用试纸法快速检测β-半乳糖苷酶活性的研究

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一种检测β-半乳糖苷酶的荧光探针及其制备方法和应用

一种检测β-半乳糖苷酶的荧光探针及其制备方法和应用在当今社会，生物技术的发展日新月异，对于酶的检测和应用也变得愈发重要。

其中，β-半乳糖苷酶作为一种重要的生物催化剂，在食品工业、制药工业以及生命科学研究中具有广泛的应用价值。

针对β-半乳糖苷酶的检测方法和荧光探针的研发成为了研究的热点之一。

1. β-半乳糖苷酶的重要性β-半乳糖苷酶是一种在生物体内广泛存在的酶类，主要参与β-半乳糖苷的水解反应。

这种酶不仅在哺乳动物肠道中发挥重要的消化功能，也在微生物发酵过程中具有重要作用。

对β-半乳糖苷酶的检测和应用具有重要的意义。

2. 荧光探针在酶检测中的应用荧光探针是一种可以发出荧光信号的分子，其结构和性质可以受到酶的作用而发生改变，从而产生荧光信号的变化。

在酶的检测中，荧光探针可以作为一种灵敏的探测方法，用于快速、准确地检测酶的活性和浓度。

3. 一种新型检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的制备方法近年来，研究人员针对β-半乳糖苷酶的检测开展了大量的研究工作，提出了一种新型的荧光探针制备方法。

该方法利用了β-半乳糖苷酶对底物的特异性水解作用，通过设计合适的底物结构和荧光团的引入，实现了对β-半乳糖苷酶的高效、特异性的检测。

4. 该荧光探针的应用前景因其灵敏度高、操作简便、成本低等优点，该荧光探针在β-半乳糖苷酶的检测与应用方面具有广阔的应用前景。

不仅可以用于食品工业中对奶制品中β-半乳糖苷酶的检测，也可以在医药领域用于β-半乳糖苷酶相关疾病的诊断和治疗。

结语一种检测β-半乳糖苷酶的荧光探针的研究和开发具有非常重要的意义。

通过该荧光探针，我们可以更准确、快速地检测和应用β-半乳糖苷酶，为相关领域的研究和应用提供更多的可能性和发展空间。

个人观点作为专业的文章写手，我对β-半乳糖苷酶的荧光探针及其制备方法和应用充满信心。

我认为该荧光探针的研究将为相关领域的发展带来新的契机，对于食品工业、制药工业以及生命科学研究都具有重要意义。

β半乳糖苷酶显色原理

β半乳糖苷酶显色原理
β半乳糖苷酶是一类存在于多种生物体中的酶，在食品加工、饲料工业、生物制药等领域有广泛应用。

这里我们主要讨论β半乳糖苷酶在生命科学研究中的应用，特别是与显色原理相关的实验。

首先，我们需要了解什么是β半乳糖苷酶。

β半乳糖苷酶是一
种分解半乳糖苷化合物的酶，具有较强的酶催化活性。

在糖代谢途径中，半乳糖苷化合物被β半乳糖苷酶水解成葡萄糖和半乳糖两种单糖，这种反应在生物体内起到非常重要的作用。

在实验室中，β半乳糖苷酶可用于检测特定物质存在的情况。

这里我们介绍一种β半乳糖苷酶显色原理实验方法。

步骤一：样品制备。

首先，我们需要准备待测物质，包括半乳糖
苷衍生物和β半乳糖苷酶，以及辅助试剂如缓冲液等。

步骤二：反应条件控制。

将一定量的β半乳糖苷酶和样品混合，加入缓冲液并控制反应时间和反应温度。

我们需要注意，反应时间和
反应温度的选择应该考虑待测物质的特性和β半乳糖苷酶酶学性质的实验条件。

步骤三：结果观察。

在反应体系中加入显色剂，观察待测物质是
否能够显色。

一般情况下，加入显色剂后，经过一段时间，会发生显
色反应。

总的来说，β半乳糖苷酶显色原理实验是基于β半乳糖苷酶的酶催化作用，在待测物质中探测特定的半乳糖苷化合物的存在。

通过
这种实验方法，我们可以更为准确地检测待测物质，加深对微生物或
生物材料中代谢物质的认识，从而为生物科学研究提供实验支持。

β-半乳糖苷酶活性测定方法

β-半乳糖苷酶活性测定方法β-半乳糖苷酶活性测定（β-galactosidase assays）1、将过夜培养的菌液按1%接种量到新鲜培养基中培养，待OD600至0.6时取出，放置于冰上；（或可检测不同OD600时，菌的酶活性）2、取50-100μl 菌液至1.5 ml 的离心管中，加370-420μl Z buffer；3、加20 μl 氯仿和10 μl 0.1% SDS，振荡混匀，裂解细胞，放置于冰上30分钟；4、向离心管中加入100 μl 浓度4 mg/ml 的ONPG，混匀后立即置于30℃反应30-60分钟；5、待颜色变黄后，加入250 μl 1 M Na2CO3中止反应，准确记录变色反应的时间；6、取200μl上清，测定420 nm 和550 nm 处的吸光度；7、计算β-半乳糖苷酶酶活力：Miller Units = 1,000×[(OD420－ 1.75×OD550)] / (t×V×OD600)，其中，OD420和OD550----显色后的反应液读数；OD600----用于显色分析的培养液的细菌密度；t ----显色反应时间(单位min)；V ----用于显色分析的培养液体积(单位ml)。

Z buffer (总体积100 ml)：Na2HPO4·12H2O 100mM 3.5814 gNaH2PO4·H2O 40mM 0.624gKCl 10mM 0.07455gMgSO4·7H2O1mM 0.0246gβ-mercaptoethanol 5.4μl / ml 540μl加水到总体积90 ml，待试剂溶解后调pH 至7.0，最后定容到100 ml，4℃储存。

Substrate solution(总体积10ml)----现用现配Na2HPO4·12H2O 60mM 0.215 g NaH2PO4·H2O 40mM 0.0624g ONPG 4mg/ml 0.04g终止液（100ml）：Na2CO3 1M 10.6g。

β-半乳糖苷酶活性测定方法

β-半乳糖苷酶活性测定（β-galactosidase assays）1、将过夜培养的菌液按1%接种量到新鲜培养基中培养，待OD600至0.6时取出，放置于冰上；（或可检测不同OD600时，菌的酶活性）2、取50-100μl 菌液至1.5 ml 的离心管中，加370-420μl Z buffer；3、加20 μl 氯仿和10 μl 0.1% SDS，振荡混匀，裂解细胞，放置于冰上30分钟；4、向离心管中加入100 μl 浓度4 mg/ml 的ONPG，混匀后立即置于30℃反应30-60分钟；5、待颜色变黄后，加入250 μl 1 M Na2CO3中止反应，准确记录变色反应的时间；6、取200μl上清，测定420 nm 和550 nm 处的吸光度；7、计算β-半乳糖苷酶酶活力：Miller Units = 1,000×[(OD420－1.75×OD550)] / (t×V×OD600)，其中，OD420和OD550----显色后的反应液读数；OD600----用于显色分析的培养液的细菌密度；t ----显色反应时间(单位min)；V ----用于显色分析的培养液体积(单位ml)。

Substrate solution(总体积10ml)----现用现配Na2HPO4·12H2O 60mM 0.215 gNaH2PO4·H2O 40mM 0.0624gONPG 4mg/ml 0.04g终止液（100ml）：Na2CO3 1M 10.6g。

半乳糖苷酶活测定

1.5 β—半乳糖苷酶粗酶液的提取将菌株接种于产酶培养基中，30℃培养60h，过滤收集菌体，充分洗涤，加柠檬酸--磷酸氢二钠缓冲液（0.1mol/L，pH5.0）研磨，破壁菌液离心所得上清液即为粗酶液。

1.6 酶活力的测定在试管中加入100µl邻硝基苯酚-β-D半乳糖苷（ONPG），800µL 10.2mol/L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，100µl酶液，混匀，50℃水浴中反应10分钟，加2ml 1mol/L终止反应，测定计算酶活力。

酶活力单位定义：在上述反应条件下，每分钟分解ONPG，生成1µ mol邻硝基苯酚（ONP）所需的酶量为1个酶活力单位（U）。

1.2.1 酶活力的测定以ο-NPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。

酶活力单位定义为以ο-NPG为底物37℃保温酶解，每分钟释放出1µmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活力单位。

β-半乳糖苷酶活测定采用Genstar 的β-半乳糖苷酶检测试剂盒法。

在有β-半乳糖苷酶存在的条件下，无色的反应底物会转化生成黄色的硝基酚(o-nitrophenol)。

向各管中加入一定量的反应终止液，离心测定420 nm 和550 nm 下的吸光度。

β-半乳糖苷酶活性单位数(U)=1000- (OD420 -1.7 OD550)/Time(min)×V(mL)×1.5 酶活力测定方法将pH6.5的磷酸缓冲液500µl和0.25%的ONPG 200µl加入比色管,在25℃的温度下温浴5min,加入适当稀释的粗酶液0.5ml,反应10min,加入800µl 5%Na2CO3终止反应,蒸馏水定容至10ml,用分光光度计420nm测定OD值,通过标准曲线方程计算酶活。

在上述条件下1ml粗酶液1min催化水解ONPG生成1µmol邻硝基苯酚(ONP)的量,定义为1U。

1.2培养基初筛培养基：乳糖0.5%，硫酸镁0.007%，磷酸氢二钾0.01%，氯化钙0.004%，硫酸铵0.01%，琼脂1.5%，自然pH，每100mL培养基中加入20mg/mL X-gal溶液200µL；复筛培养基：乳糖1.5%，蛋白胨1.0%，酵母浸膏0.3%，氯化钠0.1%，pH值7.0；发酵培养基：乳糖3.0%，蛋白胨1.5%，酵母浸膏1.0%，氯化钠0.3%，pH值7.0。

β半乳糖苷酶染色统计方法

β半乳糖苷酶染色统计方法β半乳糖苷酶染色统计方法引言β半乳糖苷酶是一种重要的酶，广泛应用于生物医学研究和临床诊断领域。

为了准确测定β半乳糖苷酶的活性，我们需要针对其染色来进行统计分析。

本文将详细介绍几种常用的β半乳糖苷酶染色统计方法。

方法一：比色法1.准备样本：收集待测试的样本，如细胞培养液或组织切片。

2.制备底物：制备含有4-甲基-β-半乳糖苷（MUG）的底物溶液。

3.加入样本与底物：将样本与底物溶液混合，以触发酶底物反应。

4.加入停止液：加入含碱性溶液，停止反应，生成可测量的产物。

5.比色测定：使用比色法测量产物的吸光度，根据标准曲线计算β半乳糖苷酶的活性。

方法二：荧光法1.准备样本：与比色法相同，收集待测试的样本。

2.加入底物：使用荧光底物（如4-甲基-7-氨基香豆素）进行反应。

3.反应停止：加入相应的化学物质停止反应，生成可测量的荧光产物。

4.荧光测定：使用荧光光谱仪或流式细胞仪来测量荧光产物的荧光强度，并计算β半乳糖苷酶的活性。

方法三：显微镜法1.准备样本：制备待测试的组织切片或细胞样本。

2.染色：使用具有底物性质的染色剂（如X-β-D-GlcA）来染色。

3.显微镜观察：使用显微镜观察到染色后的样本，测量正、负染色细胞的数量。

4.统计分析：根据正、负染色细胞的数量计算出β半乳糖苷酶的活性。

方法四：酶组学技术1.准备样本：收集待测试的细胞或组织样本。

2.酶组学分析：使用高通量酶组学技术（如蛋白质微芯片）来评估多个酶的活性。

3.数据分析：将得到的酶组学数据进行统计分析，计算β半乳糖苷酶的活性。

4.结果验证：使用其他方法对结果进行验证，如比色法、荧光法或显微镜法。

结论根据上述介绍的方法，研究人员可以选择适合自己研究需求的β半乳糖苷酶染色统计方法。

无论是比色法、荧光法、显微镜法还是酶组学技术，都可以提供准确的β半乳糖苷酶活性数据，助力相关研究的开展。

在选择方法时，需根据实验条件、设备设施和预算等因素进行综合考虑，以确保研究结果的可靠性和准确性。

β-半乳糖苷酶活性分析

β-半乳糖苷酶活性分析β-半乳糖苷酶活性检测nifH-lacZ表达的β-半乳糖苷酶活性测定：（1）液体活化待测菌株，将待测菌株接种于5ml含适当抗生素的液体L3基本培养基中，37℃摇床，250rpm振荡，过夜培养；（2）收集菌体，并用无氮的L3基本培养基洗2次；（3）将菌液用不含氮的L3培养基稀释至OD600=0.2~0.4；（4）将4ml菌液注射至事先配气的血清瓶中（空气+氩气，调整合适的氧气浓度，微好氧3%），37℃，200rpm诱导3.5~4hr（每个样品3个重复）；（5）取出2ml样品于离心管中，100μl用于测定β-半乳糖苷酶活性，其余用于测定OD600；（6）100μl样品加到2ml离心管中，加入900μl Z-Buffer混匀，加入20μl 0.1%SDS，40 μl 氯仿，振荡20~30sec，同时设两个空白对照，加入100μl不含菌体的培养基作为样品，其余与测试样品的处理完全一致；（7）样品和ONPG (4mg/ml)置于28℃水浴平衡5~10min，依顺序加入200μl ONPG并准确计时，直至样品变黄，加500μl 1M Na2CO3溶液终止反应，准确记录反应时间；（8）离心12000rpm，15min，取上清测定OD420和OD550。

按以下公式计算β-半乳糖苷酶的活性：（T：反应时间，V：反应中菌体体积）β-半乳糖苷酶活性分析试剂:（1）Z-buffer：16.1g/L Na2HPO4·7H2O； 5.5g/L NaH2PO4·H2O；0.75g/L KCl；0.246g/L MgSO4·7H2O；调pH至7.0，121℃灭菌30min，室温可保存一年。

（2）Z-buffer/β-ME ：100ml Z-buffer中加入0.27ml β-巯基乙醇。

（3）ONPG(邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷): 提前两小时将ONPG 溶于Z-buffer/β-ME中，浓度为4mg/ml，-20°C保存。

β-半乳糖苷酶活力测定原理

β-半乳糖苷酶活力测定原理
β-半乳糖苷酶是一种酶，能够催化底物β-半乳糖苷的水解反应。

测定β-半乳糖苷酶的活力可以通过以下原理进行：
1. 准备反应体系：将底物β-半乳糖苷和β-半乳糖苷酶加入反应体系中。

2. 反应进行：酶催化底物水解，生成产物。

3. 酶活测定：通过测定产物的生成量，间接反映酶的活力。

4. 甲基麦芽糖法：常用的方法是利用甲基麦芽糖作为内标物。

在反应体系中加入一定量的甲基麦芽糖，同时加入β-半乳糖苷酶。

酶催化底物β-半乳糖苷和甲基麦芽糖分别生成产物。

然后使用色谱或其他分析方法对产物进行定量分析，计算出β-半乳糖苷酶的活力。

5. 光度法：在反应体系中加入某种显色剂，当底物被酶催化水解时，产生特定的颜色变化。

通过光度计测量产生的颜色变化的吸光度，可以计算出酶的活性。

这些方法都是通过测定底物的转化率或产物的生成量来间接反映β-半乳糖苷酶的活力。

β-半乳糖苷酶(LACZ)酶活测定

警示：在我们的手册中介绍的实验可能具有潜在的危险性，要求操作人员具有相当的安全训练、特殊装备、以及相关安全部门的监督。

作为实验操作员的你承担全部的责任、义务和由于实施安全步骤和措施带来的危险。

麻省理工大学没有责任、义务或承担由于实施本材料中内容所引起的危险。

法律声明β-半乳糖苷酶（LAC Z）酶活测定1. 在冰上解冻样品，同时准备裂解液（见下面关于裂解液样品的收集和准备的注意事项）。

2. 准备若干(至少每个样品3个和空白一支)透明的塑料比色皿，每支装有500μl的碳酸钠终止液。

你可以在比色皿上标明测试样品的名称和使用的时间。

3. 在微量离心试管中加入如下试剂：400μl 磷酸钠盐缓冲液（pH 7.5）133μl ONPG溶液6μl 镁离子溶液4. 把反应混合物放置在37°C的水浴中或者加热垫上预温育。

5. 一旦预热后，加入如下物质：60μl 细胞萃取物比较明智的做法是同时做阴性对照，即用抽提物或不表达β-半乳糖苷酶的细胞抽提物代替前述的细胞抽提物。

6. 留心观察每个反应试管里黄色（o-硝基酚）的出现，在适当的时间点，从每种反应混合物中等量移取100μl的溶液，把它加到装有碳酸钠终止液的比色皿中。

7. 当完成所有时间点测定后，在420 nm处测光密度，记录吸光值，并且计算吸光值与时间的斜率。

斜率和β-半乳糖苷酶的活性成正比。

注意：若在420nm处吸光值高于1.0，则不能采信。

8. 在计算其实际活性时，先制作o-硝基酚标准曲线图，然后根据样品的吸光值在曲线上找出对应的浓度。

一个酶活力单位是指酶在37ºC每分钟可催化产生1 μmol的o-硝基酚。

收集和裂解细胞的注意事项细胞培养物的收集1. 在适当的培养时间，取出1.6 ml的培养物放入微量离心管中，并把它置于冰上。

2. 迅速将1.6 ml样品在涡旋混匀器上振荡，然后移出100μl放入已装有900 μL新鲜培养基的比色皿中。

离心剩下的1.5ml样品，去掉上层清液，把沉淀迅速放在-80°C冷藏。

细菌β-半乳糖苷酶快速纸片法检测

后符合率为９．１，１５ｍｌＬＯＰ纸片法与试管０９％而．ｏＮＧ／
的鉴定已是临床细菌学实验室的迫切要求，为此我们参
照国内外有关文献，计了ｐ半乳糖苷酶（ｎｒｐｅｙｐ设一ｏｉｏｈｎｌ — ｔ —
１９，４９：７－６．９７３（）６７７４
ＪｆＳ，ＲｒｋｌｅＪａｆＡｅａｉ，ＲｏｅｔＲ，ｅ１．ＩＳｔｏｄｂｒｓｔａｔｉｆｒｍｅ
强电场作用下会使肌细胞产生电穿孔，致细胞发生早发或迟发性损伤，横纹肌溶解，断释放使不
文章编号：６３８４（０８０－８－２１７ —６０２０）５０３０４中图分类号：４６５Ｒ４．文献标识码：Ｂ
细菌Ｉ半乳糖苷酶快速纸片法检测３；一
魏红
（安市妇产儿童医院，江苏淮安２３０）淮２００
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２０１２１）１１ — ２．００，０（１：２６１０２
是有所不同的。近年来，国外也有文献报道在实
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β-半乳糖苷酶活性检测

β-半乳糖苷酶活性检测材料及试剂准备：材料准备：1.5ml无菌离心管若干、计时器等。

试剂准备：（1）ONPG（O-nitrophenyl β-D-galactopyranoside）：4 mg/mL 溶于Z buffer，混匀，调节至pH 7.0。

ONPG 需要1-2 h 溶解，每次使用时必须配制新鲜的溶液，且需避光存放。

（2）Z buffer：16.1 g Na2HPO4· 7H2O，5.50 g NaH2PO4· H2O，0.75 g KCl，0.246 g MgSO4· 7H2O，ddH2O定容至1000 mL，调节至pH 7.0，121℃灭菌20 min，室温可存放一年，根据需要使用前可加β-巯基乙醇2.7 mL。

（3）YPD 培养基：20.0 g Peptone，10.0 g Yeast Extract，20.0 g Glucose，蒸馏水定容至1000 mL，调节至pH 5.8，121℃灭菌20 min。

（4）SD 培养基： 1.7 g YNB (Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate)，5.0 g (NH4)2SO4，20.0 g Glucose，100 mL 10×Dropout 溶液，ddH2O 定容至1000 mL，调节至pH 5.8，115 ℃灭菌20 min。

（5）Na2CO3溶液： 1 mol/L实验步骤：(1)准备5 mL在液体SD筛选培养基中过夜培养的待测菌液。

(2) 实验当天，提前准备4 mg/mL的ONPG 溶液，用Z buffer 溶解，在摇床上摇1-2 h。

(3) 混匀过夜培养物，迅速将2 mL培养物加入8 mL YPD 培养基中，30℃，220 r/min 培养3-5 h（使OD600 值达到0.5-0.8），记录收集细胞时的OD600值。

(4) 取3个1.5 mL离心管，每个离心管内收集1.5 mL的培养物，14000 r/min 离心30 s。

β-半乳糖苷酶试验原理

β-半乳糖苷酶试验原理你看啊，在微生物的世界里呢，β - 半乳糖苷酶可是个挺有趣的东西。

这个试验呢，主要是用来检测微生物是不是能够产生β - 半乳糖苷酶这种酶类。

那为啥要检测这个酶呢？这就像我们在一个神秘的宝藏岛上，要找到一把特殊的钥匙（β - 半乳糖苷酶），来打开某些秘密的大门（了解微生物的特性）。

那这个试验是咋进行的呢？这里面有个关键的东西叫底物。

就好比是这个酶要去“攻克”的一个小城堡。

这个底物啊，在β - 半乳糖苷酶试验里，常见的是邻 - 硝基酚 - β - D - 半乳糖苷（ONPG）。

这个名字听起来是不是有点绕口？没关系，咱就把它当成一个特殊的小点心。

对于那些能够产生β - 半乳糖苷酶的微生物来说，这个ONPG就是它们超爱的美味。

当微生物产生的β - 半乳糖苷酶碰到这个ONPG底物的时候，就像小馋猫看到了小点心，那可就不客气啦。

酶就开始发挥它的神奇作用，把这个ONPG分解掉。

分解之后呢，就会产生两种东西，一种是半乳糖，另一种就是邻 - 硝基酚。

这邻 - 硝基酚可就有点特别啦，它有个本事，就是能够让溶液变色。

一般来说，会变成黄色。

就像变魔术一样呢！本来平平无奇的溶液，因为这个酶分解底物，就一下子变得黄澄澄的了。

这个变色的过程啊，就像是微生物在向我们大声宣告：“看呀，我能产生β - 半乳糖苷酶呢！”从更深层次来讲，这个试验原理其实反映了微生物的基因表达情况。

如果微生物能够产生β - 半乳糖苷酶，那就说明它体内有相关的基因在起作用，在指挥着细胞合成这种酶。

这就像一个小工厂，有特定的生产指令（基因），然后生产出特定的产品（β - 半乳糖苷酶）。

而且啊，这个试验在微生物鉴定方面可重要啦。

比如说在鉴定大肠杆菌的时候，β - 半乳糖苷酶试验就是一个很关键的步骤。

大肠杆菌这个调皮的小微生物，它是能够产生β - 半乳糖苷酶的。

通过这个试验，我们就能把它从一堆微生物里找出来，就像在一群小朋友里，通过某个小特点找到特定的那个小朋友一样。

β―半乳糖苷酶标记试剂

β―半乳糖苷酶标记试剂
β—半乳糖苷酶标记试剂
β—半乳糖苷酶已被广泛用于酶标记免疫分析，但主要用于免疫细胞化学。

一种较好的底物是5—溴—4—氯—3—吲哚—β—D—吡喃型半乳糖苷(BCIG)，它可以产生一种深蓝色的产物。

此产物在乙醇和水中稳定，不溶解。

1．需要的溶液、试剂和特殊设备
BCIG；
N，N—二甲基甲酰胺；
1mmol／LMgCl2；
3mmol／L亚铁氰化钾用溶解，DPX。

光学显微镜(通常带有照相机以便于记录结果)。

2．操作步骤
(1)用0．1mlDMF溶解4．9mgBCIG。

(2)加0．1mlBCIG溶液至10ml含有1 mmol／L MgCl2 3retool／L亚铁氰化钾的中。

(3)滤纸过滤。

(4)加此溶液至标本，在室温孵育10～40min，用水冲洗终止反应。

(5)优化：如果需要，进行复染。

(6)用DPX封片。

β-半乳糖苷酶（β-Galactosidase）活性的整体封片免疫组化检测实验

β-半乳糖苷酶（β-Galactosidase）活性的整体封片免疫组化检测实验β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）是一种水解酶，催化β-半乳糖苷水解成单糖。

使β-半乳糖苷酶作用的底物包括神经节苷脂GM1、乳糖苷、乳糖、各种糖蛋白。

准备大组织的厚切片进行β-半乳糖苷酶染色材料：小鼠或鸡的整个胚胎、组织或外植体试剂（盒）：磷酸盐缓冲液（PBS) 冰冷β-半乳糖苷酶固定剂β-半乳糖苷酶洗涤缓冲液β-半乳糖苷酶染色液仪器、耗材：5毫升或10毫升的聚苯乙烯或聚丙烯帽盖的试管或1.5~2 毫升的离心管;转动平台;染色用密闭箱;附有盖玻片的下陷载玻片或箱式载玻片;纤光照明的解剖显微镜;照相显微镜步骤⑴在冰冷的PBS里解剖胚胎或组织。

置β-半乳糖苷酶固定剂，室温至合适的时间。

固定小鼠胚胎和组织：外植体和E 6.5~E 7.5胚胎5~10 分钟；E 8~E 9.5胚胎或尾巴切面 15~30 分钟；E 10 ~ E 12.5 胚胎 30 ~90分钟;E 13~ E 14.5 胚胎 2 小时;E 15.5 或更大的组织则需要解剖出来或切一半，然后固定2小时。

新生幼鼠或更大的小鼠的灌注需要在解剖特定组织染色之前进行。

⑵用β-半乳糖苷酶洗涤缓冲液室温洗涤3次，每次15 分钟 (针对小胚胎或尾巴切面），或每次30分钟(针对Ell胚胎和大组织），头尾相接地轻柔转动。

⑶将组织置于β-半乳糖苷酶染色液中（室温，30℃或37℃取决于β-半乳糖苷酶表达丰度），在5 毫升或10 毫升的帽盖的试管或1. 5~2毫升的离心管中孵育，以防蒸发。

可用肉眼或解剖显微镜调节染色程度。

⑷得到预期的信号背景比之后（1~48 小时)，在PBS中洗涤组织3次，每次30 分钟。

⑸通过解剖镜观察和拍摄样本染色的组织，使用低功率的物镜和来自侧面和顶端的光纤照明。

为了得到最好的结果，将组织放置在附有盖玻片的下陷载玻片或箱式载玻片，用足够的PBS覆盖组织。

β-半乳糖苷酶的测定方法

β-半乳糖苷酶的测定方法嘿，咱今天就来聊聊β-半乳糖苷酶的测定方法。

你可别小看这个酶呀，它在好多领域都有着重要的作用呢！要说测定它的方法，那就像我们生活中找东西一样，有好多种途径呢。

比如说，有一种方法就像是拿着一个特别的“探测器”，能准确地找到β-半乳糖苷酶的存在。

这种方法通过一些特定的化学反应，让酶显现出来，就好像它在跟我们玩捉迷藏，而我们通过这个“探测器”一下就把它给抓住啦！还有一种方法呢，就像是给β-半乳糖苷酶做一个特殊的“标记”，然后我们就能根据这个标记轻松地找到它啦。

是不是很神奇呀？这就好比你在一群人中，一眼就能认出那个穿着特别衣服的人一样。

另外呢，也有利用仪器来测定的方法。

这些仪器就像是超级厉害的“眼睛”，能看到我们肉眼看不到的东西。

它们能精确地检测到β-半乳糖苷酶的各种特征，然后告诉我们结果。

你想想，这多厉害呀！那这些方法都有啥优缺点呢？嗯，就像人无完人一样，每种方法也都有它自己的特点。

有的可能很灵敏，稍微有一点β-半乳糖苷酶就能检测出来，但操作可能会稍微复杂一些；有的可能操作简单，但是准确性可能就没那么高啦。

这就好比有的鞋子好看但可能不太舒服，有的鞋子舒服但样子可能没那么好看，你得根据自己的需求来选择呀！在实际应用中，我们得根据具体情况来选择合适的测定方法。

要是要求特别高的精度，那咱就得选个厉害点的方法；要是只是大概了解一下，那简单点的方法也够用啦。

这就跟咱出门一样，要是去重要场合，那肯定得精心打扮一下；要是只是下楼取个快递，那就随便穿穿就行啦。

而且呀，不同的领域对β-半乳糖苷酶的测定要求也不一样呢。

在生物研究中，可能需要非常精确的数据；在工业生产中，可能更注重速度和成本。

这就好像不同的比赛有不同的规则一样，我们得根据比赛的要求来调整策略。

总之呢，β-半乳糖苷酶的测定方法有很多，我们得好好了解它们，才能在需要的时候选出最合适的那个。

这可不是一件容易的事儿呀，但只要我们用心去学，肯定能掌握好的。

β-半乳糖苷酶(LACZ)酶活测定

警示：在我们的手册中介绍的实验可能具有潜在的危险性，要求操作人员具有相当的安全训练、特殊装备、以及相关安全部门的监督。

作为实验操作员的你承担全部的责任、义务和由于实施安全步骤和措施带来的危险。

麻省理工大学没有责任、义务或承担由于实施本材料中内容所引起的危险。

法律声明β-半乳糖苷酶（LAC Z）酶活测定1. 在冰上解冻样品，同时准备裂解液（见下面关于裂解液样品的收集和准备的注意事项）。

2. 准备若干(至少每个样品3个和空白一支)透明的塑料比色皿，每支装有500μl的碳酸钠终止液。

你可以在比色皿上标明测试样品的名称和使用的时间。

7. 当完成所有时间点测定后，在420 nm处测光密度，记录吸光值，并且计算吸光值与时间的斜率。

斜率和β-半乳糖苷酶的活性成正比。

注意：若在420nm处吸光值高于1.0，则不能采信。

8. 在计算其实际活性时，先制作o-硝基酚标准曲线图，然后根据样品的吸光值在曲线上找出对应的浓度。

一个酶活力单位是指酶在37ºC每分钟可催化产生1 μmol的o-硝基酚。

收集和裂解细胞的注意事项细胞培养物的收集1. 在适当的培养时间，取出1.6 ml的培养物放入微量离心管中，并把它置于冰上。

2. 迅速将1.6 ml样品在涡旋混匀器上振荡，然后移出100μl放入已装有900 μL新鲜培养基的比色皿中。

离心剩下的1.5ml样品，去掉上层清液，把沉淀迅速放在-80°C冷藏。

β-半乳糖苷酶酶活力测试系统及pSV-β-半乳糖苷酶载体

1) 什么是β-半乳糖苷酶酶活力测试系统？用β-半乳糖苷酶对照载体转染细胞后，可用β-半乳糖苷酶酶活力测试系统直接，方便地测试β-半乳糖苷酶酶活力。

β-半乳糖苷酶载体可用着阳性对照载体，测试哺乳细胞的转染效率。

细胞抽提物与提供的溶液及底物ONPG共保温（硝基苯吡喃半乳糖,o-nitrophyl-B-D-galactopyranoside）。

用分光光度计或ELISA读数仪测定光度数。

应在420nm处测定吸收。

2) β- 半乳糖苷酶酶活力测试系统的一般活力范围？用分光光度计，β-半乳糖苷酶酶活力的标准曲线的范围是0到9个毫单位。

用ELISA读数仪，β-半乳糖苷酶酶活力的标准曲线的范围是0到5个毫单位。

3) β- 半乳糖苷酶酶活力测试系统应保存在哪种温度，保存期是多久？酶应保存在4o C，β-半乳糖苷酶在-20o C冰冻后，会失活。

碳酸钠应在室温保存。

2×测试溶液应保存在-20o C。

如操作得当，系统所有组份从购买之日起在12个月内有效。

4) β- 半乳糖苷酶的酶活力单位是如何定义的？1个单位的β-半乳糖苷酶的酶活力定义为：每分钟，37o C, pH7.5时，水解1微摩尔的ONPG成硝酸苯酚及半乳糖。

用银染序列DNA测序系统需要额外的装备吗？额外的装备包括：热循环仪、SigmaCote溶液（Sigma 目录号SL-2）、无核酸酶的纯水（目录号P1193）、冰乙酸、震荡器和旋转平台、比测序胶大的聚乙烯盒。

5) 为什么β-半乳糖苷酶酶活力测试系统要提供报告基因裂解溶液？报告基因裂解溶液可使β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶（CAT）及荧光素酶的测试能用一种细胞抽提物完成。

在多种细胞株中的测试表明，β-半乳糖苷酶在报告基因裂解液中的活力比用冻/融法制备的抽提物的活力更高。

6) 用荧光素酶细胞培养裂解试剂制备的细胞抽提物是否能用于测试β-半乳糖苷酶酶活力？可以用细胞培养裂解试剂（CCLR）制备的细胞抽提物测试β-半乳糖苷酶活力。