(蓝白斑筛选) lacZ - β-半乳糖苷酶
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阳性克隆的快速检测
一、实验目的 学习蓝白斑筛选试验中阳性克隆的快速 检测方法 掌握蓝白斑筛选的原理和方法
二、蓝白斑筛选的原理
重组质粒转化细菌后，蓝白斑筛选往往是基于抗 生素筛选基础上的第二次筛选。 一般培养转化细菌的培养基中都要加入一定浓度 的适宜抗生素，只有含有质粒载体的细菌才可以生长 形成菌落，即抗生素完成对细菌是否含有质粒载体进 行了初步筛选。 质粒载体上存在的LacZ基因片段当被外源DNA 片段插入时，会产生白色的克隆，不含插入片段的质 粒进入宿主细胞生成蓝色菌落。这就是蓝白斑筛选， 即a-互补显色反应
大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统
i P O lacZ
β-半乳糖苷酶
调控蛋白P
分解乳糖
β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15
a-互补显色反应（蓝白斑筛选）
i P O
lacZ
-Hale Waihona Puke Baidu
β-半乳糖苷酶
-
调控蛋白P
诱导剂IPTG α-肽段 分解乳糖
分解X-gal
产物呈现蓝色
三、实验材料、器具及药品
实验材料 LB固体培养基上生长的蓝白菌斑 实验器具 1.5ml Ep管，离心管架，微量取液器，台式高速 离心机，恒温振荡摇床，电泳仪，紫外透射检测仪。
加50μl II液，充分混匀
加100μl 酚-氯仿-异戊醇，涡旋振荡，使溶液呈现乳白色
12000rpm, 10min 取10μl 上清液，电泳检测。
实验药品 1. 溶液Ⅱ 0.4mol/L NaOH 2%SDS 临用前1:1混合贮存液即为II液. 2. 分离液 酚/氯仿/异戊醇＝25:24:1 3. 1%琼脂糖凝胶
四、实验步骤
分别挑取多个白色菌斑和一个蓝色对照菌斑到1.5ml含有 80μg/ml Kan抗生素的LB 液体培养基 37℃摇培过夜（10~12h） 6000rpm, 3min 弃去上清液，倒立于滤纸之上，尽量去净上清。 短暂离心，收集剩余上清，弹匀至没有明显菌块
一、实验目的 学习蓝白斑筛选试验中阳性克隆的快速 检测方法 掌握蓝白斑筛选的原理和方法
二、蓝白斑筛选的原理
重组质粒转化细菌后，蓝白斑筛选往往是基于抗 生素筛选基础上的第二次筛选。 一般培养转化细菌的培养基中都要加入一定浓度 的适宜抗生素，只有含有质粒载体的细菌才可以生长 形成菌落，即抗生素完成对细菌是否含有质粒载体进 行了初步筛选。 质粒载体上存在的LacZ基因片段当被外源DNA 片段插入时，会产生白色的克隆，不含插入片段的质 粒进入宿主细胞生成蓝色菌落。这就是蓝白斑筛选， 即a-互补显色反应
大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因lacZ系统
i P O lacZ
β-半乳糖苷酶
调控蛋白P
分解乳糖
β-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15
a-互补显色反应（蓝白斑筛选）
i P O
lacZ
-Hale Waihona Puke Baidu
β-半乳糖苷酶
-
调控蛋白P
诱导剂IPTG α-肽段 分解乳糖
分解X-gal
产物呈现蓝色
三、实验材料、器具及药品
实验材料 LB固体培养基上生长的蓝白菌斑 实验器具 1.5ml Ep管，离心管架，微量取液器，台式高速 离心机，恒温振荡摇床，电泳仪，紫外透射检测仪。
加50μl II液，充分混匀
加100μl 酚-氯仿-异戊醇，涡旋振荡，使溶液呈现乳白色
12000rpm, 10min 取10μl 上清液，电泳检测。
实验药品 1. 溶液Ⅱ 0.4mol/L NaOH 2%SDS 临用前1:1混合贮存液即为II液. 2. 分离液 酚/氯仿/异戊醇＝25:24:1 3. 1%琼脂糖凝胶
四、实验步骤
分别挑取多个白色菌斑和一个蓝色对照菌斑到1.5ml含有 80μg/ml Kan抗生素的LB 液体培养基 37℃摇培过夜（10~12h） 6000rpm, 3min 弃去上清液，倒立于滤纸之上，尽量去净上清。 短暂离心，收集剩余上清，弹匀至没有明显菌块