(蓝白斑筛选) lacZ - β-半乳糖苷酶
蓝白斑筛选的原理及方法
蓝白斑筛选的原理及方法载体pGEMZ在俟半乳糖苷酶（lacZ ）的a肽编码区内具有多克隆区域。
在重组质粒中插入片段使a-肽失活，可在指示平板上通过颜色筛选鉴别。
不带有插入片段的载体，表达有功能的禺半乳糖苷酶，所用的宿主菌在染色体或附加体上缺失掉lacZM15基因，导致内源a-肽失活。
载体pGEMZ或其它含lacZ基因的a-肽互补细菌，具有俟半乳糖苷酶的3片段，所得功能俟半乳糖苷酶（a- 肽加3片段）将底物X-Gal转化为有颜色的产物，得到蓝色菌落。
在载体pGEMZ 的多克隆区域，克隆上插入片段导致a-肽编码区的破坏，使俟半乳糖苷酶失活，得到白色菌落。
a-肽编码区读码框内小的插入片段产生浅兰色菌落，因俟半乳糖苷酶只是部分失活。
重组质粒转化到合适的菌株中（JM109 ，DH5a ），然后涂布到含0.5mMIPTG, 40ug/mlX-Gal 指示平板上。
可将50ul 的X-Gal 和100 ulIPTG 贮液直接加入到平板中，扩散到整个平板中，在37oC 保温30 分钟使液体扩散。
IPTG 溶于水中，贮液浓度为100mM ,X- Gal溶于DMF，贮液浓度为50mg/ml 。
IPTG 和X- Gal 需分装后保存在-20 oC ，可保存2-4 个月。
IPTG 即Isopropyl B -D-1-thiogalactopyra no side ，也称Isopropyl B-D-thiogalactoside ，中文名为异丙基-B -D-硫代半乳糖苷。
分子式为C9H18O5S 分子量为238.30, CASNumber367-93-1，Ultra Pure, dioxane free，纯度＞99.6%。
我公司提供Merck 公司该产品。
.本产品为接近白色的粉末常用分子生物学试剂，常用于蓝白斑筛选及IPTG 诱导的细菌内的蛋白表达等。
IPTG是B -半乳糖苷酶的活性诱导物质。
基于这个特性，当pUC系列的载体DNA或其他带有lacZ基因载体DNA以lacZ缺失细胞为宿主进行转化时、或用M13噬菌体的载体DNA1行转染时，如果在平板培养基中加入X- Gal和IPTG,由于B -半乳糖苷酶的a -互补性，可以根据是否呈现白色菌落（或噬菌斑）而方便地挑选出基因重组体。
蓝白斑筛选的原理
蓝白斑筛选的原理一、蓝白斑的神奇“变色术”大家知道吗，蓝白斑其实就像是大自然中的一场魔术表演，别看它们貌不惊人，却能帮我们解决不少难题。
你有没有想过，为什么有些细菌能够变成蓝色，或者白色，甚至在你不小心“挑错”了的瞬间，就像是“拔得头筹”一样暴露出来？这其中可大有玄机。
蓝白斑筛选的原理，说白了就是通过细菌的颜色变化来区分哪些细菌完成了任务，哪些没有。
想象一下，你参加一个比赛，规则是“谁先完成任务，谁就能变成蓝色”。
你在想啥呢？当然是完成任务的那一方啦！话说回来，这个蓝白斑的过程其实是根据细菌是否能够分解特定的物质来判断的。
你知道吗？一些细菌能通过产生某种酶来分解含有特定物质的化合物，分解后就会发生化学反应，结果就是变色。
你仔细观察，变成蓝色的细菌就是“完成任务”的那一方，它们已经成功地分解了化合物；而那些保持白色的细菌呢？嗯，通常是没完成任务的。
咋样，这个“筛选法”简直就像是考试，谁考得好谁就“变色”！二、筛选的“大功臣”——β半乳糖苷酶说到蓝白斑筛选的核心原理，咱们不得不提一提β半乳糖苷酶（这个名字一听就有点儿高大上，是吧？别担心，听我说完你就明白了）。
简单来说，这个酶就像是“钥匙”，它能打开某些特定“门”，从而使得细菌在某些条件下变色。
比如我们常常看到的那种蓝白斑筛选系统，它就是通过这个酶来检测细菌的“作业完成情况”的。
怎么样，听起来是不是有点像个“检察官”，专门检查细菌是否履行了自己的职责？咱们平时用的就是这么个系统：比如说你要插入一个外源基因到细菌里，然后通过检测这个β半乳糖苷酶的活动情况，来判断哪个细菌成功拿到了“基因”，哪个没有。
要是基因插入成功，β半乳糖苷酶就开始起作用，细菌变成了蓝色；如果没有插入，那酶就不活动，细菌还是白的。
看，这是不是挺酷的？就像是侦探破案，蓝色细菌就是犯罪嫌疑人，白色的呢，可能是“路人甲”。
三、实际应用：用蓝白斑来找“真凶”说到实际应用，蓝白斑筛选可真是生动又实用，简直是实验室里的小英雄。
蓝白斑筛选重组子原理
蓝白斑筛选重组子原理
蓝白斑筛选重组子是一种常用的分子生物学技术，用于筛选含有特定DNA序列的重组质粒。
其原理基于大肠杆菌（E. coli）的β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）基因（lacZ）和其启动子（lac promoter）的特性。
在重组质粒中，通常会将目标DNA序列插入到lacZ基因中的某个位置，从而破坏lacZ基因的完整性。
当重组质粒被转化到大肠杆菌中时，如果大肠杆菌中的β-galactosidase活性受到影响，那么它就无法将X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷）转化为蓝色产物，而只能将其转化为无色产物。
因此，含有完整的lacZ基因的大肠杆菌会产生蓝色菌落，而含有破坏的lacZ基因的大肠杆菌则会产生无色菌落。
为了实现蓝白斑筛选，通常会将重组质粒转化到含有X-gal的琼脂平板培养基上。
在培养过程中，含有完整lacZ基因的大肠杆菌会形成蓝色菌落，而含有破坏lacZ 基因的重组质粒则会形成无色菌落。
因此，通过观察菌落颜色，可以快速筛选出含有特定DNA序列的重组质粒。
总之，蓝白斑筛选重组子的原理是利用大肠杆菌β-galactosidase基因和启动子的特性，通过观察菌落颜色来筛选出含有特定DNA序列的重组质粒。
蓝白斑筛选
一、1、蓝白筛选的原理LacZ'是lacZ基因的突变型，编码半乳糖苷酶N端的146个氨基酸（全长1201氨基酸）。
MCS也在这个区域内。
这类载体的适合宿主细胞必须是Z基因突变型，只具有Z基因C端的序列。
当两个Z基因的突变产物在一起时可产生蛋白质间的互补，称α互补。
如pUC系列的载体一般采用DH5α、JM109。
因为pUC系列的质粒具有lacZ的α片段，而具有lacZ△M15基因型的DH5α、JM109等能表达与α片段互补的ω片段，因此当不带有外源基因的质粒pUC导入宿主细胞，具有lacZ的β-半乳糖苷酶活性，而插入外源基因的pUC质粒导入宿主细胞，则不具有β-半乳糖苷酶活性。
当将具有α互补的细菌培养在含IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）及X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，本身无色）的培养基上时，因β-半乳糖苷酶能将X-gal底物水解产生兰色物质（被水解为无色的半乳糖及深兰色的5-溴-4-氯靛兰），因此菌落为兰色。
相反，不互补则产生白色菌落。
如果在MCS位点上插入DNA片段导致插入突变，则不能产生α互补，因此菌落是白色的。
从而通过菌斑的颜色即可选择出具有插入外源基因的质粒的大肠杆菌。
2、影响转化率的几个重要因素⑴、受体细胞转化的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，它可容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
另外还应根据载体的性质及实验的目的选择合适的宿主。
此外，受体细胞生长状态和密度也很重要。
不要使用经过多次转接或储存于4℃的培养菌。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，密度过高或不足均会影响转化率。
⑵、载体DNA和重组DNA方面载体本身性质决定了转化的高低，不同的载体DNA转化同一受体细胞，其转化效率不同。
载体的空间构象也有明显影响，超螺旋结构的载体质粒往往有较高的转化率，经体外酶切连接操作后的载体DNA或重组DNA由于空间上难以恢复，其转化率常比cccDNA低两个数量级。
蓝白斑筛选名词解释
蓝白斑筛选名词解释蓝白斑筛选（blue-white selection）是一种用来筛选融合过表达的目的基因的方法。
它在分子生物学研究中被广泛应用于筛选携带特定基因型的细胞克隆。
蓝白斑筛选的基本原理是利用一种称为β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）的酶来区分含有目的基因的细胞克隆和不含有目的基因的细胞克隆。
β-半乳糖苷酶是一种能够水解乳糖和其类似物的酶，在无添加基因座的细胞中存在着，而在添加了基因座的细胞中则不存在。
在蓝白斑筛选中，一般会将目的基因与与β-半乳糖苷酶基因lacZ连在一起，形成一个连锁或位点插入建构。
当该建构被转入宿主细胞中后，如果目的基因被激活或表达，那么lacZ基因也会被转录和翻译形成β-半乳糖苷酶。
而在加入X-半乳糖（一种受β-半乳糖苷酶水解的物质）后，带有lacZ基因的细胞会产生蓝色的反应物，形成蓝斑。
因此，只有带有目的基因的细胞才会出现蓝斑。
通过蓝白斑筛选，研究人员可以快速、高效地筛选出携带目的基因的细胞克隆。
这种方法的应用范围很广，包括但不限于以下几个方面：1. 基因克隆：蓝白斑筛选能够帮助研究人员快速鉴定克隆中是否含有目的基因，并确定目的基因的定位以及克隆的纯度。
2. 蛋白质表达：通过蓝白斑筛选，可以筛选出表达目的蛋白的细胞克隆，从而方便研究人员进行蛋白质的表达和纯化。
3. 基因表达调控：蓝白斑筛选可以帮助研究人员研究目的基因的表达调控机制，以及筛选出调控因子。
4. 化学物质筛选：通过蓝白斑筛选，研究人员可以筛选出具有特定功能的化学物质，从而研究其对细胞生物学过程的影响。
总之，蓝白斑筛选是一种重要的遗传工程技术，通过利用β-半乳糖苷酶对含有目的基因的细胞进行筛选，为基因克隆、蛋白质表达、基因表达调控等多个领域提供了高效、可靠的方法。
蓝白斑筛选的原理及方法
蓝白斑筛选的原理及方法载体pGEMZ在β-半乳糖苷酶（lacZ）的α-肽编码区内具有多克隆区域。
在重组质粒中插入片段使α-肽失活，可在指示平板上通过颜色筛选鉴别。
不带有插入片段的载体，表达有功能的β-半乳糖苷酶，所用的宿主菌在染色体或附加体上缺失掉lacZM15基因，导致内源α-肽失活。
载体pGEMZ或其它含lacZ基因的α-肽互补细菌，具有β-半乳糖苷酶的ω片段，所得功能β-半乳糖苷酶（α-肽加ω片段）将底物X-Gal转化为有颜色的产物，得到蓝色菌落。
在载体pGEMZ 的多克隆区域，克隆上插入片段导致α-肽编码区的破坏，使β-半乳糖苷酶失活，得到白色菌落。
α-肽编码区读码框内小的插入片段产生浅兰色菌落，因β-半乳糖苷酶只是部分失活。
重组质粒转化到合适的菌株中（JM109，DH5α），然后涂布到含0.5mMIPTG, 40ug/mlX-Gal指示平板上。
可将50ul的X-Gal和100 ulIPTG贮液直接加入到平板中，扩散到整个平板中，在37oC保温30分钟使液体扩散。
IPTG溶于水中，贮液浓度为100mM，X- Gal溶于DMF，贮液浓度为50mg/ml。
IPTG 和X- Gal需分装后保存在-20 oC，可保存2-4个月。
◆IPTG即Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，也称Isopropyl β-D-thiogalactoside，中文名为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
分子式为C9H18O5S ，分子量为238.30，CAS Number 367-93-1，Ultra Pure，dioxane free，纯度>99.6%。
我公司提供Merck公司该产品。
◆本产品为接近白色的粉末常用分子生物学试剂，常用于蓝白斑筛选及IPTG诱导的细菌内的蛋白表达等。
IPTG是β–半乳糖苷酶的活性诱导物质。
基于这个特性，当pUC系列的载体DNA（或其他带有lacZ 基因载体DNA）以lacZ 缺失细胞为宿主进行转化时、或用M13噬菌体的载体DNA进行转染时，如果在平板培养基中加入X–Gal和IPTG，由于β–半乳糖苷酶的α–互补性，可以根据是否呈现白色菌落(或噬菌斑)而方便地挑选出基因重组体。
蓝白斑筛选
蓝白斑筛选原理(入门级)蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。
野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。
有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。
设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。
这种宿主菌的染色体基因组中编码β-半乳糖苷酶的基因突变，造成其编码的β-半乳糖苷酶失去正常N段一个146个氨基酸的短肽（即α肽链），从而不具有生物活性，即无法作用于X-gal产生蓝色物质。
用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为lacz'的基因，lacz'中包括：一段β-半乳糖苷酶的启动子；编码α肽链的区段；一个多克隆位点(MCS)。
MCS位于编码α肽链的区段中，是外源DNA的选择性插入位点，但其本身不影响载体编码α肽链的功能活性。
虽然上述缺陷株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带lacz'的质粒后，质粒lacz'基因编码的α肽链和菌株基因组表达的Ｎ端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用X-gal生成蓝色物质的能力，这种现象即α-互补。
操作中，添加IPTG(异丙基硫代-β-Ｄ-半乳糖苷)以激活lacz'中的β-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。
以上是携带空载体的菌株产生的表型。
当外源DNA（即目的片断）与含lacz'的载体连接时，会插入进MCS，使α肽链读码框破坏，这种重组质粒不再表达α肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无α互补作用，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。
实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的。
含X-gal的平板培养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素，这样，一次筛选可以判断出：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。
蓝白斑实验汇总
载体pGEMZ在β-半乳糖苷酶（lacZ）的α-肽编码区内具有多克隆区域。
在重组质粒中插入片段使α-肽失活，可在指示平板上通过颜色筛选鉴别。
不带有插入片段的载体，表达有功能的β-半乳糖苷酶，所用的宿主菌在染色体或附加体上缺失掉l acZM15基因，导致内源α-肽失活。
载体pGEMZ或其它含la cZ基因的α-肽互补细菌，具有β-半乳糖苷酶的ω片段，所得功能β-半乳糖苷酶（α-肽加ω片段）将底物X-Gal转化为有颜色的产物，得到蓝色菌落。
在载体pGEM Z的多克隆区域，克隆上插入片段导致α-肽编码区的破坏，使β-半乳糖苷酶失活，得到白色菌落。
α-肽编码区读码框内小的插入片段产生浅兰色菌落，因β-半乳糖苷酶只是部分失活。
重组质粒转化到合适的菌株中（JM109，DH5α），然后涂布到含0.5mMIPTG, 40ug/mlX-Gal指示平板上。
可将50ul的X-Gal和100ulIPTG贮液直接加入到平板中，扩散到整个平板中，在37oC保温30分钟使液体扩散。
IPTG 溶于水中，贮液浓度为100mM，X- Gal溶于DM F，贮液浓度为50mg/ml。
IPTG 和X- Gal需分装后保存在-20 oC，可保存2-4个月。
①Xgal（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galacto side）是一种人工工合成的、无色的乳糖类似物；②b-半乳糖苷酶与X gal显色反应是通过b-半乳糖苷酶能把无色的化合物Xgal分解成半乳糖和一个深蓝色的物质5-溴-4-氯靛蓝；③lacZ的a肽互补：a-肽（lacZ’ ）是b-半乳糖苷酶N端的一段氨基酸片断（11-41氨基酸），lacZ只有在a-肽形成4聚体的状态下才有功能。
若受体菌lac Z 突变（lacZ?M15），b-半乳糖苷酶基因的氨基端有缺失（缺失a肽），不能形成4聚体的活性酶，不能分解Xga l 。
蓝白斑筛选
• 如果宿主大肠杆菌株是正在表达lac 阻遏蛋白，然 后在载体上一个LacZ' 基因的表达可以诱导利用 IPTG，接着表达的酶可以利用人工合成的X-gal 培养基产出一种蓝色的产物。
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• In this method (Fig. 2), the transformed cells are spread on to a plate containing ampicillin (to select for transformants in the usual way), IPTG and X-gal, to yield a mixture of blue and white colonies.Insertional inactivation of LacZ' in the production of a recombinant plasmid would prevent the development of the blue color.
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• These vectors must be transformed into a special host strain which contains a mutant ['mjuːt(ə)nt] gene expressing only the c-terminal portion of β-galactosidase which can then complement the α-peptide['peptaɪd] to produce active enzyme. This reduces the size of the plasmid-borne gene, but does not alter the basis of the method. • 这些载体必须被转换到特殊的受体菌，它们含有 只表达β半乳糖苷酶部分C段的突变基因，能补充 α肽产生活性酶。这减少了质粒承载基因的大小， 但不能改变这种方法的根本。
蓝白斑筛选的原理
蓝白斑筛选的原理蓝白斑筛选（Blue-White Screening）是一种常用的分子生物学技术，通常用于筛选含有外源DNA插入物的重组质粒。
该技术利用大肠杆菌菌株对β-半乳糖苷酶（LacZ）基因的表达特性，通过对含有外源DNA插入物的质粒进行筛选，从而实现对感兴趣基因的快速鉴定和分离。
本文将对蓝白斑筛选的原理进行详细介绍。
蓝白斑筛选的原理主要基于大肠杆菌菌株对β-半乳糖苷酶（LacZ）基因的表达特性。
在正常情况下，大肠杆菌可以利用乳糖作为碳源，并通过LacZ基因编码的β-半乳糖苷酶将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖。
而在蓝白斑筛选中，常用的质粒载体中含有LacZ基因的启动子和终止子，当外源DNA插入到LacZ基因的编码区域时，会导致LacZ基因的破坏或失活，从而影响对乳糖的水解能力。
在含有外源DNA插入物的质粒被转化到大肠杆菌菌株中后，通过将细菌涂抹在含有X-半乳糖苷和异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的平板上进行培养。
在这种培养条件下，正常菌落会呈现蓝色，而含有外源DNA插入物的菌落则会呈现白色。
这是因为IPTG可以诱导LacZ基因的表达，而X-半乳糖苷可以作为底物被β-半乳糖苷酶水解，产生蓝色产物。
而当LacZ基因失活时，无法水解X-半乳糖苷，菌落呈现白色。
通过观察菌落的颜色，可以快速筛选出含有外源DNA插入物的重组质粒。
蓝白斑筛选技术具有操作简单、快速、高效的特点，广泛应用于重组质粒的筛选和鉴定。
通过该技术，科研人员可以快速鉴定感兴趣基因的载体，并进行后续的分子生物学实验。
同时，蓝白斑筛选也为基因工程领域的研究提供了重要的技术支持，推动了基因克隆和表达等领域的发展。
总之，蓝白斑筛选技术是一种重要的分子生物学技术，基于大肠杆菌对LacZ基因的表达特性，通过对含有外源DNA插入物的质粒进行筛选，实现对感兴趣基因的快速鉴定和分离。
该技术操作简单、快速、高效，广泛应用于基因工程领域，为相关研究提供了重要的技术支持。
α互补和蓝白斑筛选的原理
α互补和蓝白斑筛选的原理一、α互补是啥好玩的东西呢？嘿呀，咱们来聊聊α互补这个超有趣的小知识。
你知道吗？在基因工程的小世界里，α互补就像是一场超酷的合作游戏呢。
咱先说说这里面的小角色吧。
有一种东西叫载体，就像一个小小的快递盒子，它可以带着我们想要的基因到处跑。
这个载体里面有一个特殊的部分，叫做β - 半乳糖苷酶基因（lacZ）。
但是呢，这个基因有点调皮，它被分成了两部分，一部分在载体上，我们叫它α片段，另一部分呢，在别的地方，比如说宿主细胞里。
当这个载体进入到合适的宿主细胞里的时候，就像小盒子找到了合适的家一样。
如果一切顺利，载体上的α片段和宿主细胞里的那部分β - 半乳糖苷酶基因就会凑到一起，就像两个失散的小伙伴重逢啦。
然后它们就会合作，产生出有活性的β - 半乳糖苷酶。
这个酶呀，可不得了，它就像一个小小的魔法工人，可以对一种特殊的物质，叫X - gal，进行加工。
二、蓝白斑筛选闪亮登场啦。
那这个蓝白斑筛选又是怎么回事呢？这可就更有趣啦。
当有活性的β - 半乳糖苷酶出现的时候，它会把X - gal变成蓝色的物质。
你可以想象一下，在一个小小的培养皿里，就像一个小小的微生物城市一样，如果细胞里发生了α互补，那这个地方就会变成蓝色的小斑点，就像蓝色的小花朵在这个微生物城市里盛开一样。
可是呢，如果我们在载体里插入了我们想要研究的外源基因，这个时候就会出点小状况啦。
因为这个外源基因的插入会破坏载体上的α片段，就像把小盒子的一角弄坏了一样。
这样的话，α片段就不能和宿主细胞里的那部分凑成完整的β - 半乳糖苷酶基因了。
没有了完整的这个基因，就没有有活性的β - 半乳糖苷酶，那X - gal就不能被变成蓝色啦。
所以呢，那些没有发生α互补的细胞，也就是插入了外源基因的细胞，就会形成白色的菌斑。
在蓝色菌斑的衬托下，白色菌斑就特别显眼啦。
这就像是在一群蓝色的小花朵里，突然出现了白色的小花一样。
我们科学家就可以很容易地把这些白色的菌斑挑出来，因为它们很可能就是我们想要的，带着我们插入的外源基因的细胞。
lacz报告基因原理
Lacz报告基因原理1. 引言在分子生物学领域中，报告基因是一种用来研究基因表达的工具。
Lacz报告基因是最为常见和经典的报告基因之一。
本文将介绍Lacz报告基因的原理以及其在研究中的应用。
2. Lacz报告基因的定义和功能Lacz报告基因是一种外源基因，其编码了β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）酶。
β-半乳糖苷酶能够催化半乳糖苷键的水解，将底物X-gal（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside）分解为带有蓝色染色的产物。
因此，当Lacz报告基因的表达受到调控时，可以通过检测染色产物的形成来判断基因的活性。
3. Lacz报告基因的构建和表达Lacz报告基因的构建通常通过将其与感兴趣的启动子区域连接，形成一个融合基因。
当启动子区域活性被激活时，Lacz报告基因也会被转录及翻译，产生β-半乳糖苷酶。
这样，通过对Lacz报告基因在不同条件下的表达水平进行测定，可以研究基因调控的机制。
4. Lacz报告基因的检测方法为了检测Lacz报告基因的表达水平，研究人员通常会添加X-gal底物到细胞培养基中。
当Lacz报告基因被转录和翻译时，产生的β-半乳糖苷酶将水解X-gal，生成蓝色染色的产物。
通过观察染色的程度，可以推测Lacz报告基因的表达水平。
5. Lacz报告基因的应用领域Lacz报告基因在生物学研究中有着广泛的应用。
以下是几个常见的应用领域：(a) 基因调控研究通过将Lacz报告基因与不同启动子区域连接，研究人员可以研究基因调控的机制。
通过测定Lacz报告基因的表达水平，可以了解特定启动子区域在不同条件下的活性，从而揭示基因调控的细节。
(b) 基因表达定量通过测量Lacz报告基因产生的染色产物的含量，可以定量分析感兴趣基因的表达水平。
这对于研究基因表达的动态变化以及不同组织或细胞类型之间的差异非常有用。
(c) 检测基因重组在基因工程研究中，Lacz报告基因可以被用作检测基因重组的工具。
蓝白斑筛选
种连接有染料的底物（X-gal，5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖 苷），生成半乳糖和一种不溶于水的蓝色色素。
背景
科学家发现，lacZ基因删掉一段（删掉 后的突变体命名为lacZΔM15）后编码的 突变体β-半乳糖苷酶是没有功能的，当 被删掉的一段（命名为α-肽）与 lacZΔM15同时在一个细胞内表达的时候， 他们可以组合重新恢复功能。这个过程 叫α-互补。
质粒载体：需要含有α-互补克隆的MCS，如 pGEM-T, pUC18 and pUC19和pBluescript。
炫酷的蓝白斑筛选
Contents
简述
原理
注意事项
背景
蓝白斑筛选是一种基因工程常用的重组菌筛选方法 细菌的乳糖操纵子（lac）包含一个叫lacZ的基因，它编码的蛋白 是β-半乳糖苷酶。乳糖操纵子可以被乳糖或者乳糖类似物IPTG给 激活，启动下游基因的表达。（严格的来说，IPTG是与lac阻遏物 结合，让它失活来启动lac的表达的）。β-半乳糖苷酶可以降解一
注事项
对照：用空载体转化平板，板子上的所有克 隆应该都是蓝色。证明IPTG和X-gal都没有问 题。
培养时间：一般平板要在培养箱中至少培养 16-20小时才可以让细菌表达出β-半乳糖苷酶， 从而菌落才能变色。如果平板上的所有克隆 子都是白色，这往往是不正常的。
蓝白斑筛选的原理
蓝白斑筛选的原理
蓝白斑筛选是一种常用的基因克隆技术，用于定位和筛选含有目标基因的克隆DNA。
它基于青霉素酶和X-α-半乳糖苷酶的功能差异，通过对克隆表达基因区域进行片段插入或删除，从而产生对这两种酶敏感或抗性的变化，进而实现筛选目标基因克隆的目的。
具体原理如下：
1. 青霉素酶敏感性（Blue）：通常将青霉素酶基因（bla）与目标基因克隆在同一载体上，在克隆表达区域内插入外源DNA片段。
插入外源DNA后，原本完整的青霉素酶基因会发生部分或全部破坏，导致青霉素酶无法正常表达。
因此，带有插入外源DNA的克隆在含有青霉素的培养基上生长，形成白色菌落。
2. X-α-半乳糖苷酶抗性（White）：一般会将X-α-半乳糖苷酶基因（lacZ）与目标基因克隆同在另一载体上，插入外源DNA片段后，原本完整的X-α-半乳糖苷酶基因可能发生部分或全部破坏，导致X-α-半乳糖苷酶无法正常表达。
因此，带有插入外源DNA的克隆在含有X-α-半乳糖苷酶底物——X-α-半乳糖苷（X-Gal）的培养基上生长，形成蓝色菌落。
利用以上原理，操作者可将含有插入外源DNA的菌落从青霉素酶培养基上转移到X-α-半乳糖苷酶培养基上。
这样，目标基因克隆会在X-α-半乳糖苷酶培养基上表达，使得菌落变为白色，便于从复杂的混合克隆中筛选出目标基因。
蓝白斑筛选假阴性
宝枫林蓝白斑筛选假阴性质粒除有抗性基因外，往往还带有其他明显的筛选标记，最常用的是蓝白斑筛选（-半乳糖苷酶系统）。
此类载体携带lacZ’基因，它编码β-半乳糖苷酶的N-末端（α-肽），并且处于可被安慰诱导物IPTG（异丙基硫代半乳糖苷，与乳糖结构类似但不能被β-半乳糖苷酶降解）诱导的启动子调控之下。
质粒转化的宿主菌为LacZ△M15 基因型（含有编码N-末端缺陷型的β-半乳糖苷酶多肽的基因）。
未重组的质粒转化宿主菌后，在IPTG 的诱导下，质粒与基因组分别表达缺陷但可以相互补偿的两个肽（即α-互补），形成了有功能的β-半乳糖苷酶，该酶能把培养基中无色的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）底物分解成半乳糖和深蓝色的5-溴-4-氯-靛蓝。
然而当外源DNA 插入质粒位于α-肽编码序列中的多克隆位点时，由于破坏了α-肽的阅读框架，因而不能表达出与宿主菌基因组表达的缺陷型β-半乳糖苷酶多肽发生α-互补。
由于没有β-半乳糖苷酶的酶解作用，致使重组菌形成白色菌落。
由此，可以借助蓝白斑很容易筛选出重组子.不过实际操作中发现当插入小片段时，重组子也有形成浅蓝斑的情况.即蓝色菌斑也有可能含外源基因。
据最新报道，大概有30%的假阴性.尽管蓝白斑筛选应用了二十余年，但假阳性和假阴性却经常出现，促使人们不断对分子克隆方法提出改进，并思考着建立新的载体和克隆技术。
但迄今为止，几乎没有一个克隆系统可以保[ ]证不会出现假阳性克隆。
Slilaty SN和Lebel S.研究证明，蓝白斑筛选的载体，通常将插入位点放在LacZ 基因的起始密码子ATG 到第7 个氨基酸密码子之间。
但如果将插入位置改变到LacZ基因的第11-36 个氨基酸密码子之间，那么就可以完全消除假阳性和假阴性。
Genomics One公司正是利用了他们的研究结果开发出TrueBlue技术，同样是蓝白斑筛选，但准确率可达100%。
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蓝白菌菌斑的原理
蓝白菌菌斑的原理
蓝白菌菌斑是一种基因表达筛选技术，通过在细菌中引入外源基因并使其表达蛋白质，再通过染色方法将表达该蛋白质的细菌与未表达该蛋白质的细菌区分开来。
其原理可以分为以下几个步骤：
1. 选择适当的载体：在选择适当的载体（例如质粒）时，通常会使用含有多个限制性内切酶切位点的质粒。
这样可以方便地将外源基因插入到载体上。
2. 插入外源基因：将感兴趣的基因插入到载体的多个限制性内切酶切位点中。
插入的基因可以是任何具有已知或未知功能的基因。
3. 构建蓝白菌：将基因插入载体后，将该载体转化到一种叫做蓝白菌
（Blue-white bacteria）的细菌宿主中。
这种蓝白菌带有一种称为lacZ基因的β-半乳糖苷酶基因，该基因使细菌能够将含有X-半乳糖苷酶底物（例如5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷）的培养基转化成蓝色产物。
4. 筛选蓝白菌斑：在含有X-半乳糖苷酶底物的培养基上培养转化后的蓝白菌，发现能够产生蓝色菌斑的细菌即为表达了外源基因的细菌，而无法产生蓝色菌斑的细菌即为未表达外源基因的细菌。
通过蓝白菌菌斑的原理，可以筛选出表达了特定基因的细菌，这为研究基因功能、
蛋白质相互作用以及药物筛选等提供了一种快速、简便的方法。
蓝白斑筛选lacZ
一、实验目的 筛选的原理和方法
二、蓝白斑筛选的原理
重组质粒转化细菌后，蓝白斑筛选往往是基于抗 生素筛选基础上的第二次筛选。 一般培养转化细菌的培养基中都要加入一定浓度 的适宜抗生素，只有含有质粒载体的细菌才可以生长 形成菌落，即抗生素完成对细菌是否含有质粒载体进 行了初步筛选。 质粒载体上存在的LacZ基因片段当被外源DNA 片段插入时，会产生白色的克隆，不含插入片段的质 粒进入宿主细胞生成蓝色菌落。这就是蓝白斑筛选， 即a-互补显色反应
实验药品 1. 溶液Ⅱ 0.4mol/L NaOH 2%SDS 临用前1:1混合贮存液即为II液. 2. 分离液 酚/氯仿/异戊醇＝25:24:1 3. 1%琼脂糖凝胶
四、实验步骤
分别挑取多个白色菌斑和一个蓝色对照菌斑到1.5ml含有 80μg/ml Kan抗生素的LB 液体培养基 37℃摇培过夜（10~12h） 6000rpm, 3min 弃去上清液，倒立于滤纸之上，尽量去净上清。 短暂离心，收集剩余上清，弹匀至没有明显菌块
这就是蓝白斑筛选即a互补显色反应lacz半乳糖苷酶分解乳糖ipo调控蛋白p大肠杆菌的半乳糖苷酶基因lacz系统a互补显色反应蓝白斑筛选lacz半乳糖苷酶分解乳糖ipo调控蛋白p肽段分解xgal产物呈现蓝色诱导剂iptg半乳糖苷酶基因lacz突变体m15三实验材料器具及药品?实验器具15mlep管离心管架微量取液器台式高速离心机恒温振荡摇床电泳仪紫外透射检测仪
大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统
i P O lacZ
β-半乳糖苷酶
调控蛋白P
分解乳糖
β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15
a-互补显色反应（蓝白斑筛选）
i P O
lacZ
-
蓝白斑筛选法
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【实验原理】
由于克隆用载体pGEM-T Easy Vector带有lacZ的调节序列和 β-半乳糖苷酶的部分编码序列，可以与缺陷型宿主DH 5α在诱 导物IPTG存在下，形成α-互补，宿主菌在含色素底物X-gal的 培养基平板上形成蓝斑；在有外源DNA片段插入到载体多克隆 位点时，就使载体编码β-半乳糖苷酶的部分序列失活，带有重 组质粒的宿主菌产生白斑。为提高筛选的准确性，实验中采取 蓝白斑筛选法。
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X-gal和IPTG的作用
IPTG可诱导缺陷型大肠杆菌DH 5α表达出半乳糖苷酶，该酶 可分解添加于培养基中无色的X-gal成半乳糖和深蓝色的底物5溴-4-氯-靛蓝，使菌落呈现出蓝色反应；在T质粒载体lacZα 序列中，含有一系列不同限制酶的单一识别位点，其中任何一 个位点插入了外源克隆DNA片段，都会阻断半乳糖苷酶的读码 结构，使其编码的α肽失去活性，结果产生出白色的菌落。因 此，根据这种半乳糖苷酶的显色反应，便可检测出含有外源D NA插入序列的重组克隆。
实验材料移液器及吸咀培养皿接种环15ml离心管恒温培养箱水浴锅lb液体培养基蛋白胨8g氯化钠7g酵母5g定容至1000ml用naoh调ph至7576可置20保存高压灭菌lb固体培养基液体培养基中加入15的琼脂15磅30分钟高压灭菌后使用xgal5溴4氯3吲哚d半乳糖xgal溶于nn二甲基甲酰胺中配20mgml原夜20避光保存iptg异丙基d半乳糖苷02gml分装贮存于20氨苄青霉素ampicillin1gampicillin溶于5ml灭菌水中配成母液保存于20转化菌实验原理半乳糖苷酶是一种把乳糖分解成葡萄糖和半乳糖的酶最常用的半乳糖苷酶基因来自大肠杆菌lac操纵子它们使载体中带有大肠杆菌lac操纵子的调节序列和编码半乳糖苷酶n末端146个氨基酸的序列
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加50μl II液，充分混匀
加100μl 酚-氯仿-异戊醇，涡旋振荡，使溶液呈现乳白色
12000rpm, 10min 取10μl 上清液，电泳检测。
实验药品 1. 溶液Ⅱ 0.4mol/L NaOH 2%SDS 临用前1:1混合贮存液即为II液. 2. 分离液 酚/氯仿/异戊醇＝25:24:1 3. 1%琼脂糖凝胶
四实验步骤
分别挑取多个白色菌斑和一个蓝色对照菌斑到1.5ml含有 80μg/ml Kan抗生素的LB 液体培养基 37℃摇培过夜（10~12h） 6000rpm, 3min 弃去上清液，倒立于滤纸之上，尽量去净上清。 短暂离心，收集剩余上清，弹匀至没有明显菌块
阳性克隆的快速检测
一、实验目的 学习蓝白斑筛选试验中阳性克隆的快速 检测方法 掌握蓝白斑筛选的原理和方法
二、蓝白斑筛选的原理
重组质粒转化细菌后，蓝白斑筛选往往是基于抗 生素筛选基础上的第二次筛选。 一般培养转化细菌的培养基中都要加入一定浓度 的适宜抗生素，只有含有质粒载体的细菌才可以生长 形成菌落，即抗生素完成对细菌是否含有质粒载体进 行了初步筛选。 质粒载体上存在的LacZ基因片段当被外源DNA 片段插入时，会产生白色的克隆，不含插入片段的质 粒进入宿主细胞生成蓝色菌落。这就是蓝白斑筛选， 即a-互补显色反应
大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统
i P O lacZ
β-半乳糖苷酶
调控蛋白P
分解乳糖
β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15
a-互补显色反应（蓝白斑筛选）
i P O
lacZ
-
β-半乳糖苷酶
-
调控蛋白P
诱导剂IPTG α-肽段 分解乳糖
分解X-gal
产物呈现蓝色
三、实验材料、器具及药品
实验材料 LB固体培养基上生长的蓝白菌斑 实验器具 1.5ml Ep管，离心管架，微量取液器，台式高速 离心机，恒温振荡摇床，电泳仪，紫外透射检测仪。