首次从病人中分离到产毒O157：H7菌株的多重PCR鉴定

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肠出血性大肠埃希菌实验室检测研究进展

肠出血性大肠埃希菌实验室检测研究进展肠出血性大肠埃希菌( Enterohemorr hagic Escher ichia coli ,EHEC) 是一种新的致病性大肠杆菌, O157:H7 是EHEC 最主要的血清型。

EH EC O157:H7的致病力很强, 主要通过食物和饮水传播, 可引起出血性结肠炎( HC) 、溶血性尿毒综合征( HUS) 和血栓性血小板减少性紫癜( TTP) 。

HC 最常见, HUS 和TTP 的病死率较高, 有时可高达30% 以上。

我国已将肠出血性大肠杆菌列为21 世纪可能对国人卫生健康有重大影响的12 种病原微生物之一。

同时，O157:H7菌培养容易、繁殖迅速、感染力强、感染途径广泛，使之极有可能作为未来军事斗争中的细菌战剂和生物恐怖战剂。

已经成为全球性的公共卫生问题。

因此，特异、灵敏、快速的检测方法对于预防其暴发流行显得尤为重要。

本文就该菌近年来实验室检测技术方面的研究进展进行综述。

1 细菌的培养分离1.1 标本采集及增菌腹泻患者的粪便标本最好在发病早期及未用抗生素前采集, 可提高细菌培养的成功率, 以采集腹泻病人血性便为主, 注意无菌操作。

环境中EHEC O157:H7监测对象为动物粪便、水源和食物等标本。

标本通常用EC 肉汤增菌。

对EHEC O157:H7, 目前有两种选择性增菌液, 即改良EC 肉汤( mEC) 和改良胰酶大豆肉汤( mTSB) 。

前者在EC 肉汤的基础上降低胆盐浓度( 0.112%) 并添加新生霉素, 后者向TSB 添加3 号胆盐、缓冲剂和新生霉素。

用这些培养基增菌可提高肉类、奶类和粪便中O157:H7的检出率。

1.2分离培养1.2.1山梨醇麦康凯( SMAC) 琼脂平板EH EC C O157:H7不发酵山梨醇, 而绝大多数其他肠道菌群发酵山梨醇。

用该特点将麦康凯琼脂中的乳糖替换成山梨醇( 1%) , 可用于选择培养[1]。

该法简便易行, 在发病早期( 症状出现1~ 2 d) , 可从大多数患者的粪便中检出致病菌, 随着病程后延, 检出率降至33%左右[2]。

大肠埃希氏菌O157研究进展

大肠埃希氏菌O157：H7检测方法研究进展摘要：大肠埃希氏菌O157∶H7 是肠出血性大肠杆菌的主要病原血清型, 可引起腹泻、出血性肠炎, 极易继发溶血性尿毒综合症和血栓性血小板减少性紫癜两种严重的并发症, 死亡率高，因此快速准确地检测这种病原菌对预防和控制由其引起腹泻有着十分重要的作用。

本文介绍了大肠埃希氏菌O157∶H7 实验室检测方法的研究进展，主要包括微生物学检验方法中的细菌分离培养和快速酶触反应法、免疫学检测法、ISO-GRID检测系统、免疫捕获LAMP法、PCR法、DNA探针技术等分子生物学方法。

关键词：大肠埃希氏菌O157∶H7、检测方法、研究进展大肠埃希氏菌（E.Coli简称大肠杆菌）于1885年由德国科学家T。

Escherich 从健康婴儿粪便中分离并命名[1]。

根据毒力基因、致病性、致病机理、临床症状、流行病学特点和血清分型等，国际上将致泻性大肠埃希氏菌分为6类，即：肠致病性大肠埃希氏菌（EPEC）、肠产肠毒素大肠埃希氏菌（ETEC）、肠侵袭性大肠埃希氏菌（EIEC）、肠出血性大肠埃希氏菌（EHEC）和肠集聚性大肠埃希氏菌（EAEC）以及近来发现的肠产志贺样毒素且具有侵袭力的大肠埃希氏菌（ESIES）[2;3;4]。

大肠杆菌O157∶H7 是肠出血性大肠杆菌的主要病原血清型, 可引起腹泻、出血性肠炎, 极易继发溶血性尿毒综合症和血栓性血小板减少性紫癜两种严重的并发症, 死亡率高[5]。

于1982 年在美国被首次发现，此后在世界各地散发或地方流行，1996 年在日本大阪地区发生流行，患者逾万，死亡11 人，1999—2000 年在中国江苏、安徽等地发生了多起食源性感染O157:H7 事件，导致l77 人死亡[6;7]。

世界卫生组织已将O157:H7 列为新的食源性病原菌。

一、大肠埃希氏菌O157:H7病原学特点EHEC O157:H7 属于肠杆菌科埃希氏菌属，具有一般大肠杆菌的形态特征的同时又有区别于一般大肠杆菌的特征[8]：1、为革兰氏阴性、无芽孢直杆菌，大多数菌株以周生鞭毛运动；2、在普通营养琼脂培养基上为光滑型菌落，有光泽，湿润，灰白色；3、最适生长温度为33-42℃，37℃繁殖迅速，44-45℃生长不良，45.5℃停止生长；4、不耐热，在75℃一分钟即可被杀灭；对氯敏感，在有效氯含量0.4 ppm 以上的水体中难以存活；5、具有较强的耐酸性，pH2.5-3.0，37℃可耐受5小时；6、温度低于5 ℃的环境中生存，在-20 ℃可存活9 个月；7、可产生大量的Vero毒素（VT），也称作类志贺氏毒素（SLT），是EHEC的主要致病因子，SLT抗力很高，经80 ℃处理30 min 仍具有活性；8、发酵多种碳水化合物，但不发酵或迟缓发酵山梨醇，也不能产生葡萄糖酸苷酶。

大肠埃希氏菌O157H7NM检验(食品微生物学检验)

食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157:H7/N M检验1范围本标准规定了食品中大肠埃希氏菌O157:H7/NM(E s c h e r i c h i a c o l i O157:H7/NM)的检验方法㊂本标准适用于食品中大肠埃希氏菌O157:H7/NM的检验㊂2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:2.1恒温培养箱:36ħʃ1ħ㊂2.2冰箱:2ħ~5ħ㊂2.3恒温水浴箱:46ħʃ1ħ㊂2.4天平:感量0.1g㊁0.01g㊂2.5均质器㊂2.6显微镜:10倍~100倍㊂2.7无菌吸管:1m L(具0.01m L刻度)㊁10m L(具0.1m L刻度)或移液器及吸头㊂2.8无菌均质杯或无菌均质袋:容量500m L㊂2.9无菌培养皿:直径90mm㊂2.10p H计或精密p H试纸㊂2.11长波紫外光灯:365n m,功率ɤ6W㊂2.12微量离心管:1.5m L或2.0m L㊂2.13磁板㊁磁板架㊁样品混合器㊂2.14微生物鉴定系统㊂3培养基和试剂3.1改良E C肉汤(m E C+n):见A.1㊂3.2改良山梨醇麦康凯琼脂(C T-S MA C):见A.2㊂3.3三糖铁琼脂(T S I):见A.3㊂3.4营养琼脂:见A.4㊂3.5半固体琼脂:见A.5㊂3.6月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-MU G(MU G-L S T):见A.6㊂3.7氧化酶试剂:见A.7㊂3.8革兰氏染色液:见A.8㊂3.9 P B S-T w e e n20洗液:见A.9㊂3.10亚碲酸钾(A R级)㊂3.11头孢克肟(C e f i x i m e)㊂3.12大肠埃希氏菌O157显色培养基㊂3.13大肠埃希氏菌O157和H7诊断血清或O157乳胶凝集试剂㊂3.14鉴定试剂盒㊂3.15抗-E.c o l i O157免疫磁珠㊂第一法常规培养法4检验程序大肠埃希氏菌O157:H7/NM常规培养法检验程序见图1㊂图1大肠埃希氏菌O157:H7/N M常规培养法检验程序5操作步骤5.1增菌以无菌操作取检样25g(或25m L)加入到含有225m L m E C+n肉汤的均质袋中,在拍击式均质器上连续均质1m i n~2m i n;或放入盛有225m L m E C+n肉汤的均质杯中,8000r/m i n~ 10000r/m i n均质1m i n~2m i n㊂36ħʃ1ħ培养18h~24h㊂5.2分离取增菌后的m E C+n肉汤,划线接种于C T-S MA C平板和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上, 36ħʃ1ħ培养18h~24h,观察菌落形态㊂在C T-S MA C平板上,典型菌落为圆形㊁光滑㊁较小的无色菌落,中心呈现较暗的灰褐色;在大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上的菌落特征按产品说明书进行判定㊂5.3初步生化试验在C T-S MA C和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上分别挑取5个~10个可疑菌落,分别接种T S I琼脂,同时接种MU G-L S T肉汤,并用大肠埃希氏菌株(A T C C25922或等效标准菌株)做阳性对照和大肠埃希氏菌O157:H7(N C T C12900或等效标准菌株)做阴性对照,于36ħʃ1ħ培养18h~ 24h㊂必要时进行氧化酶试验和革兰氏染色㊂在T S I琼脂中,典型菌株为斜面与底层均呈黄色,产气或不产气,不产生硫化氢(H2S)㊂置MU G-L S T肉汤管于长波紫外灯下观察,MU G阳性的大肠埃希氏菌株应有荧光产生,MU G阴性的应无荧光产生,大肠埃希氏菌O157:H7/NM为MU G试验阴性,无荧光㊂挑取可疑菌落,在营养琼脂平板上分纯,于36ħʃ1ħ培养18h~24h,并进行下列鉴定㊂5.4鉴定5.4.1血清学试验在营养琼脂平板上挑取分纯的菌落,用O157和H7诊断血清或O157乳胶凝集试剂作玻片凝集试验㊂对于H7因子血清不凝集者,应穿刺接种半固体琼脂,检查动力,经连续传代3次,动力试验均阴性,确定为无动力株㊂如使用不同公司生产的诊断血清或乳胶凝集试剂,应按照产品说明书进行㊂5.4.2生化试验5.4.2.1自营养琼脂平板上挑取菌落,进行生化试验㊂大肠埃希氏菌O157:H7/NM生化反应特征见表1㊂表1大肠埃希氏菌O157:H7/NM生化反应特征生化试验特征反应三糖铁琼脂底层及斜面呈黄色,H2S阴性山梨醇阴性或迟缓发酵靛基质阳性甲基红-伏普试验(M R-V P)M R阳性,V P阴性氧化酶阴性西蒙氏柠檬酸盐阴性赖氨酸脱羧酶阳性(紫色)鸟氨酸脱羧酶阳性(紫色)纤维二糖发酵阴性棉子糖发酵阳性MU G试验阴性(无荧光)动力试验有动力或无动力5.4.2.2如选择生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统,应从营养琼脂平板上挑取菌落,用稀释液制备成浊度适当的菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统进行鉴定㊂5.4.3毒力基因测定(可选项目)样品中检出大肠埃希氏菌O157:H7或O157:NM时,如需要进一步检测V e r o细胞毒素基因的存在,可通过接种V e r o细胞或H e L a细胞,观察细胞病变进行判定;也可使用基因探针检测或聚合酶链反应(P C R)方法进行志贺毒素基因(s t x1㊁s t x2)㊁e a e㊁h l y等基因的检测㊂如使用试剂盒检测上述基因,应按照产品的说明书进行㊂6结果报告综合生化和血清学试验结果,报告25g(或25m L)样品中检出或未检出大肠埃希氏菌O157:H7或大肠埃希氏菌O157:NM㊂第二法免疫磁珠捕获法7检验程序大肠埃希氏菌O157:H7/NM免疫磁珠捕获法检验程序见图2㊂图2大肠埃希氏菌O157:H7/N M免疫磁珠捕获法检验程序8操作步骤8.1增菌同5.1㊂8.2免疫磁珠捕获与分离8.2.1应按照生产商提供的使用说明进行免疫磁珠捕获与分离㊂当生产商的使用说明与下面的描述可能有偏差时,按生产商提供的使用说明进行㊂8.2.2将微量离心管按样品和质控菌株进行编号,每个样品使用1只微量离心管,然后插入到磁板架上㊂在漩涡混合器上轻轻振荡E.c o l i O157免疫磁珠混悬液后,用开盖器打开每个微量离心管的盖子,每管加入20μL E.c o l i O157免疫磁珠悬液㊂8.2.3取m E C+n肉汤增菌培养物1m L,加入到微量离心管中,盖上盖子,然后轻微振荡10s㊂每个样品更换1只加样吸头,质控菌株必须与样品分开进行,避免交叉污染㊂8.2.4结合:在18ħ~30ħ环境中,将上述微量离心管连同磁板架放在样品混合器上转动或用手轻微转动10m i n,使E.c o l i O157与免疫磁珠充分接触㊂8.2.5捕获:将磁板插入到磁板架中浓缩磁珠㊂在3m i n内不断地倾斜磁板架,确保悬液中与盖子上的免疫磁珠全部被收集起来㊂此时,在微量离心管壁中间明显可见圆形或椭圆形棕色聚集物㊂8.2.6吸取上清液:取1支无菌加长吸管,从免疫磁珠聚集物对侧深入液面,轻轻吸走上清液㊂当吸到液面通过免疫磁珠聚集物时,应放慢速度,以确保免疫磁珠不被吸走㊂如吸取的上清液内含有磁珠,则应将其放回到微量离心管中,并重复8.2.5步骤㊂每个样品换用1支无菌加长吸管㊂免疫磁珠的滑落:某些样品特别是那些富含脂肪的样品,其磁珠聚集物易于滑落到管底㊂在吸取上清液时,很难做到不丢失磁珠,在这种情况下,可保留50μL~100μL上清液于微量离心管中㊂如果在后续的洗涤过程中也这样做的话,脂肪的影响将减小,也可达到充分捕获的目的㊂8.2.7洗涤:从磁板架上移走磁板,在每个微量离心管中加入1m LP B S-T w e e n20洗液,放在样品混合器上转动或用手轻微转动3m i n,洗涤免疫磁珠混合物㊂重复上述步骤8.2.5~8.2.7㊂8.2.8重复上述步骤8.2.5~8.2.6㊂8.2.9免疫磁珠悬浮:移走磁板,将免疫磁珠重新悬浮在100μLP B S-T w e e n20洗液中㊂8.2.10涂布平板:将免疫磁珠混匀,各取50μL免疫磁珠悬液分别转移至C T-S MA C平板和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板一侧,然后用无菌涂布棒将免疫磁珠涂布平板的一半,再用接种环划线接种平板的另一半㊂待琼脂表面水分完全吸收后,翻转平板,于36ħʃ1ħ培养18h~24h㊂注:若C T-S MA C平板和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板表面水分过多时,应在36ħʃ1ħ下干燥10m i n~ 20m i n,涂布时避免将免疫磁珠涂布到平板的边缘㊂8.3菌落识别大肠埃希氏菌O157:H7/NM在C T-S MA C平板和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上的菌落特征同5.2㊂8.4初步生化试验同5.3㊂8.5鉴定同5.4㊂9结果报告同第6章㊂附录A培养基和试剂A.1改良E C肉汤(m E C+n)A.1.1成分胰蛋白胨20.0g3号胆盐1.12g乳糖5.0gK2H P O4㊃7H2O4.0gK H2P O41.5gN a C l5.0g新生霉素钠盐溶液(20m g/m L)1.0m L蒸馏水1000m LA.1.2制法除新生霉素外,所有成分溶解在水中,加热煮沸,在20ħ~25ħ下校正p H至6.9ʃ0.1,分装㊂于121ħ高压灭菌15m i n,备用㊂制备浓度为20m g/m L的新生霉素储备溶液,过滤法除菌㊂待培养基温度冷至50ħ以下时,按1000m L培养基内加1m L新生霉素储备液,使最终浓度为20m g/L㊂A.2改良山梨醇麦康凯(C T-S M A C)琼脂A.2.1山梨醇麦康凯(S M A C)琼脂A.2.1.1成分蛋白胨20.0g山梨醇10.0g3号胆盐1.5g氯化钠5.0g中性红0.03g结晶紫0.001g琼脂15.0g蒸馏水1000m LA.2.1.2制法除琼脂㊁结晶紫和中性红外,所有成分溶解在蒸馏水中,加热煮沸,在20ħ~25ħ下校正p H至7.2ʃ0.2,加入琼脂㊁结晶紫和中性红,煮沸溶解,分装㊂于121ħ高压灭菌15m i n㊂A.2.2亚碲酸钾溶液A.2.2.1成分亚碲酸钾0.5g蒸馏水200m LA.2.2.2制法将亚碲酸钾溶于水,过滤法除菌㊂A.2.3头孢克肟(C e f i x i m e)溶液A.2.3.1成分头孢克肟1.0m g95%乙醇200m LA.2.3.2制法将头孢克肟溶解于95%乙醇中,静置1h待其充分溶解后过滤除菌㊂分装试管,储存于-20ħ,有效期1年㊂解冻后的头孢克肟溶液不应再冻存,且在2ħ~8ħ下有效期14d㊂A.2.4C T-S M A C制法取1000m L灭菌融化并冷却至46ħʃ1ħ的山梨醇麦康凯(S MA C)琼脂,加入1m L亚碲酸钾溶液和10m L头孢克肟溶液,使亚碲酸钾浓度达到2.5m g/L,头孢克肟浓度达到0.05m g/L,混匀后倾注平板㊂A.3三糖铁琼脂(T S I)A.3.1成分蛋白胨20.0g牛肉浸膏5.0g乳糖10.0g蔗糖10.0g葡萄糖1.0g硫酸亚铁铵[(N H4)2F e(S O4)2㊃6H2O]0.2g氯化钠5.0g硫代硫酸钠0.2g酚红0.025g或5.0g/L溶液5.0m L琼脂12.0g蒸馏水1000m LA.3.2制法除酚红和琼脂外,将其他成分加于400m L蒸馏水中,煮沸溶解,在20ħ~25ħ下校正p H至7.4ʃ0.2㊂另将琼脂加于600m L蒸馏水中,煮沸溶解㊂将上述两溶液混合均匀后,加入5%酚红水溶液5m L,混匀,分装小号试管,每管约2m L~4m L㊂于121ʎC10m i n或115ʎC15m i n,制成高层斜面㊂冷却后呈桔红色㊂如不立即使用,在2ħ~8ħ条件下可储存一个月㊂A.4营养琼脂A.4.1成分蛋白胨10.0g牛肉膏3.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g蒸馏水1000m LA.4.2制法将各成分溶解于蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,校正p H至7.4ʃ0.2,分装㊂于121ħ高压灭菌15m i n㊂A.5半固体琼脂A.5.1成分蛋白胨1.0g牛肉膏0.3g氯化钠0.5g琼脂0.3g~0.4g蒸馏水100m LA.5.2制法将各成分溶解于蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,校正p H至7.4ʃ0.2,分装小试管,于121ħ高压灭菌15m i n㊂直立凝固备用㊂A.6月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤-M U G(L S T-M U G)A.6.1成分胰蛋白胨20.0g氯化钠5.0g乳糖5.0g磷酸氢二钾(K2H P O4)2.75g磷酸二氢钾(K H2P O4)2.75g十二烷基硫酸钠0.1g4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MU G)0.1g蒸馏水1000m LA.6.2制法将各成分溶解于蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,于20ħ~25ħ下校正p H至6.8ʃ0.2,分装到带有倒管的试管中,每管10m L,于121ħ高压灭菌15m i n㊂A.7氧化酶试剂A.7.1成分N,N'-二甲基对苯二胺盐酸盐或N,N,N',N'-四甲基对苯二胺盐酸盐1.0g蒸馏水100m LA.7.2制法少量新鲜配制,于冰箱内避光保存,在7d内使用㊂A.7.3试验方法用无菌棉拭子取单个菌落,滴加氧化酶试剂,10s内呈现粉红或紫红色,即为氧化酶试验阳性㊂不变色者为氧化酶试验阴性㊂A.8革兰氏染色液A.8.1结晶紫染色液A.8.1.1成分结晶紫1.0g95%乙醇20m L1%草酸铵水溶液80m LA.8.1.2制法将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合㊂A.8.2革兰氏碘液A.8.2.1成分碘1.0g碘化钾2.0g蒸馏水300m LA.8.2.2制法将碘与碘化钾先行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300m L㊂A.8.3沙黄复染液A.8.3.1成分沙黄0.25g95%乙醇10.0m L蒸馏水90.0m LG B 4789.36 201611 A .8.3.2 制法将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释㊂A .8.4 染色法A .8.4.1 涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染液,染1m i n ,水洗㊂A .8.4.2 滴加革兰氏碘液,作用1m i n ,水洗㊂A .8.4.3 滴加95%乙醇脱色约15s ~30s ,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗㊂A .8.4.4 滴加复染液,复染1m i n,水洗㊁待干㊁镜检㊂A .9 P B S -T w e e n 20洗液按照商品用E .c o l i O 157免疫磁珠的洗液配方进行制备,或按照下列配方制备㊂A .9.1 成分氯化钠8.0g 氯化钾0.2g 磷酸氢二钠(N a 2H P O 41.15g 磷酸二氢钾(K H 2P O 4)0.2g T w e e n200.5g 蒸馏水1000m LA .9.2 制法将上述成分溶解于水中,于20ħ~25ħ下校正p H 至7.3ʃ0.2,分装锥形瓶㊂121ħ高压灭菌15m i n ,备用㊂。

市售生鲜猪肉中大肠杆菌o157∶h7的检出及分析

实验研究2019年10月下市售生鲜猪肉中大肠杆菌O157∶H7的检出及分析段志刚（郑州市动物卫生监督所，河南郑州 450002）摘要：目的：了解本市市售生鲜猪肉中是否存在大肠杆菌O157：H7，为预防食源性O157：H7的暴发流行提供依据。

方法：采用常规培养法和普通生化实验对猪肉样品进行分离纯化及初筛，采用多重PCR进行检测。

结果：74份样品中有1份检出大肠杆菌O157：H7，检出率为1.3％。

结论：本市市售生鲜猪肉存在大肠杆菌O157：H7的污染情况，肉品质量与安全应引起高度重视。

关键词：大肠杆菌O157：H7；分离纯化；PCR；食品安全随着社会不断进步，畜产品卫生与安全备受关注。

大肠杆菌O157：H7（Escherichia coli O157：H7）是肠出血性大肠杆菌（简称EHEC）的主要血清型，虽是条件致病菌但致病力强，我国自1988年，已有江苏等省市从腹泻病患者分离到O157：H7。

根据大众网济南2017年7月27日讯，济南检验检疫局首次在济南空港口岸从台湾入境中国籍旅客中检出大肠杆菌O157感染病例。

为了解本市市售生鲜猪肉中是否存在O157：H7，我们分别于2017年10～12月，2018年2～3月分两组对郑州市部分市售生鲜肉进行了大肠杆菌的分离鉴定，并采用双重PCR法对分离株进行鉴定，现报告如下。

1 材料与方法1.1 待检样品检测生鲜猪肉样品分别来自俭学街思达超市、俭学街双汇连锁店、信息学院路丹尼斯超市和金城冷鲜肉四个地点，分3个批次，共27份。

1.2 主要的仪器、培养基、试剂仪器：OLYMPUS光学显微镜；Bio-rad PCR扩增仪等。

培养基：亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液、伊红美兰琼脂（EMB）、胆硫乳培养基（DHL）、普通肉汤、甘油等。

PCR反应试剂：2×PCR TaqMix；引物的设计与合成：设计大肠杆菌O157：H7的O157菌体抗原rfbE基因和H7鞭毛抗原fliC基因为靶基因对应的引物，由上海博尚生物技术有限公司合成[2，3]。

屠宰场分离大肠埃希氏菌O157H7药敏试验及耐药基因分析

动物医学进展,021,42(6)=140-144Progressin Veterinary Medicine屠宰场分离大肠埃希氏菌O157：H7药敏试验及耐药基因分析钟巧贤1，袁淑英1,梁秋燕1，袁明贵1,彭新宇1，徐志宏12,向蓉12*(.广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站，广东广州510640；.岭南现代农业科学与技术广东实验室肇庆分中心，广东肇庆5262382.)摘要：为了解2018年一2019年从广东省内生猪屠宰场分离的19株大肠埃希氏菌O157：H7耐药情况，采用微量肉汤稀释法测定阿莫西林等16种抗菌药物对分离菌株的最小抑菌浓度(MIC),并用普通PCR 法检测blaNDM-1等10种耐药基因。

结果表明，19株大肠埃希氏菌O157：H7分离菌株对不同抗生素存在耐药差异，其中对阿莫西林、氨苄西林、青霉素、氯霉素和恩诺沙星的耐药率均为100%，对头孢哝酮的耐药率最低为5.26%，其余10种抗菌药物的耐药率位于31.58%〜84.21%之间-,mcr-1eM fOR和rmlB4种耐药基因未检出,blaNDM-1等6种耐药基因检出率范围为5.26%〜89.47%.生猪屠宰场大肠埃希氏菌O157:H7耐药且多重耐药严重，分离株携带丰富的耐药基因。

关键词：屠宰场；大肠埃希氏菌O157：H7；微量肉汤稀释法；耐药中图分类号：S852.61；S858.28文献标识码:：文章编号：1007-5038(2021))6-01，10-05大肠埃希氏菌(EscherCchia coli)是人和动物肠道中最重要和最常见的微生物之一，属于人兽共患条件致病菌］12］。

目前国际公认的分类主要有6个种类，其中肠出血性大肠埃希氏菌(EHEC)是能引起人和动物出血性腹泻和肠炎的一类大肠埃希氏菌，O157：H7血清型是其代表菌株。

大肠埃希氏菌O157：H7是目前世界公认的引起食源性疾病的重要致病菌和人兽共患病病原微生物，主要通过食物及饮食、肉及肉制品传播［5］。

院感知识：传染病防治考试题库

院感知识：传染病防治考试题库1、单选医疗机构有下列（）行为之一的，由县级以上地方卫生行政部门责令改正、通报批评、给予警告；情节严重的，会同有关部门对主要负责人、负有责任的主管人员和其他责任人员依法给予降级、（江南博哥）撤职的行政处分。

A、未建立传染病疫情报告制度的B、未指定相关部门和人员负责传染病疫情报告管理工作的C、瞒报、缓报、谎报发现的传染病病人、病原携带者、疑似病人的D、以上都是正确答案：D2、单选群体性不明原因疾病专家组的主要职责不包括（）A、对群体性不明原因疾病的调查和采取的控制措施提出建议；B、对确定群体性不明原因疾病事件的发展趋势进行评估和预测；C、积极参与临床救治工作，减少死亡病例的发生；D、对群体性不明原因疾病事件应急反应的终止、后期评估提出建议。

正确答案：C3、单选马尔堡病毒目前有（）血清型。

A、1种B、2种C、3种D、5种正确答案：A4、单选肠出血性大肠杆菌O157：H7感染性腹泻暴发疫情后，经过疫情检索，疫区在发生最后一例确诊病例后，（）内无新发病例，可经疫情应急处理专家组核定，转入常规监测防治。

A、1周B、2周C、3周D、4周正确答案：B5、单选接到《突发公共卫生事件相关信息报告卡》的专业机构，应对信息进行审核，确定真实性，（）小时内进行网络直报，同时以电话或传真等方式报告同级卫生行政部门。

A、2B、6C、12D、24正确答案：A6、单选各省（区、市）年度首例人禽流感病例由哪个部门组织人禽流感专家组诊断？（）A、卫生部B、省卫生厅C、省政府D、省疾控中心正确答案：A7、单选县级疾病预防控制机构在接到禽流感疫情报告后，应在多长时间内开展现场流行病学调查。

（）A、12小时B、6小时C、4小时D、2小时正确答案：D8、单选发生较大（Ⅲ级）和一般（Ⅳ级）突发公共卫生事件后，（）应及时发布有关信息，释疑解惑，做好疾病预防和控制的科普教育工作。

A、国务院卫生行政部门B、省级卫生行政部门C、地市级卫生行政部门D、辖区卫生行政部门正确答案：B9、单选霍乱发生时，下列哪项措施不当（）A、当地政府可以在本行政区域内采取限制或者停止集市、集会、影剧院演出以及其他人群聚集的活动B、在疫区可停工、停业、停课C、对进出疫区的霍乱病人、疑似病人及其密切接触者实施临时隔离、留验，并向地方卫生行政部门指定的机构移交D、禁止发布关于霍乱疫情的信息，以免引起群众恐慌E、政府可临时征用房屋、交通工具以及相关设施和设备正确答案：D10、单选各级各类医疗机构承担责任范围内突发公共卫生事件和传染病疫情监测信息报告任务，其职责不包括（）。

全国肠出血性大肠杆菌O157H7区监测方案(试行)

全国肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻监测方案（试行）肠出血性大肠杆菌（EHEC）是近年来新发现的危害严重的肠道致病菌。

自1982年美国首次发现因该致病菌引起的食物中毒以来，肠出血性大肠杆菌O157:H7疫情开始逐渐扩散和蔓延，相继在英国、加拿大、日本等多个国家引起腹泻暴发和流行。

我国自1997年在一定范围内开展监测工作以来，已陆续有十余个省份从市售食品、进口食品、家畜家禽、腹泻病患者等分离出肠出血性大肠杆菌O157:H7，特别是1999年我国部分地区发生了肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻的暴发，表明肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻已成为威胁人群健康的重要公共卫生问题。

为确保早期发现、及时报告疫情，以迅速有效控制疫情，制定此监测方案。

一、监测目的1．早期发现疫情；2．动态观察O157:H7大肠杆菌的分布特征及疾病流行趋势；3．评价各项干预措施的实施效果，为制定有效的防治对策提供依据。

二、监测内容与方法（一）病例定义1.疑似病例具有以下表现之一者即为疑似病例：1.1鲜血便或鲜血样便（血便相混）的腹泻病例；1.2腹泻若干天后继发以少尿或无尿为先驱症状的急性肾功能衰竭（附件4）的病例。

2.确诊病例疑似病例或其他腹泻病例，具有以下条件之一者即为确诊病例：2.1用免疫磁珠法从粪便标本中检测出产志贺毒素的肠出血性大肠杆菌O157:H7（附件2）；或恢复期血清O157 脂多糖（LPS）IgG 抗体呈4倍升高；或经蛋白印记试验证实血清标本有与O157 LPS、或肠出血性大肠杆菌溶血素、或志贺毒素分子量一致的特异性抗体（附件3）；2.2在流行区内，经省级专家组确认，与确诊病例流行病学密切相关，并排除其它疾病的疑似病例，为临床符合病例；2.3腹泻病例的粪便中分离出不产志贺毒素1或志贺毒素2及其变种的肠出血性大肠杆菌O157:H7，亦为确诊病例（不产毒）。

3暴发疫情3.1在1个县（区）或相毗邻的县（区）境内，2周内发现不少于10例的具有显著的流行病学联系，且无其它原因可解释的疑似病例；3.2在1个县（区）或相毗邻的县（区）境内，2周内发现不少于3例的确诊病例。

大肠杆菌O157：H7-简介

大肠杆菌O157：H7 - 简介大肠杆菌O157:H7 - 简介肠出血性大肠杆菌(EHEC)是能引起人的出血性腹泻和肠炎的一群大肠埃希氏菌。

以O157:H7血清型为代表菌株。

大肠杆菌O157:H7 - 生物学特征1、EHEC O157:H7属于肠杆菌科埃希氏菌属。

革兰氏染色阴性，无芽胞，有鞭毛，动力试验呈阳性。

其鞭毛抗原可丢失，动力试验阴性。

2、EHEC O157:H7具有较强的耐酸性，pH2.5-3.0，37?可耐受5小时;3、耐低温，能在冰箱内长期生存;在自然界的水中可存活数周至数月;4、不耐热，75? 1分钟即被灭活;对氯敏感，被1mg/L的余氯浓度杀灭。

5、EHEC 的最适生长温度为33-42?，37?繁殖迅速，44-45?生长不良，45.5?停止生长。

6、EHEC O157:H7除不发酵或迟缓发酵山梨醇外，其他常见的生化特征与大肠埃希氏菌基本相似，但也有某些生化反应不完全一致，具有鉴别意义。

EHECO157:H7虽然有uidA基因，但其编码的β-葡萄糖醛酸酶无活性，不能分解4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG)产生荧光，即MUG阴性。

7、EHEC除其代表菌株O157:H7外，还包括O157:NM、O26:H11、O111:H8、O125:NM、O121:H19、O45:H2、O4:NM、O145:NM、O5:NM、O91:H21、O103:H2、O113:H2等血清型的部分菌株。

血清学鉴定包括O抗原和H抗原的鉴定。

前者可使用玻片凝集试验或胶乳凝集试验;后者则应先进行动力试验，动力活泼者再进行玻片和试管凝集试验。

8、EHEC O157:H7的另一个显著特征是可产生大量的Vero毒素(VT)，也称作类志贺氏毒素(SLT)，是EHEC的主要致病因子。

Vero毒素按免疫原性等方面的不同可分为VT1和VT2。

该毒素有一个A亚单位和5~6个B亚单位组成。

B亚单位与宿主肠壁细胞糖脂受体结合，具有毒素活性的A亚单位进入细胞，改变60s核糖体的组分，干扰蛋白质的合成。

大肠杆菌0157h7

大肠杆菌0157：H7综述食品质量与安全07级2班熊政委222007324212112摘要：肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7 为的食源性强致病菌，本文主要阐述了大肠杆菌0157：H7的形态学特征，培养特征，生化特性，抗原特性，致病性，对外界环境的抗性，流行病学特征，检测流程以及控制防范措施。

关键词: 大肠杆菌0157：H7, 形态学特征, 培养特征, 生化特性, 抗原特性, 致病性,对外界环境的抗性,, 流行病学特征, 检测流程以及控制防范措施Abstract: Escherichia coli O157 is a Food-borne pathogen stronger. his article mainly expounds the Escherichia coli 0157: H7 morphology, biochemistry, cultivating characteristics, characteristics of pathogenic antigen and the external environment, the resistance and epidemiological characteristics, testing process and control measures.Keywords: Escherichia coli 0157: H7, morphology, biochemistry, cultivating characteristics, characteristics, pathogenic antigen, the resistance of the external environment, the epidemiological characteristics, testing, process and control measures前言大肠杆菌0157：H7 是肠出血性大肠杆菌（EHEC）的一个主要菌型,其致病力强,对人类健康构成重大威胁, 肠出血性大肠杆菌是由Riley等于1982 年首次报告并确认为致病菌以来此菌在世界范围内形成了多次暴发流行尤其是1996年日本发生的大规模暴发流行感染近万例死亡10 余例,造成严重危害#引起国际社会的广泛关注报道。

肠出血性大肠杆菌O157H7感染性腹泻监测方案

肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻监测方案(试行)一、背景肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7感染性腹泻是近年来新发现的危害严重的肠道传染病。

它除引起腹泻、出血性肠炎外，还可发生溶血性尿毒综合症(HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)等严重的并发征，后者病情凶险，病死率高。

我国自1997年在一定范围内开展监测工作以来，已陆续有十余个省份在市售食品、进口食品、腹泻病患者、家畜家禽等分离到肠出血性大肠杆菌O157:H7，特别是1999年我国部分地区发生了肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻的暴发，表明肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻已逐渐成为威胁人群健康的重要公共卫生问题。

为此，2000年，卫生部发布了《全国肠出血性大肠杆菌O157:H7感染性腹泻监测方案（试行）》，为进一步加强我国重点地区的监测工作，特制订此方案。

二、监测目的1、及时掌握该病在我国的发病情况；2、动态观察O157:H7大肠杆菌的分布特征及流行趋势。

三、病例定义1、疑似病例（1）有鲜血便、低烧或不发烧、痉挛性腹痛的腹泻病例；（2）腹泻若干天后继发少尿或无尿等表现的急性肾功能衰竭病例；（3）腹泻病人粪便标本O157抗原免疫胶体金检测阳性者。

符合以上条件之一者，即为疑似病例；2、确诊病例疑似病例或其他腹泻病患者，具有以下条件之一者即为确诊病例：（1）从粪便标本中检出产生志贺毒素的肠出血性大肠杆菌O157：H7；或经蛋白印记试验证实血清标本有与肠出血性大肠杆菌溶血素、或志贺毒素分子量一致的特异性抗体；（2）在流行区内，经省级专家组确认，与确诊病例流行病学密切相关，并排除其它疾病的疑似病例，为临床符合病例；（3）腹泻病例的粪便中分离出不产生志贺毒素1或志贺毒素2及其变种的肠出血性大肠杆菌O157:H7，亦为确诊病例（不产毒）。

肠出血性大肠埃希菌O157:H7多重PCR检测方法的建立

肠出血性大肠埃希菌O157：H7多重PCR检测方法的建立纪雪;郭学军;刘彦晶;张雪;孙洋;孙诗雯;祝令伟;刘军;姜海艳;周伟;梁冰【摘要】为建立肠出血性大肠埃希菌O157:H7的多重PCR检测方法,针对O157菌特异性eaeA基因、fliC基因、志贺毒素基因(stx1和stx2)及rfbE基因设计5对引物,构建多重PCR反应体系,优化反应的引物浓度和温度检测其特异性和敏感性,并对牛、猪、鸡及犬等不同动物来源的样品进行了大肠埃希菌O157检测.结果显示,该方法具有良好的特异性和敏感性,敏感性达到5×103 CFU.从检测阳性样本中均分离到目的菌.应用建立的方法在确定样品中是否含有大肠埃希菌O157的同时,还能对菌株毒力进行初步判定.成功建立了肠出血性大肠埃希菌O157:H7多重PCR检测方法,为该病原菌感染的预防和监测提供了简便、快速的技术手段,具有良好的应用前景.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2017(038)007【总页数】6页(P1-6)【关键词】肠出血性大肠埃希菌O157:H7;多重PCR;检测;rfbE基因【作者】纪雪;郭学军;刘彦晶;张雪;孙洋;孙诗雯;祝令伟;刘军;姜海艳;周伟;梁冰【作者单位】军事医学科学院军事兽医研究所,吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室,吉林长春 130122;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室,吉林长春 130122;长春中医药大学附属医院,吉林长春 130021;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室,吉林长春 130122;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室,吉林长春 130122;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室,吉林长春 130122;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室,吉林长春 130122;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室,吉林长春 130122;长春中医药大学附属医院,吉林长春 130021;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室,吉林长春 130122;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室,吉林长春 130122【正文语种】中文【中图分类】S852.612肠出血性大肠埃希菌O157：H7(Enterohaemorrhagic Escherichia coli O157：H7,EHEC O157：H7)是一种重要的人兽共患病原菌，首次报道于1982年，由美国Riley L W等[1]发现。

动物源性肠出血性大肠杆菌O157：H7及其3个毒力基因的多重PCR快速检测研究

ＣＨＥＮＹａ — ｊｕｎ ’ ，ＷＡＮＧＹａ — ｂｉｎ，ＺＨＡＮＧＬｉ — ｊｕａｎ，ＺＨＡＮＧＬｏｎｇ～ｘｉａｎ，＇
ＣＨＥＮＬｉ — ｙｉｎｇ，ＬＩＵＺｈｏｎｇ — ｙｕａｎ，ＳＨＥＮＧｕｏ，ＨＵＨｕｔ＇。
ｔｈｒｅｅｏｆｉｔｓｖｉｒｕｌｅｎｃｅｇｅｎｅｓ（ｈｙｌＡ，ｅａｅＡａｎｄｓｔｘ２ｇｅｎｅｓ）．Ｆｉｖｅｓｅｔｓｏｆｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ
紧密黏附素（ｅａｅＡ）基因和志贺样毒素２（ｓｔｘ２）基因为靶基因，设计５对特异性引物，在同一扩增体系中进行ＰＣＲ，优化反应体系，测定特异性和灵敏度，并进行了临床样品的检测。结果该方法扩增目的基因片段分别为３２７ｂｐ、２４７ｂｐ、４９４ｂｐ、３８４ｂｐ和７７９ｂｐ，特异性和灵敏度均高，细菌纯培养物的检测灵敏度为１０ｃｆｕ／ｍＬ。结论初步建立了快速、灵敏、特异的检测肠
动物源性肠出血性大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７及其３个毒力基因的多重ＰＣＲ快速检测研究
陈雅君。，王亚宾，张莉娟，张龙现，陈丽颖，刘中原，申果，胡慧，。

肠出血性大肠杆菌O157：H7胶体金免疫检测试纸条的制备

肠出血性大肠杆菌O157：H7胶体金免疫检测试纸条的制备食源性病原微生物是当今食品安全和突发性公共卫生事件的主要诱因,在食源性病原微生物中,肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7是重要的病原之一。

本实验旨在制备抗0157：H7特异单克隆抗体,建立0157：H7胶体金免疫层析检测方法,为临床快速诊断以及带菌动物、环境污染物和食品等现场检测样品的快速筛查提供简便快速的检测手段。

研究内容分为三个部分：1.分泌抗大肠杆菌0157：H7单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立将E.coli O157:H7用甲醛灭活超声破碎,免疫BALB/c鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0骨髓瘤细胞融合,建立了7株分泌抗E.coli O157:H7单克隆抗体(mAbs)的杂交瘤细胞株,分别命名为2E7、2F5、1G9、1D3、2H7、2G11和1C3,Ig 亚类分别是IgG2b κ、IgG2a κ、IgM κ、 I IgMκ、IgG2b κ、IgM κ和IgG2a κ。

用间接ELISA检测,1G9和2G11细胞培养上清液的效价为1.6×103,腹水效价均为1×1011；1C3、2E7、2F5、1D3和2H7细胞培养上清液的效价为1×101-2×102,腹水效价均为4×102-1×106。

相加ELISA结果显示,1D3和2H7mAbs对应相同的抗原表位,而其它五株对应不同的抗原表位。

用间接ELISA分析特异性,2E7、2H7和1D3为抗EHEC0157：H7特异性单克隆抗体,其它四株mAbs与某些其他血清型的大肠杆菌有交叉反应。

Western blotting表明,1C3、1G9、2G11、2E7、1D3和2H7六株mAbs在蛋白分子量约35kD处有特异性条带,而mAbs2F5则未显示蛋白带。

2.大肠杆菌0157：1：17单克隆抗体胶体金免疫检测试纸条的研制采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,用纯化的单克隆抗体2E7标记,制备金标抗体玻璃纤维素膜；将纯化的2H7和羊抗鼠IgG分别作为检测和对照捕捉抗体包被于硝酸纤维素膜(NC)上；组装成双抗夹心法0157：H7胶体金免疫层析检测试纸条。

粪便标本肠出血性大肠杆菌O157H7的分离方法

粪便标本肠出血性大肠杆菌O157:H7的分离方法包括标本采集和增菌、免疫磁珠富集和培养、生化反应、血清学和毒力因子鉴定等步骤。

1．粪便标本增菌1)采集的标本应插入卡里－布莱尔半固体保存培养基中，立即送实验室接种于增菌培养基（EC肉汤+10mg/L新生霉素或Tryptic Soy Broth）；2)增菌培养：增菌液可用添加10mg/L新生霉素的EC肉汤。

也可用1/8N 的HCl+0.5%NaCl溶液，将标本处理30秒后，再用胰大豆胨培养液增菌。

2．免疫磁珠富集方法1)取下磁板，然后将事先编号的1.5ml离心管置于Dynal MPC－M架上；2)重新悬浮E.coli O157的DynaL磁珠,直到底部的沉淀消失。

吸取抗E.coliO157磁珠，每管20ul；3)取1ml增菌培养物的标本, 加入管中，然后盖紧管，每加一个样品,都要换新管；4)颠倒Dyna架几次, 然后在室温条件下, 置于 Dynal MX3样品混合器上,不断轻轻搅动,以阻止磁珠沉淀,持续时间10分钟（如果没有混合器，可人工混合）；5)将磁板插入到Dynal MPC－M上颠倒支架数次，以浓缩磁珠沉淀到管壁，作用持续3分钟；6)用配套的开盖器打开试管，小心的吸取悬浮液（包括残留在管盖上的液体），并弃掉（请检查影响产物出现的因素）；7)将磁板从Dynal架取下；8)加入1ml洗涤缓冲液（PBS—吐温），吸管不要接触小离心管，以免造成样品及缓冲液的交叉污染；然后盖上盖，将Dynal MPC－M架颠倒数次，以重新悬浮磁珠；9)重复5－8的步骤；10)重复5－7的步骤；11)用100微升冲洗缓冲液（PBS－吐温）重新悬浮磁珠细菌混合物。

用一个混合器做短暂的混匀。

此为富集的肠出血性大肠杆菌O157：H7的菌悬液；12)将上述菌悬液划线接种于CT－山梨醇麦康凯（C－头孢菌素类抗生素、T－亚碲酸钾）等选择性培养基上，370C培养16～24小时。

3．生化反应、血清学和毒力因子鉴定1)生化反应鉴定：将疑似肠出血性大肠杆菌O157：H7的菌落进生化反应。

大肠杆菌O157

清洁剂加热
介质温度时间
蒸汽93℃5分钟
水76.6℃5—20分钟
干热82℃20分钟
热水通常用作清洁剂，尤其在食品服务操作中，象洗碗机、大型操作用大型多层箱输送清洗机器。输送带把盘子通过清洗、漂洗、消毒箱，在清洗步骤中用热水。适宜的清洗意味着被消毒的器具温度至少要加热到71℃，在器具中建立的加热一部分要通过65.5℃左右的清洗和漂洗喷雾。
通常，进入消毒喷雾机的水必须至少82℃，固定的架子除外，单个温度机械上最低清洗温度为74℃，使器具的温度升到65.5℃或更高。
另一个重要因素是喷雾的压力，太大的压力，使水滴雾化而导致其到达器具之前冷却太快。另一方面太小的压力可能导致形不成喷雾，通常每平方英尺15-25磅的压力工作最好。
清洁频率
对不同类型的设备清洁频率是不同的。例如，切板必须每四小时被清洗消毒，在细菌能繁殖到危险水平之前必须去除它们。切板也需在不同用途时被清洁以避免交叉污染。例如，如果切板首先用于生的产品，那么在它们用在蒸煮的即食产品时，必须被清洗和消毒，为防止交叉污染，锅、盘和其他处理食品的设备，其含有生的产品或含有蒸煮的产品，在再次使用它们之前，必须清洗和消毒。
在检测过程中，也可以在选择性增菌后，取出5mL增菌液，经100℃水浴15分钟灭活后，供自动酶联荧光免疫测试（VIDAS），迅速获得初步结果，阳性反应者需作进一步证实。
附:自动酶联荧光免疫测试（mini-VIDAS）
自动酶联荧光免疫测试（VIDAS）测定程序
EHEC O157:H7检验程序图解
检样25g
美国FDA已批准对猪肉、牛肉、禽肉、羊肉、香料、调味品进行辐照，也可以用于水果、蔬菜和谷物。有关食品辐照的要求在21CFR PART179可以查到。
每种技术都有自已的术语，辐照也不例外。KILOGRAY是个用于食品加工业中描述辐照量值的术语。

大肠杆菌O157_H7特异基因的实时荧光定量PCR检测

大肠杆菌O157:H7特异基因的实时荧光定量PCR 检测胡慧1，陈雅君1，段志刚1，孟振北2，彭新然2，张龙现1，崔保安1，王亚宾1,*(1.河南农业大学牧医工程学院，河南郑州 450002；2.漯河出入境检验检疫局，河南漯河 450046)摘要：为建立快速、特异的检测大肠杆菌O157:H7的实时荧光定量聚合酶链式反应(real time polymerase chain reaction ，RT-PCR)方法，针对大肠杆菌O157:H7的特异基因rfbE 设计一对特异引物，建立SYBR Green Ⅰ实时定量PCR 检测方法，并进行灵敏度、重复性和特异性实验，同时与常规PCR 方法进行比较。

结果显示所建立的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR 方法可以快速、特异地检测出大肠杆菌O157:H7，细菌纯培养物中其灵敏度可达2×101CFU/mL ，临床模拟污染肉样中能最低能检测到1×102CFU/mL 的大肠杆菌O157:H7。

与常规PCR 方法相比，SYBR Green Ⅰ实时定量 PCR 方法对临床样品中大肠杆菌O157:H7的检出率大大提高。

本研究建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量 PCR 技术能快速准确、特异、敏感地检测大肠杆菌O157:H7。

关键词：大肠杆菌O157:H7；rfbE 基因；SYBR Green Ⅰ；实时PCRReal-time PCR Detection of Specific Gene in Escherichia coli O157:H7HU Hui 1，CHEN Ya-jun 1，DUAN Zhi-gang 1，MENG Zhen-bei 2，PENG Xin-ran 2，ZHANG Long-xian 1，CUI Bao-an 1，WANG Ya-bin 1,*(1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China ；2. Luohe Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Luohe 450046, China)Abstract ：A real-time PCR method was developed for the rapid and specific detection of Escherichia coli O157:H7. A pair of primers was designed according to the conserved sequence of rfbE gene in Escherichia coli O157:H7. The SYBR Green I real-time PCR method for detecting Escherichia coli O157:H7 was established. The sensitivity and specificity of this method was analyzed through the comparison with traditional PCR methods. The results indicated that the developed SYBR Green I real-time PCR method had the characteristics of excellent specificity, sensitivity and repeatability. The sensitivity of this developed method was 2 × 101 CFU/mL in pure cultures and 1 × 102 CFU/mL in artificially contaminated meat samples. In addition, the established method was also used for the detection of clinical samples. The results showed that the detection rate of real-time PCR for Escherichia coli O157:H7 was significantly increased when compared with traditional PCR. Therefore, the established real-time PCR method is a rapid, specific and sensitive method for the detection of Escherichia coli O157:H7.Key words ：Escherichia coli O157:H7；rfbE gene ；SYBR Green I ；real-time PCR中图分类号：R378.21 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2011)12-0278-05收稿日期：2010-08-19基金项目：河南省重大公益科研项目(81100912300)；“十一五”国家科技支撑计划项目(2007BAQ01047)；漯河市科技计划项目(081203)作者简介：胡慧(1976—)，女，讲师，博士，研究方向为动物病原学。

O157：H7大肠杆菌食物中毒

什么是O157：H7大肠杆菌食物中毒事件
案情回放　O157：H7大肠杆菌感染是近年来新发现的危害严重的肠道传染病，O157：H7大肠杆菌是数百种大肠杆菌中的一个亚型（注：O157是细菌菌体抗原的编号，H7是细菌鞭毛抗原的编号）。

虽然生长在健康人类和动物肠道内的绝大多数菌种都是无害的，但这一菌种却会产生强烈的毒素，并引发严重的疾病。

1982年，该病首先在美国俄勒冈和密执安州食用汉堡包引起的食物中毒事件中发现，并从患者粪便中分离出大肠杆菌O157：H7。

1983年医学界确认，出血性肠炎由此种新发现的致病性大肠杆菌O157：H7引起，与以往引起腹泻的大肠杆菌不同，因此，将该菌命名为肠出血性大肠杆菌。

1985年又有人认为溶血性尿毒综合征的发生也与该菌株有关。

该病以后又陆续在20多个国家发现，并引起多起暴发流行。

1996年58月，O157：H7大肠杆菌性腹泻在日本造成大范围流行，40多个都、府、县有9000余人患病，近千人住院，11人死亡；这是自发现该菌以来，全球发生的最大规模的一次暴发流行，引起全世界的关注。

1999年我国苏、皖两省相继发生了O157：H7出血性肠炎病例暴发。

今年美国的毒菠菜事件又再一次向世人敲响了警钟，由O157：H7引起的感染性腹泻成为严重的公共卫生问题。

A　其实大肠杆菌O157：H7只是肠出血性大肠杆菌亚型中成员之一，不过它是老大。

虽然1982年后才给它命名，但是早在1975年美国疾控中心（CDC）就发现了它，当时它未引起大规模的食物中毒，故而未受重视。

1982年后大肠杆菌O157：H7在20多个国家引起大规模食物中。

PCR扩增uidA、rfbE和fliCH7基因检测大肠杆菌 O157-H7特异性和灵敏性的比较

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讨论
• 针对O157:H7的rfbE基因设计的引物均有很高的
特异性。
• fliCH7基因对检测O157:H7有辅助鉴定作用，但在
直接对样品进行快速检测时，用rfbE和fliCH7基因
同时检测O157:H7似乎没有意义，此方法更适用于已经分离纯化菌株的鉴定。
stx1 stx2 eaeA ehxA
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目的基因扩增结果
uidA rfbE fliCH7
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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多重PCR方法快速检测4种主要致腹泻性大肠埃希菌

多重PCR方法快速检测4种主要致腹泻性大肠埃希菌徐义刚;崔丽春;李苏龙;姜艳春;谢晓峰;刘新亮【摘要】肠毒素性大肠埃希菌(ETEC)、肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠出血性大肠埃希菌(EHEC)和侵袭性大肠埃希菌(EIEC)是引起腹泻的主要大肠埃希菌,威胁着食品安全和人类健康,建立同时检测4种致腹泻性大肠埃希菌的方法具有重要意义.基于ETEC LT肠毒素基因、EPEC bfpA基因、EHEC O抗原基因和EIEC侵袭性质粒特异性基因,设计了4对特异性引物,通过对单一PCR反应条件的优化建立了快速检测4种主要致腹泻性大肠埃希菌的多重PCR方法,彼此之间无交叉反应.该多重PCR方法具有良好的特异性和灵敏性,对24株致病菌进行检测,所试4株致腹泻性大肠埃希菌均为PCR阳性,其他菌株则为阴性.实践证明,利用所建立的多重PCR方法对124份肉类、奶类制品及人工污染样品等进行检测,检出15份阳性,与国标(GB 4789.6-1994)检测结果相同.结果表明本文建立的多重PCR方法可用于ETEC、EPEC、EHEC和EIEC的单一或混合感染的鉴别诊断及食品安全风险评估,具有良好的实用性.【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2010(030)003【总页数】5页(P25-29)【关键词】致腹泻性大肠埃希菌;多重PCR;快速检测【作者】徐义刚;崔丽春;李苏龙;姜艳春;谢晓峰;刘新亮【作者单位】黑龙江出入境检验检疫局,检验检疫技术中心,黑龙江,哈尔滨,150001;东北林业大学,黑龙江,哈尔滨,150040;黑龙江出入境检验检疫局,检验检疫技术中心,黑龙江,哈尔滨,150001;黑龙江出入境检验检疫局,检验检疫技术中心,黑龙江,哈尔滨,150001;黑龙江出入境检验检疫局,检验检疫技术中心,黑龙江,哈尔滨,150001;黑龙江出入境检验检疫局,检验检疫技术中心,黑龙江,哈尔滨,150001【正文语种】中文【中图分类】Q93大肠埃希菌(Escherichia coli)由Escherich于1885年首次发现,起初一直被认为是肠道菌群的正常组成部分,属于条件致病菌。