(整理)外周血染色体制备及分析

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人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析

人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。

单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。

由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。

Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。

必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。

2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。

常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。

低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。

低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。

实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。

②用于显带染色时能充分显示带型特点。

低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。

2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。

肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。

2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。

是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。

外周血染色体制备

?染色体是在有丝分裂或减数分裂时遗传物质存在的特定形式是间期细胞染色质结构紧密组装的结果
一、染色体的概念及结构特点
• 染色体是在有丝分裂（或减数分裂）时遗传物质存在的特定形式，是间期细胞染色质结构紧密组装的结果。
• 主要结构有着丝粒、主缢痕、次缢痕、随体、端粒和核仁组织区。
• 主要功能原件有自主复制DNA、着丝粒DNA、端粒DNA。
• 低渗处理:将培养物倒入15ml离心管中，以1500r/m离心 10分钟，去上清液后加入8ml预热的低渗液，混匀后放入37℃培养箱中低渗处理半小时。
• 预固定：加入1 mL新配制的固定液，轻轻混匀后以 1500r/m离心10分钟。
三、外周血细胞染色体标本的制备
• 固定:吸去上清液，加入8 mL新配制的固定液，充分混匀室温固定半小时后离心沉淀细胞。重复固定2次，每次半小时。
• 染色体制片：固定好的细胞以1500r/m离心10分钟，吸去上清液，加入约0.2ml新的固定液，充分混匀。取浸泡在冰水中的载玻片，以每张载玻片2-3滴细胞悬液进行滴片。置78℃干燥后，室温保存。
谢谢！
二、外周血细胞培养的方法
• 培养基：RPMI-1640营养液、胎牛血清、青链霉素、植物血凝素。
• 接种前加入0.4%肝素抗凝。 • 每5ml培养基中接种约0.4ml静脉血。 • 37℃，5%二氧化
• 秋水仙素处理:收获前加入终浓度0.1ug/ml秋水仙素继续培养2-3小时。

人类外周血染色体标本制备及G带观察及核型分析

实验报告课程名称：分子医学实验指导老师：成绩：实验名称：人类外周血染色体标本制备G 带观察及核型分析同组学生姓名：一、实验目的及原理三、实验结果二、操作步骤四、讨论分析一、实验目的及原理熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法。

初步掌握人类染色体标本培养和制备的基本方法。

通过实验掌握Ｇ带标本制备的基本方法，学会在显微镜下直接观察G 带分裂相。

在细胞周期的不同阶段，染色体的结构不同，在细胞分裂间期，染色体呈现细长的丝状结构，分散于细胞核中，且交织成网状，难以识别其数目和每个染色体特有的结构；在细胞有丝分裂中期,染色体凝缩形成短的棒状结构，排列在赤道板上，此时染色体的形态、数目最清楚，所以一般选择有丝分裂中期的细胞来观察染色体的形态、数目。

在人类遗传分析中，普遍采用外周血培养的方法制备染色体标本。

但是在正常情况下，外周血中的淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，因而外周血细胞中是没有分裂相的。

在细胞培养过程中加入植物血凝素(phytohaemagglutinin, PHA) ，可以刺激外周血淋巴细胞转变为淋巴母细胞，进行有丝分裂，再通过秋水仙素处理，将细胞阻断在有丝分离中期。

再通过离心、低渗、固定和滴片，就可以获得大量有丝分裂相。

最后通过染色就可以观察染色体的结构和数目。

本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。

有许多显示Ｇ带的方法，最常用的是将已经过老化的染色体制片放到37℃胰酶中进行处理，然后用Giemsa 染色。

胰酶可以从染色体上抽取蛋白特定的组成部分。

通过胰酶处理使Ｇ带区的疏水蛋白被除去或使它们构型变为更疏水状态。

由此可见在Ｇ带区中抽取的蛋白往往是疏水蛋白。

关于显带机理有多种论点，总的来说，还不能完全解释显带的机理问题。

二、操作步骤人类外周血染色体标本制备１、采血２、培养RPMI1640培养液，37℃ 0.5℃恒温中培养72小时。

3、秋水仙素(colchicine)处理在终止培养前２-３小时，加入秋水仙素。

外周血染色体标本制作

二、实验原理
因此，可采取少量外周静脉血，做短期培养，培养至72小时细胞进入增殖旺盛期，此时加入秋水仙素抑制细胞分裂，使细胞分裂停止在中期以获得足够量的分裂期细胞，经低渗、固定、制片、染色后镜下观察进行核型分析。上述制备的染色体标本经胰蛋白酶消化、 Giemsa染色后，可在染色体纵轴上显示出着色深、浅相间的横纹——带，表明每条染色体的特征。
• 最后，理想的固定剂还应能有助于达到优良的染色效果，即能增强染色体的嗜碱性。例如，甲醛虽具有优良固定剂的其它所有特性，但却会降低染色体的嗜碱性，所以不能单独用作染色体的固定剂。 • 显而易见，没有哪一种化学物能同时具备以上这些条件，因而通常是将数种可以共存的液体混合起来，使之成为染色体研究中真正有效的固定剂。尽管如此，那怕是最佳固定剂仍难免有不足之处。首先，细胞被杀死后发生的基本变化很难予以避免；其次，可能会抽提出一些弥散成分；最后即使操作十分谨慎，仍难以保持酶活性不变；此外，某些化学物还会导致细胞的皱缩。
3.2固定液的种类
• 醋酸 • 作为混合固定液的一种成分，醋酸的优点在于：（1）可以与已知的任何一种固定剂同时使用，并且可以和任意比例的水、乙醇或甲醇混合；（2）浓度可以很低（1%）也可以很高（99%）；（3）具有很强的穿透性能，比乙醇的穿透性还高。 • 醋酸能使核酸沉淀使组蛋白溶解，但却不能固定细胞质蛋白。在染色体结构的研究中，醋酸的主要用途是阻止染色体收缩，使染色体的结构免于被破坏。经醋酸固定的物质还能抵销乙醇的硬化作用。
细胞的膨胀和染色体的皱缩是决定固定剂质量的两个重要因素。以往曾认为渗透压是促使细胞内结构膨胀或破坏的决定性因索，为此选用等渗液作为固定剂，其实这种看法是不正确的。事实证明，稀释的醋酸具有20个大气压，照常可使细胞和组织膨胀，而只有2.5个大气压的苦味酸却可使组织大大地收缩。这提示一种固定剂的效果如何与渗透压的关系很小。另一方面，苦味酸使蛋白质沉淀的作用很强而醋酸却没有这一作用。可见，使蛋白质沉淀这一特性在导致染色体收缩方面可能起重要作用。因此，在选用哪些化学物作为固定剂时，需要权衡以上这些因素。

人类外周血染色体标本制备及核型分析

100毫升生理盐水中。高压灭菌，冰箱保存备用。
3 、 KCl ： 0.075M ， 0.559 克氯化钾溶于 100 毫升双蒸水中。
4 、秋水仙素： 10 微克 / 毫升，作为有丝分裂的阻止剂，
抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停止在中期。称 10
毫克秋水仙素溶于100毫升生理盐水中，配成100微克/毫升的
人类染色体核型分析
一、实验目的
通过实验掌握染色体核型分析的常用方法以及G带的带型
特征和识别技巧，初步学会识别G带染色体。二、实验原理将一个细胞内的染色体按照一定的顺序排列起来构成的图像就称之为该细胞的核型(karyotype)。核型分析有多种方法，如G带，R带、C带等。将染色体标本用显带方法处理后，再用Giemsa染色，这类技术就称为G分带，通过显微摄影，
10、再固定，加入5mL固定液（甲醇：冰醋酸=1：3），室温固定
10-15分钟
11、再离心 1000转/分离心10分钟，弃去上清液。 12、再固定加入固定液（甲醇：冰醋酸1：1）5mL,打匀，固定 10－15分钟。 13、制片
固定后，1000转/分离心留下0.2ml沉淀物，吸取细胞悬液滴
在已用冰水浸泡的洁净载玻片上，立即用嘴吹散，在洒精灯焰上通过几次，使细胞平铺于载玻片上，空气干燥（air drying）。
体遗传学命名的国际体制
（ISCN）排列编号。粘贴时短臂向上，长臂向下。 3．在分析结果中，写出该细胞的核型式，注明性染色体。
PHA、灭活小牛血清和双抗。
3 、接种的血样愈新鲜愈好，最好在 24 小时内培养。如果
不能立刻培养，应置于4℃冰箱，保存时间过久会影响细胞活力。
4、温度和培养液的酸碱度十分重要。人的外周血中淋巴细胞培养最适温度为37℃0.5℃，温度过高过低都将影响细胞的生长，但细胞对低温比对高温耐受力强；若是中途停电，可相应延长培

人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案

实验方案实验外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析一、实验目的1、了解动物细胞培养的方法。

掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。

2、初步掌握人类染色体G－带的显示方法及人类染色体G－带在染色体识别中的意义。

3、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。

初步掌握人类染色体G带的特征及其识别。

二、实验原理所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。

用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去，最后以气干法制片，可获得较好的染色体养基中进行培养。

人类外周血细胞本来是终末分化细胞，一般没有分裂能力，但经PHA（植物血球凝集素）或ConA等药物刺激后，转变成可分裂的转化细胞。

染色体显带是将染色体标本经过一定程序处理，并用特定染料染色，使染色体沿其长轴显现明暗或深浅相间的横行带纹――染色体带，这种技术，称为染色体显带技术。

通过显带，人们可以准确地识别每一条染色体及染色体上的各个区段，并可发现染色体上较细微的结构变化。

在所有的显带技术中，G显带（G banding）是最常见的显带技术，它是将染色体标本用碱、胰蛋白酶或其它盐溶液处理后，再用Giemsa染液染色，在普通显微镜下，可见深浅相间的带纹，称G带（G band）。

G显带方法简便，带纹清晰，染色体标本可以长期保存，因此被广泛用于染色体病的诊断和研究。

正常人类染色体的数目为46条(23对)，1960年的Denver会议和1963年的London会议制定了统一的人类染色体命名体制：按照染色体的相对长度、臂比和着丝粒指数，将常染色体（22对）按大小用阿拉伯数字标记，顺次排列为1～22号，性染色体用X和Y标记；并按染色体大小和着丝粒位置，把人类染色体分为七个组，用大写字母A～G表示。

染色体经显带处理后，每条染色体都显示出其特定的带纹特征（见下表）。

外周血淋巴细胞染色体制备与分析技术规范

外周血染色体制备与分析技术规范原理：在正常情况下，人外周血中是没有分裂相的，只有在异常情况下才能发现。

植物血球凝集素（PHA）是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂，在PHA作用下，原处于Go期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。

利用PHA这一特性，淋巴细胞经过含有HPA培养液培养，在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体，终止分裂中期的淋巴细胞，例可得到所需的人体染色体图形。

具有用血量少、操作简单等优点。

1、实验材料2.5%碘酒、75%酒精、无菌棉签或棉球、镊子、吸管、培养瓶、培养液（PRMI 1640、M199）、小牛血清、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、载玻片等。

2、培养液配制无菌条件下配制培养液，每瓶所含下列试剂：RPMI 1640或199 90%小牛血清 10%PHA（自制） 0.1ml 3%肝素 10u/ml 2%双抗 100u/ml（选择）分装于10ml培养瓶内，每瓶5ml培养液，封口置冷藏柜备用。

3、植物油凝素的制备植物血凝素也称为植物凝集素（PHA），可自制也可购自商品。

自制的方法常用生理盐水提取法。

（A）干品制备法（1）选广东鸡子豆10g，用蒸馏水冲洗，置培养皿内用75%酒精一次性浸洗，倒掉酒精留间隙置37℃。

恒温箱内24-48小时；（2）在无菌条件下研碎鸡子豆，加生理盐水30ml，摇匀后放入4℃冰箱24小时，第二天再加生理盐水70ml，再置4℃冰箱内24小时。

每8-12小时摇荡一次。

（也可一次性加100ml生理盐水）；（3）无菌条件下移入10-50ml离心管内，3000-4000rpm30分钟。

在无菌箱内把上清液分装于10ml小瓶，置冰箱冷冻层备用；（4）效价：外周血染色体制备每100ml培养基加PHA约2ml。

注：若整个过程未在无菌条件下进行，分装时用G5玻砂漏斗除菌即可。

（B）鲜品制备法：（1）选择完整无破皮鲜菜豆20g，用75%酒精浸泡10分钟；（2）在净化工作中用无菌盐水或蒸馏水漂洗二次，然后置无菌乳钵中捣成糊状，用100ml无菌盐水浸泡封口；（3）移入4℃冰箱中置24小时，中间摇动数次，次日3000rpm30分钟，在无菌情况下分装上清液于10ml小瓶内，置冰箱冷冻层备用。

外周血染色体标本制作

染色体制备技术
01
02
03
低渗处理
通过低渗处理使细胞膨胀，促使细胞膜变软，以便于染色体的分离和制备。
固定剂使用
使用固定剂如甲醇和冰醋酸对细胞进行固定，以保持染色体的形态和稳定性。
细胞离心与洗涤
通过离心将细胞与培养基分离，并使用洗涤液去除杂质，得到纯净的染色体标本。
染色与计数方法
染色体染色
采用吉姆萨染色或瑞氏染色等方法对染色体进行染色，以便于观察和计数。
计数规则
遵循特定的染色体计数规则，如根据染色体的形态、大小、着丝粒位置等进行计数。
图像分析系统
采用图像分析系统对染色体进行数字化分析，提高计数准确性和效率。
质量控制与标准化
操作规范
制定严格的操作规范，确保染色体标本制作的每一步都符合标准要求。
诊断信息。
失败案例分析
案例一
某医院在制作外周血染色体标本时，由于采血量不足，导致制片过程中出现了染色体断裂、重叠等现象，最终无法提供准确的诊断结果。
案例二
某实验室在制作外周血染色体标本时，由于抗凝剂配比不当，导致制片过程中出现了染色体凝集、溶解等现象，同样无法提供准确的诊断结果。
经验教训与改进建议
• 经验教训：成功和失败的案例都表明，制作外周血染色体标本需要严格遵守操作规程，注重细节处理，如采血量的控制、抗凝剂的配比等。同时，要不断提高技术水平，加强质量监控，确保制片效果符合临床诊断的要求。
经验教训与改进建议
01
改进建议
02
加强技术培训和交流，提高操作人员的技能水平；
03
建立完善的质量监控体系，对每个环节进行严格把关；
03 关键技术及注意事项

外周血染色体标本的制备法

附件一外周血染色体标本的制备法该法是制备各种染色体标本的基础。

一、操作过程：1、采血：先在采血者肘部用碘酒棉球及酒精棉球消毒皮肤，再取2毫升干燥灭菌注射器，配上针头（6～7号），并吸取0.2%的肝素液（Heparin）0.2毫升，湿润针筒。

再从肘部静脉采血0.7～1毫升，轻轻转动针筒，使之与肝素混匀。

2、培养：拔去抽血用针头，立即插入灭菌试管内，送入无菌操作箱（此时操作者必须用肥皂洗刷双手，并用自来水冲洗干净，然后双手进入无菌操作箱，依次用碘酒及酒精棉球消毒双手，在火焰旁将血液平均滴入2～3个已盛好培养基的小瓶内（培养基的组合：RPMI 1640或Eagle或M 199毫升，小牛血清1毫升，PHA 5毫克，用5%NaHCO3调pH至7.0～7.4），盖上翻口瓶盖，轻轻摇动。

如到外地采血培养亦可因地制宜，无需在无菌操作箱内接种，方法是：抽血完毕，转动针筒，将血液与肝素混匀，拔去针头，重新换上灭菌注射针头，将血液直接从翻口橡皮塞（用碘酒及酒精棉班干部消毒）上插入，将血液缓缓滴入培养瓶内，轻轻摇动，置370C温箱中培养66～72小时。

秋水仙素（Colchieine）处理：在终止培养前4～6小时，将事先配制好的0.01%秋水仙素1滴（每毫升50滴约2μg）加入培养瓶内，轻轻摇动，放回温箱中，继续培养4～6小时，这样使细胞分裂停止在中期。

4、离心：用吸管吸取培养物，并移入刻度离心管内，以1000转/分离心8分钟，吸去上清液，留底层离心沉淀物。

5、低渗处理：加5毫升预温（370C）的0.75M KCI低渗液，用吸管打匀使细胞悬浮于低渗液中，仍放回370C温箱中，静止15分钟。

这样使白细胞膨胀，染色体分散，红细胞解体。

6、预固定：在低渗15分钟后，加固定剂（冰醋酸:甲醇，1:3）1毫升，打匀。

7、再离心：为了收集细胞，以1000转/分离心8分钟，然后吸去上层液，保留沉淀物。

8、固定：沿离心管管壁加入新配制固定液（甲醇:冰醋酸，3:1）5毫升，过5分钟后，用吸管将底部沉淀物轻轻打匀，继续固定30分钟。

人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案 (1)

人体外周血淋巴细胞培养及染色体组型分析实验方案2012级师范2班第3组组员：吴婵胡颖月央珍杨基伟杨青松宋海燕田金梅（组长）一、实验目的掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体组型分析的方法。

二、实验原理人的1ml外周血约含有1×10*6~3×10*6个小淋巴细胞，它们几乎都处于G0或G1期，一般情况下不分裂，但但采用人工离体培养的方法，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，能转变成可分裂的淋巴母细胞进行有丝分裂。

所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。

用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理，使其中的红细胞及分裂相细胞膜和一部分细胞质除去然后用Carnoy固定液固定，最后以气干法制片，可获得较好的染色体标本。

核型（karyotype）指一个细胞中的整套染色体，按其大小、形态特征顺序排列所构成的图像。

通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。

在完全正常的情况下，一个体细胞的核型一般可代表该个体的核型。

组型（idiogram)是以模式图的方式表示，它是通过许多细胞染色体的测量取其平均值绘制成的，是理想的，模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。

将待测细胞的核型进行染色体数目、形态特性的分析，确定其是否与正常核型完全一致，称为核型分析（karyotype analysis）。

这对于探索人类遗传病的发病机理，探讨动物和植物的起源，以及物种间的亲缘关系等都具有重要意义。

染色体的特征以有丝分裂中期最为显著，所以一般都分析中期分裂相。

根据染色体着丝粒位置可将染色体分为中部着丝粒染色体（m）,亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝力粒染色体（st)，端部着丝力粒染色体（t）。

对于任何一个的基本形态特征来说，重要的参数有以下3个：（1）相对长度=单条染色体的长度/(单倍体常染色体+X或Y染色体)的总长度×100%（2）臂指数=长臂/短臂（反映着丝粒位置的指数）（3）着丝粒指数=短臂/整个染色体长度×100%（反映着丝粒位置的指数）人类体细胞的正常核型是含有23对染色体，共46条。

人体外周血淋巴细胞染色体制备与观察实验方案_百度文库.

第四大组实验方案外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备，染色体组型分析一、实验目的1.了解动物细胞培养的方法。

2.掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。

3.学会对人类染色体的组型分析。

二、实验原理所谓外周血培养即是将外周血接种在适当的培养物中加入适量的秋水仙素，使纺锤体微管解聚，这样细胞停留在中期，可以获得大量的分裂细胞。

经过短期的培养后，用低渗盐溶液（一般是0.075mol/L的KCl）处理细胞，使细胞胀大而不破裂使最后的子染色体充分散开，滴片后再以空气干燥法制片，可获得质量较好的染色体标本。

人类外周血细胞几乎都处于G0期和G1期，一般情况不分裂，但在离体培养中，经PHA（植物血球凝集素）刺激后，可转变成可分裂的转化细胞。

核型是指一个细胞内的整套染色体按照一定的顺序排列起来所构成的图像。

通常是将显微摄影得到的染色体照片剪贴而成。

正常的核型能代表个体的核型。

组型是以模式图的方式表示，它是通过多许多细胞染色体的测量取其平均值制成的，是理想的、模式化的染色体组成，代表一物种染色体组型的特征。

染色体的特征以中期最为显著，所以一般都都分析中期分裂相，根据染色体着丝粒位置的不同，可将染色体分为中部着丝粒染色体（m），亚中部着丝粒染色体（sm），亚端部着丝粒染色体（st），端部着丝粒染色体（t）。

对任何一个染色体的基本形态，重要参数有3个：1.相对长度，指单个染色体长度与包括X与Y染色体在内的单倍染色体总长之比，用百分率表示。

2.臂指数，指长臂同短臂的比率。

按Levan（1964）的划分标准，臂指数在1.0~1.7之间的称中部着丝粒染色体；臂指数在1.7~3.0之间称亚中部着丝粒染色体；臂指数在3.0~7.0之间称亚端部着丝粒染色体；臂指数在大于7.0者称端部着丝粒染色体3.着丝粒指数，指短臂占该染色体长度的比，用百分率表示。

他决定着丝粒饿相对位置。

按Levan（1964）的划分标准，着丝粒指数在50%~37.5%之间称中部着丝粒染色体；指数在37.5%~25.0%之间称亚中部着丝粒染色体；指数在25.0%~12.5%之间称亚端部着丝粒染色体；指数在12.5%~0.0%之间者称端部着丝粒染色体。

外周血细胞培养法制备染色体

外周血细胞培养法制备染色体外周血细胞培养法制备鱼染色体一体外培养1．培养基的配制：在超净工作台中，100ml培养基含以下成分和比例：RPMI-1640 84ml小牛血清15mlPHA 2支0.1%肝素钠1ml双抗终浓度为100单位/ml（可不加）以5% NaHCO3（无菌）或1N HCl调pH至7.2－7.4。

2．采血：用注射器吸取少量灭菌肝素钠溶液，实验鱼尾部用碘酒消毒后，从尾静脉取血。

3．培养：将抗凝血加入培养液中，每10ml培养液中约加入0.2ml抗凝血。

24℃，5%二氧化碳浓度的培养箱中培养，时间为68-72小时。

培养期间，定期轻摇匀，使细胞充分接触培养基。

4．秋水仙素处理：终止培养前2—4小时，在培养液中用1ml注射器滴加入10ug/ml 的秋水仙碱，使终浓度为0.05-0.07μg/ml。

以上步骤均需无菌操作。

二染色体制备1．收集细胞：将培养物全部转入洁净离心管中，以1000rpm离心5分钟，弃上清液。

2．低渗处理：向刻度离心管中加入低渗液9ml，用滴管混匀，低渗25-30分钟。

3．预固定：低渗后加入1ml固定液，轻轻混匀后1000rpm离心5分钟。

4．固定：弃上清液，加入5ml固定液，轻轻混匀，静置20分钟。

1000rpm离心5分钟，弃上清液。

5．重复步骤4两次6．制悬液：弃上清液后，视细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液。

7．滴片：吸取细胞悬液自20—30cm高滴在一张干燥洁净的载玻片上，轻吹散，空气中自然干燥。

8．染色：1:10 Giemsa染液染色20-40分钟，细水冲洗背面去多余染液，气干。

9．镜检：低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，油镜下观察染色体形态并计数。

三注意事项l．培养温度应稳定，培养液pH一般为为7.2—7.4。

2．秋水仙素处理时间过长，分裂细胞多，染色体短小；反之，则少而细长。

都不宜观察形态及计数。

故秋水仙素的浓度及时间需要根据实际情况摸索。

3．低渗使红细胞膜破裂，淋巴细胞膨胀，低渗处理浓度及时间要适当。

外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备

乙液：一水磷酸二氢钠,1/15M溶液含9.2g/L 甲液：二水磷酸氢二钠,1/15M溶液含 11.864g/L 根据要求的PH值,取X毫升甲液与Y毫升乙液, 混合均匀即得.
实验步骤
•
1培养液的分装:在无菌室或接种罩内,用移液管将培养液和其它各试剂剂分装入玻瓶,每瓶量为 :
•
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完全培养基3ml
PHA 20ul
外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备,染色体组型分析
实验目的
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1、了解动物细胞培养的方法。掌握人体外周血淋巴细胞培养与染色体标本制备。 2、熟悉人类染色体的镜下检查和核型分析方法。
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实验原理
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人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。每1ml 外周血中一般含有约1～3×106 个小淋巴细胞，几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态，一般情况下是不再分裂的。但当在培养液中加入植物凝血素（PHA）后，淋巴细胞受刺激便转化为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。经过66～72小时(三个周期)的短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂相细胞，从而进行染色体标本制备和核型分析。
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9制片:留固定液 0.5毫升, 用滴管小心冲打成悬液。从冰箱的冰格中或冰水中取出载玻片,每片滴加悬液 1~3滴,吹散,在酒精灯火焰上过火。室温过夜。
11染色:用磷酸缓冲液（PH7.4）稀释后的姬姆萨染色液染色 20分钟,然后倒去染液,用蒸馏水轻轻冲洗 . 12镜检:待稍干后,在显微镜下观察,先用低倍镜寻找良好的分裂相,然后再用高倍油镜观察。
人染色体组型及其特征
实验材料
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1.1试验材料:人外周血淋巴细胞 1.2试验用具:离心管、吸管，量筒、载玻片，常规清洗烘干，培养瓶、、1ml/5ml移液枪,灭菌处理，天平、离心机、恒温培养箱、显微镜、普通冰箱，酒精灯。 1.3试剂药品完全培养基凝血素(PHA ) 5mg/ml

人类外周血染色体标本制备

整体实验安排：课堂教学主要进行五个独立的实验，包括：人类外周血染色体标本制备；人类染色体Ｇ带标本制备及观察；遗传病基因突变分析（SSCP）；进行性肌营养不良症（DMD）基因检测；人类染色体核型分析实验一1. 人类外周血染色体标本制备1）实验目的：通过实验初步掌握人类染色体标本培养和制备的基本方法。

2）实验原理：正常情况下，外周血中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期或G0期，外周血细胞中是没有分裂相的。

1960年，Nowell和Morhead证实，外周血中的小淋巴细胞可以在植物血凝素(phytohaemagglutinin, PHA)和其它有丝分裂刺激剂的影响下，在形态上转变为淋巴母细胞，在培养中进行有丝分裂。

这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可以迅速而又简便地获得体外生长的细胞群体和有丝分裂相。

外周血是除骨髓之外的血液，临床上常用一些方法把骨髓中的造血干细胞释放到血外周血液中，再在从血液中提取分离得到造血干细胞，我们把这样得到的干细胞成为外周血干细胞正常人外周血中一般看不见幼稚的干细胞的,只存在有极少量的造血干细胞，其含量为0.01%左右。

如果幼稚细胞的比例大幅增加，有可能是类白血病。

正因为存在0.01%的造血干细胞，可利用细胞分离的技术(血细胞自动分离机)，将外周血中含有造血干细胞的单个核细胞进行分离保存，重复数次达一定细胞数量后，回输给患者以之代替骨髓而进行的干细胞移植，称为外周血干细胞移植。

外周血培养基配制一、配制用水培养基的大部分是水，所以水的质量直接影响培养基的质量。

按Waymouth标准，水的电阻应为200万欧姆，一般实验室里以玻璃蒸馏器制备的双蒸水或三蒸水可以符合使用条件。

二、培养基培养基有天然、人工两种。

一般实验室使用的是RPMI-1640粉末培养基，以双蒸或三蒸水配制。

NaHCO3（或HCl）调pH至7.2～7.4，若pH值超过7.6或远低于6.8，则大多数细胞不能生长。

外周血染色体制备及分析

外周血染色体制备及分析原理：人体外周血淋巴细胞在植物凝集素(PHA)的刺激下，能转变为具有分裂能力的母细胞。

外周血细胞经过含有PHA的培养液培养72小时后，再经过秋水仙素的处理，低渗和固定就可获得大量有丝分裂细胞，用空气干燥法制片，胰酶处理，吉姆萨染料显带，便能制备供显微镜分析的染色体标本。

由于整个培养过程操作比较繁琐，许多操作步骤对结果都有非常重要的影响，比如接种的血量，培养基的质量，培养的时间和温度，秋水仙素加入的时间和浓度、低渗的时间，预固定、固定的时间以至制片时的温度和湿度等.本实验室经过长期的实践和总结，对培养的每个步骤都实行严格的标准化操作，取得良好的效果，具体方法如下：一、试剂准备1、0.2%的肝素溶液2、0.0005%秋水酰胺溶液（黑色纸包裹避光置4℃冰箱保存）3、0.075mol/Ll氯化钾溶液4、3：1甲醇冰醋酸溶液（固定液，临用前配制）5、10%Giemsa染色液（将Giemsa原液临用前用PH7.4的磷酸缓冲液即PBS新鲜配制）二、采血与培养取外周血淋巴细胞培养基(RPMI1640)室温复融，并标记姓名、编号，每例标本接种2瓶，肝素湿润的无菌注射器采取静脉血1-2ml，于每瓶接种0.3-0.5ml。

置37℃培养箱内培养72小时。

每日早晚定时摇匀培养物1次。

收获细胞前2小时，用5号针头加入10ug/ml秋水仙素2-3滴，（培养基中秋水仙素的最终浓度为0.1ug/ml左右）。

摇匀后继续培养 2小时。

三、收获细胞培养箱中取出培养瓶：将培养的细胞移入10ml刻度离心管中，标记姓名、编号，以1000转/分钟，离心10分钟后弃上清。

1低渗处理：向离心管中加入6-8ml事先预温（37℃）的0.075mol/L Kcl低渗液，用吸管轻轻吹打,使细胞均匀悬浮于低渗液中,放回37℃恒温水浴箱（或培养箱）中，静置15-20min，使白细胞膨胀，染色体分散、红细胞解体。

2、预固定：向离心管中加入固定液（甲醇：冰乙酸3：1）1ml，轻轻混匀。

综合性实验外周血培养及染色体分析

三、实验用品
(1)器材：冰箱、恒温培养箱、恒温水浴锅、离心机、超净工作台、无菌培养瓶、10ml离心管、显微摄影装置。
（2）试剂：RPMI 1640、小牛血清(FCS)、 PHA、秋水仙素、O．075M KCl、甲醇、冰醋酸；肝素、Giemsa、pH6．8的PBS。
（3）材料：动物外周血
四、实验方法（实验操作要点）
(9)染色：1：10 Giemsa染液(pH 6．8)染色10～20 min。流水冲洗，晾干，镜检。
（10）摄影分析：选好的分裂相进行显微摄影。
五、实验说明（注意事项）
(1) 无菌操作是培养成败的关键，采血时要注意无菌操作，试剂配置要进行无菌过滤，所用培养器械要进行灭菌处理。
(2) PHA添加很重要，如保存不善，效价低或数量不足，则作用差，但浓度过大，红细胞凝块，这些都会影响细胞生长。
染色体标本(1)低渗处理：目的是使水分通过细胞膜向细胞内渗入，导致转化的淋巴细胞染色体进一步分散而利于分析。同时，低渗处理还可使红细胞质膜破裂，然后血影浮于上清中被去除，后续的固定过程主要针对淋巴细胞，改善了淋巴细固定质量及标本质量。 (2)固定：目的在于尽快使细胞的结构固定于接近存活的状态，以便作进一步处理，若不固定则可因细胞内蛋白质分解而导致结构变化。染色体研究中常用固定液为甲醇一冰醋酸(3：1) 固定液。冰醋酸渗透力强，固定迅速，但易使组织膨胀而甲醇则可使组织收缩，两者混合使用能抵消各自的缺点，得到较好的固定效果。
二、实验原理
细胞培养是一种程序复杂而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞在体外长期生存，必须模拟体内环境，供给细胞存活所必需的条件。如供给适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖以及有关的生长因子；氧气及适宜的温度；注意调节其外环境的酸碱度（pH）与渗透压；以及为排除细胞代谢产物的危害，保持良好适宜的外环境而进行必需的传代等等。所有这一切条件与操作都要保持在无菌条件下进行。

(整理)人类体细胞染色体标本制备与核型分析.

实验一人类体细胞染色体标本制备与核型分析Metaphase Chromosome Preparation and Analysis of Karyotype【实验目的】1．熟悉人类外周血淋巴细胞的培养方法及染色体标本的制备方法。

2．熟悉人类染色体G显带标本制备与分析。

【实验原理】染色体是在显微镜下可见细胞有丝分裂过程中出现的结构。

因此，必须获得染色体标本才能进行检查分析，通常情况下，都是利用外周血淋巴细胞进行核型分析。

正常情况下，人体外周血淋巴细胞不再分裂，但植物血凝素（PHA）可刺激血中的淋巴细胞转化成淋巴母细胞，使其恢复增殖能力。

因此，可采取少量外周静脉血，做短期培养，培养至72小时细胞进入增殖旺盛期，此时加入秋水仙素抑制细胞分裂，使细胞分裂停止在中期以获得足够量的分裂期细胞，经低渗、固定、制片、染色后镜下观察进行核型分析。

上述制备的染色体标本经胰蛋白酶消化、Giemsa染色后，可在染色体纵轴上显示出着色深、浅相间的横纹——带，表明每条染色体的特征。

【实验用品】1．采血器材、酒精灯、培养瓶、超净工作台、恒温培养箱、恒温水浴箱、离心机、刻度离心管、乳头吸管、试管架、量筒、试剂瓶、载玻片、吹风机、托盘天平、显微镜、镜油、二甲苯、擦镜纸、镊子、烧杯、记号笔、玻片架、火柴、10ml注射器。

2．RPMI 1640液体培养基、小牛血清、肝素（500 U/ml）、植物血凝素（PHA）、秋水仙素（10mg/ml）、KCl低渗液（0.075mol/L）、甲醇、冰乙酸、Giemsa 原液、磷酸缓冲液（PH6.8）。

3．2.5％胰酶溶液（Hanks液配制）、0.4％酚红、Giemsa染色液、1N盐酸、1N氢氧化钠。

【实验步骤】精品文档一．外周血淋巴细胞染色体标本制备与分析1. 采血及接种培养1.1 在酒精灯火焰上，用灭菌注射器（一次性注射器）抽取肝素0.2ml，使肝素湿润至管壁。

1.2 常规消毒后，采集外周静脉血5ml，转动注射器使血液与肝素混匀。

人类染色体标本制备及核型分析

4、离心：10分钟（1500转／分），弃上清液，留下沉淀物。 5、低渗：6～8m1预温37℃的0.075M KCl溶液，沉淀细胞重重冲散，37℃水浴箱30-35分钟。 6、预固定：1ml新配制的固定剂，轻轻冲打， 37℃水浴箱中静置5分钟。 7、离心：1500转／分离心10分钟，弃上清液。 6．第一次固定：固定液6～8m1，沉淀物轻轻冲打均匀，37℃水浴箱中静置固定10分钟。 7、第一次离心10分钟(1500转／分)，弃上清液。 8、重复第6、7步。
八下

8号染色体 • 短臂：有2条深带，其间有一条较明显的浅带，这是与10 号染色体相区别的主要特征。此臂分为2个区，中段浅带为 2区1号带。 • 长臂：近侧段可见2-3条分界不明显的深带，远侧段有一明显而恒定的深带。此臂分为2个区，中段深带为2区1号带。
九苗条

9号染色体着丝粒染色浓。 • 短臂：远侧段可见两条深带，在有的标本上融合成一条深带。此臂分为2个区，近侧的第1深带为2区1号带。 • 长臂：可见两条明显的深带，次溢痕一般不着色，在有些标本上呈现特有的狭长“颈部区”。此臂分为3个区，近中段的一深带为2区1号带，远侧段的一深带为3区1号带。
溢痕远侧的浅带为2区1号带，中段第2深
带为3区1号带，远侧段第3深带为4区1号带。
二蛇

2号染色体 • 短臂：可见4条深带，中段的两条深带稍靠近。此臂分为2个区，中段第2、3深带之间的浅带为2区1号带。 • 长臂：可见6-7条深带，此臂分为3个区，第2和第3深带之间的浅带为2区1号带，第4 和第5深带之间的浅带为3区1号带。

这种培养方法是Moorhead于1960年建立的。