猪繁殖_呼吸道综合征病毒_PRRSV_CH_1a株基因型鉴定

第18卷第2期中 国 兽 医 学 报Vol.18,No.2 1998年3月Chinese　Journal　of　Veter inary　Science M arch1998猪繁殖-呼吸道综合征病毒(PRRSV)CH-1a株基因型鉴定仇华吉　郭宝清　童光志*　刘文兴　于　力　(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,哈尔滨150001)摘要　根据猪繁殖-呼吸道综合征病毒(P RRSV)美洲型毒株和欧洲型毒株的基因组序列设计合成了2对引物,即1008P S/1009PR和1010PL S/1011P L R。

我国分离的CH-1a株用这2对引物均能扩增出与预期大小相符的RT-PCR产物,分别与美洲型代表株(V R-2332)的RT-P CR产物大小相当。

特异性试验表明,这2对引物均不能扩增其他常见的繁殖障碍相关病毒的RN A或DN A以及未感染的M A RC-145细胞R N A。

间接免疫荧光试验也证明,CH-1a株与P RRSV核衣壳蛋白特异性单克隆抗体以及美洲型毒株抗血清均呈阳性反应。

因此初步证实CH-1a株为美洲型P RRSV。

关键词　猪繁殖-呼吸道综合征病毒　RT-P CR　基因型中图分类号　S852.65　Q78 近年来,猪繁殖-呼吸道综合征(porcine re-pro ductive and r espiratory syndr ome,PRRS)在亚太国家和地区呈蔓延之势[1～3]。

在国内,原因不明的猪繁殖障碍综合征早已存在,并造成重大经济损失。

1996年,郭宝清等[4]从国内疑似PRRS 流产胎儿分离出PRRS的病原PRRS病毒(PRRSV),首次确认了PRRS在中国大陆的存在。

PRRSV为单股正链RNA病毒,其基因组含有8个开放阅读框架(ORF)[5],其中ORF7编码保守的15000核衣壳蛋白(N)[6]。

PRRSV分离株间存在很大变异,可区分为2种基因型,即欧洲型(代表株为Lely stad病毒,LV)和美洲型(代表株为AT CC VR-2332株)。

CH-1a株系从暴发PRRS的国内某猪场分离的一株PRRSV。

为了确定国内毒株的基因型类型,以便为PRRS的诊断与防制提供依据,我们应用RT-PCR对PRRSV CH-1a株进行了鉴定,并结合间接免疫荧光(IIF)试验证实了CH-1a株属于美洲型。

1　材料与方法1.1　病毒　PRRSV AT CC VR-2332株和LV *通讯作者 本文收到日期:1996-09-09株(分别由Dr D A Benfield和Dr G W ensv oort 惠赠),分别用作美洲型和欧洲型参考毒株;CH-1a株由本所分离,按已报道的方法用M ARC-145细胞(由Benfield惠赠)培养[7]。

猪瘟病毒(HCV)石门株(由黄骏明副研究员惠赠)、猪伪狂犬病病毒(PrV)Bartha株(由李亚香副研究员惠赠),分别用作RN A病毒和DNA病毒对照毒株。

1.2　RT-PCR1.2.1　RNA抽提　病毒培养物收毒后冻融3次,以6300r/min4℃离心30m in(Beckman JA 20.1转子),弃沉淀,上清液以27000r/min4℃离心2h(Beckman WS-28转子),弃上清,病毒粒子沉淀(除PrV核酸选用DNA抽提法外)均用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法[8]抽提病毒RNA, RNA悬浮于DEPC处理水中。

1.2.2　引物　根据PRRSV IAF-ex p91株(美洲型)基因组ORF7序列设计1对引物1008PS/ 1009PR,上游1008PS序列为5′TAAAT AT GC-CAAAAACAAC3′,下游1009PR序列为5′T AGGTGACT TAGAGGCACA3′,预期扩增产物大小为468bp。

根据PRRSV LV株基因组3′末端序列设计1对引物1010PLS/1011PLR,上游1010PLS序列为5′AT GGCCAGCCAGTC-AAT CA3′,下游1011PLR序列为5′TCGCCC-TAAT T GAAT AGGT G3′,预期扩增产物为433bp。

1.2.3　反转录(RT)　总RNA10L L加25 pm ol/L下游引物,70℃变性10min,立即冰浴致冷。

cDNA合成反应为50L L,含1×cDNA第一链缓冲液、10mmol/L DT T、1m mol/L各dNT P、400U鼠源反转录酶(Life Technolog ies, Inc产品)和40U RNasin(华美公司产品),37℃温育1h。

反转录产物94℃加热5min灭活反转录酶。

1.2.4　PCR　PCR反应总体积为50L L,含cD-NA10L L、1×PCR缓冲液、0.2m mol/L dNTP、上下游引物25pmo l/L、1U T aq酶(原平公司产品),加一层石蜡油,按下列程序进行PCR反应: 95℃5min,94℃1min,55℃1min,72℃2min,共35个循环;72℃延伸10min。

PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检查,紫灯下观察、照相。

1.3　间接免疫荧光(IIF)试验　用PRRSV AT CC VR-2332株、NVSL株(由Dr M L Frey 惠赠)和CH-1a株分别接种M ARC-145细胞,出现CPE后,制备细胞涂片,用针对N蛋白保守表位的单抗SDDW-17(由Benfield惠赠)、VR-2332和NVSL抗血清以及HCV、PrV、PPV和HEV 抗血清,按以往的方法[9]进行IIF试验。

2　结果2.1　RT-PCR　CH-1a株、VR-2332株用2套引物均能扩增出预期大小的RT-PCR产物,并且产物大小分别相近;而对LV株,仅1010PLS/ 1011PLR能扩增出预期大小的产物,1008PS/ 1009PR则无特异性扩增条带;HCV、PrV及未接种的M ARC-145细胞用RT-PCR检验均无扩增产物(附图),表明CH-1a与VR-2332的基因组具有很高的同源性。

2.2　IIF　单抗SDOW-17以1∶5000稀释对CH-1a、VR-2332和NVSL细胞培养物进行IIF 检测,均呈强阳性胞浆荧光,对照细胞(未接种的M ARC-145细胞)则为阴性,表明该单抗可识别PRRSV2种基因型的保守性抗原表位;用V R-2332和NVSL抗血清对CH-1a进行IIF试验,间接免疫荧光滴度均达1∶80,而PrV、HCV、PPV 和HEV抗血清对CH-1a和未接种的M ARC-145细胞用IIF试验均呈阴性(附表),表明CH-1a与美洲型毒株有共同抗原。

附图　PRR SV CH-1a、VR-2332、L V株及HCV、P rV和未接种的M A R C-145细胞用引物对1008P S/1009PR和1010PL S/1011P L R的RT-PCR结果1.100bp DN A L adder(Gibco BR L);2.CH-1a1010PL S/1011PL R; 3.CH-1a1008P S/1009PR;4.V R-23321010PL S/1011PL R;5.VR-23321008PS/1009P R; 6.L V1010PL S/1011P LR;7.LV1008P S/1009P R;8.HCV1010P L S/1011PL R;9.Pr V1010P L S/1011PL R;10.M A RC-145细胞1010PL S/1011P L R;11.ddH2O1010PL S/1011PL R;12.100bp D NA L adder附表　PRRSV SDOW-17单抗及VR-2332、NVSL、HCV、PrV、PPV和HEV抗血清用IIF试验对CH-1a、VR-2332和NVSL及未接种的M ARC-145细胞试验结果单抗或抗血清CH-1a VR-2332NVS L对照细胞S DOW-17(1∶5000)###-VR-2332抗血清1∶801∶801∶80-NVSL抗血清1∶801∶801∶80-HCV抗血清--PrV抗血清--PPV抗血清--HEV抗血清--3　讨论 RT-PCR以其敏感特异、快速简便的优点而被广泛用于RNA病毒的检测[10～12]。

该方法不仅可以用于PRRSV的检测[13,14],而且根据引物的特异性还可用来鉴定PRRSV的基因型。

本研究所用的引物1008PS/1009PR是根据IAF-ex p91株(美洲型)基因组N基因设计合成的,用它只能扩增美洲型ORF7片段,而不能扩增欧洲型119第2期仇华吉等:猪繁殖-呼吸道综合征病毒(PRR SV)CH-1a株基因型鉴定ORF7片段,具有型特异性;1010PLS/1011PLR 是根据LV株3′末端ORF7的保守序列设计的,它兼能扩增美洲型和欧洲型毒株的特定序列,因而具有通用性。

2套引物合并应用,可用于PRRSV分离株的基因型鉴定。

根据RT-PCR试验结果,可以确定CH-1a株属于美洲型。

据报道[15],欧洲型与美洲型毒株间存在相当大的抗原差异。

美洲型毒株虽与欧洲型毒株抗血清有交叉反应,但与之相反的是,欧洲型毒株与美洲型毒株抗血清不发生交叉反应。

IIF试验结果显示,CH-1a株与美洲型毒株的抗血清有交叉反应,这从另一方面佐证了上述结论。

PRRSV是如何传入我国的尚不清楚。

根据本研究结果推测,国内毒株与美洲毒株有很高的同源性,很可能来自北美洲,这与我国同该地区频繁的贸易往来和密切的人员互访有极大关系。

尚需进一步探讨国内毒株与美洲毒株的分子病毒学关系。

今后我国PRRS的检测与防制应重点针对美洲型毒株采取相应措施,并加强对欧洲地区输入产品的检疫,防止欧洲型毒株的传入而使PRRS防疫工作复杂化。

(本研究得到阎玉河博士、张绍杰硕士、王柳助理研究员、王玫同志、王莉同志和张伟华硕士的大力支持,谨致谢忱)参　考　文　献1　Wensvo or t G.P or cine r epr oduct ive and r espirato r y sy ndr ome.In:P ro ceeding s of the13th Inter na tio nal P ig V et erinar y So ciety Co ngr ess.1994.11～142　Chang C C.Po rcine r epr oduct ive and r espirato ry sy n-dro me in T aiwa n.J Chin So ci V et Sci,1993,19(4): 268～2703　Shimizu M.Isolatio n of repr oductive a nd r espirato r y sy ndr ome v ir us fr om pigs w it h Heko Heko disease.J V et M ed Sci,1995,56(12):389～3914　郭宝清,陈章水,刘文兴等.从疑似PR RS流产胎儿分离PRR SV的研究.中国畜禽传染病,1996,2:1～4 5　M eulenber g J J M,Hulst M M,De M ijer E J et al.L elystad virus,the causative agent of por cine epidem-ic abor tio n and r espir ato ry syndro me(P EAR S),isr elated t o L DV and EA V.V ir olo gy,1993,192:62～726　M eulenberg J J M,Besten A P,De K luy ver E P et al.Char acterizat ion of pro teins encoded by O RF s2t o 7of L elystad virus.V ir olo gy,1995,206:155～163 7　Kim H S,K w ang J,Yo on I J et al.Enhanced replica-tion of po rcine repr oductive and respir ato ry sy ndro m (PR RS)v ir us in a homo geneous subpo pulatio n of M A104cell line.A rch V ir io l,1993,133:477～483 8　Chomczynsky P Y,Sacchi N.Sing le-step method of R N A isolatio n by acid g uanidium thio cy anate-phenol-chlor ofo rm ex traction.A nal Bio chem,1987,162: 156～1599　郭宝清,陈章水,刘文兴等.应用间接免疫荧光法从国内生殖障碍综合征猪群中检测P RRS阳性抗体的研究.中国兽医科技,1996,26(3):3～510　A ndr easo n J R Jr,Jackw o od M W,Hilt D A.Po ly-merase chain r eact ion amplification of t he genome of infectio us bro nchitis virus.A v ian Dis,1991,35: 216～22011　Chirnside E D,Spaan W J M.Rever se t ranscription and cDN A amplification by the poly merase chain r e-actio n of equine art erit is vir us(EAV).J Viral M etho ds,1990,30:133～14012　Hy ypia T,Auv inen P,M aa ro nen M.Poly merase chain r eactio n fo r human picor nav ir uses.J Gen Vi-ro l,1989,70:3261～326813　Su′a r ez P,Zardoy a R,Pr ieto C et al.Dir ect detec-tio n of the por cine r epr oduct ive and respir ato ry sy n-dr ome(PR RS)v ir us by r ever se tr anscr iption po ly-merase chain r eactio n(RT-PCR).A r ch V iro l, 1994,135:89～9914　M ar dassi H,Wilson L,M ounir S et al.Detectio n of por cine repr oductive and r espir ato ry syndro me v irus and efficient differentiatio n betw een Canadian and Euro pean str ains by r ever se t ranscription and P CR amplificatio n.J Clin M icr obio,1994,32:2197～220315　Wensvo or t G,D e K luy ver E P,L uijtze E A et al.A nt ig enic compar ison of L ely st ad virus a nd sw ine in-fertility and respira tor y syndr om e v ir us.J V et Diagn Invest,1992,4:134～138120中 国 兽 医 学 报1998年Genotyping of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Strain CH -1a Isolated in China by RT -PCR and Indirect Im -munofluorescence TestQiu Huaji Guo Baoqing To ng Guangzhi *　Liu Wenx ing Yu Li(State K ey L ab o f V et B iotechnology ,H arbin V et Res Inst ,CA AS ,H arbin 150001) Abstract CH-1a iso lated from an outbreak of PRRS in a pig farm in China.T w o sets of olig onu-cleotide primers ,1008PS /1009PR and 1010PLS /1011PLR w ere desig ned acco rding to the sequences of PRRSV strain IAF -exp 91and LV (Euro pean pro to ty pe )to determine the g enotype of the PRRSV strain.The r esults show ed that PRRSV strain CH-1a could be amplified using either primer pair by RT -PCR,yielding a sing le band of the predicted size after agarose gel electrophor esis,to be sim ilar in size to the products of str ain VR -2332.No amplification w as o bser ved w hen RNAs w er e ex tracted fr om hog cholera virus (HCV )and uninfected M ARC-145cells or DNAs from pseudorabies virus (PrV).MA RC-145cells infected with strain CH-1a w ere show n to r eact w ith antiser a against strains VR-2332and NVSL (Am er ican isolate)by indirect imm unofluorescence staining.Thus,it is conclud-ed that the Chinese PRRSV strain CH -1a belong s to Am er ican genotype . Key words PRRSV;RT -PCR;g enotype *cor r esp onding author121第2期仇华吉等:猪繁殖-呼吸道综合征病毒(PRR SV )CH -1a 株基因型鉴定。