所有双链 DNA结合
-- 引物二聚体或错误扩增产 物造成假阳性
-- 只能检测单一模板，无法 进行多重检测
需要在反应结束时，对产物做融解曲线分析。
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融解曲线 (dissociation curve)
•理想的PCR反应： N=N0*2n
•实际的PCR反应： N=N0* (1+E)n
•N0：初始模板量 •N：第n次循环后的产物量 •n：扩增反应的循环次数 E：扩增效率
S形曲线，具有平台效应
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传统PCR检测
与普通PCR的对比
同一个样本进行96次重复
传统PCR检测
Real time PCR 检测
❖ 完整的探针，报告基团R发射的荧光被淬灭基团Q淬灭， 没有荧光产生。
❖ 聚合酶的5’外切酶活性 ❖ 报告基团R与淬灭基团Q分离，发射荧光。
荧光信号强度与结合探针的DNA分子成正比。
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Taqman 工作原理
在退火过程中，探针与靶序列结合
在延伸过程中，探针部分与靶序列分离
探针被Taq酶的5’- 3’ 外切酶活性剪切成片断
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ppt课件
PCR：基本原理
基本要素： • Template • Primers • DNA polymerase • dNTP, N=A,G,C or T
Denaturation: 94 – 96°C
Annealing: 50 – 65°C
Extension: 70 – 75°C
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PCR：基本原理
荧光信号强度与反应体系中 所有双链DNA分子成正比。
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SYBR Green I 工作原理
5’
3’ SG SG
SG
3’
5’ SG
5’
SG
3’
Excitation
SG
SG
3’
SG
5’
Emission
-- 变性时，DNA双链分开，无荧光信号。 -- 延伸结束时，采集荧光信号。
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SYBR Green I