抑菌试验方案
抑菌试验方案
（一）病虫害的制备
1、病虫害的采集
本实验所用材料分病原菌及害虫两类。
其中病原菌分别从宣木瓜和丹皮两种地道药材植物上采集。宣木瓜的病原菌本实验室已有，并且提取了单一菌种。丹皮方面需要我们查阅资料以及请教师姐，把握最佳采集时间和采集类型，然后我们进行实地考察以及集采。采集丹皮根部，连同根部泥土带回。
（二）抑菌实验———滤纸片法（细菌）
1、 菌悬液制备
将供试菌种在各自适合的斜面培养基上和适宜的温度条件下(细菌37℃,霉菌28℃)于培养箱中培养活化(细菌24 h,霉菌48 h),备用。将活化后的供试斜面培养基用10 mL无菌生理盐水稀释制成含菌量为106～108个/ mL的菌悬液。
2、丝瓜伤流液滤纸片的制备及处理
0．2ml菌液对号接种于不同稀释度编号的培养，平放于实验台上20—30分钟，使菌液渗透入培养基内，然后再倒置于37℃的温室中培养。
2.3划线法分离
2.3.1、倒平板将加热融化的牛肉膏蛋白胨培养基和马铃薯蔗糖培养基分别倒平板，并标明培养基的名称。
2.3.2、划线
细滤纸,用钢笔套按一个圆印,剪下(一次剪4个),尽量剪圆。置于三角瓶中,塞上棉塞,高压蒸汽灭菌后浸泡于丝瓜伤流液中, 2 h后用无菌镊子夹出,在瓶口沥去多余丝瓜伤流液,即可贴入刚接种的器皿上。贴入时标记起始位置,按顺时针或逆时针方向将滤纸片顺序贴入。
3、抑菌试验
分别将配制好并已经灭菌的各种固体培养基趁热分别倒入无菌培养皿中,每皿15～20 mL(各皿量要相同),冷却凝固后用吸管吸取0.3 mL被试菌液,加到平皿上,用涂布棒涂布均匀。将灭菌的丝瓜伤流液滤纸片用无菌镊子夹取风干,放在含菌平板上,每皿3片,每种处理丝瓜伤流液做3次重复。细菌置于37℃培养24 h,霉菌置28℃培养48 h,测定滤纸片的抑菌圈直径大小,比较抑菌效果。
抑菌实验
一、菌种(一)、细菌：大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草杆菌（Bacillus subtilis）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）；(二)、真菌：啤酒酵母（Saccgaromyces cerevisiae）、米曲霉（Aspergillusoryzae）3402、黑曲霉（Aspergillus niger）、叶点霉（Phyllosticta maydis ）和刺盘孢霉（Colletotrichum musae）二、培养基（一）细菌培养液：LB液体：胰蛋白胨10.0g酵母提取物 5.0gNaCl 10.0g10mol/LNaOH 100μL蒸馏水定溶至1.0LpH 7.0~7.4如要配置固体LB培养基，加15.0g琼脂糖/L(二)、真菌培养液：马铃薯培养基(PDA)马铃薯(去皮切块) 200.0g葡萄糖 20.0g琼脂 18.0g，蒸馏水 1000mLpH 自然三、器材培养皿（90mm）、滤纸、三角耙、接种环、试管四、实验步骤(一)、抑菌圈的测定(滤纸片法)1、菌种接种将保存菌种反复转种2次，使菌种新鲜，细菌置30℃，温箱培养1d，霉菌置27℃，温箱培养3d，备抗菌实验用。
2、菌悬液制备在超净台里将转接后生长良好的菌种试管斜面注入适量无菌水(约5mL)，接种环轻刮菌落，摇晃，置旋涡混合器混匀。
3、倒平板在超净台里将培养基倒入平板，每板约15mL左右，水平放置，凝固后倒置放入30℃温箱中，2d后观察是否有菌落生长，若没有则可供下一步实验使用，否则需重新倒平板。
4、涂布在超净台里用枪取0.1ml菌悬液注入平板，放置5min左右后用三角耙涂布均匀，每种菌设置两个重复平板。
5、贴片在超净台里将平板平均分为6个区，对角设置平行组，同时用无菌水做对照组,硫酸链霉素(10U)作阳性对照。
每两张滤纸片(直径1.1cm或0.6cm)为一贴，用镊子夹着滤纸片在样品中轻轻蘸一下后，取出贴在平板的指定位置，轻摁一下使滤纸片牢固，置(正放)4℃冰箱中放24h。
抑菌试验方法
抑菌试验方法一、引言抑菌试验是一种常用的实验方法，用于评估不同物质对微生物生长的影响。
该试验可用于评估抗菌剂的效果、食品、药品和化妆品的微生物安全性，以及环境中抗菌材料的性能等。
本文将介绍抑菌试验的一般步骤和常用方法。
二、试验步骤1. 试验前准备在进行抑菌试验前，首先要准备好所需的试验材料和设备。
包括培养基、试验物质、细菌菌株、培养皿、试管、移液器等。
同时，要保持实验环境的清洁和无菌。
2. 菌种培养选择合适的细菌菌株，将其接种到含有适当培养基的试管中，并在37℃恒温培养箱中培养过夜，使其达到指定的细菌浓度。
3. 制备菌液将过夜培养的菌株转移到新的培养基中，通过菌液稀释法，制备出所需的菌液浓度。
菌液的浓度应根据试验要求进行调整。
4. 试验组装将试验物质分别添加到培养基或培养皿中，使其与菌液充分接触。
同时，设置对照组，用无抑菌物质的培养基或培养皿进行对照。
5. 培养条件将试验组和对照组置于适当的培养条件下，如温度、湿度等。
根据不同的试验要求，可选择不同的培养时间和培养条件。
6. 菌落计数在培养结束后，使用显微镜或肉眼观察试验组和对照组的菌落情况，并进行菌落计数。
菌落计数可通过平板计数法或滴定法进行。
7. 数据分析根据菌落计数结果，对试验组的抑菌效果进行评估。
常用的评估指标包括菌落形成率、抑菌率、最小抑菌浓度等。
三、常用方法1. 纸片扩散法该方法常用于评估固体试样的抑菌效果。
将试验物质涂布于纸片上，然后将纸片放置在含菌液的培养基表面上，通过观察菌落的生长情况来评估抑菌效果。
2. 悬浮液法该方法常用于评估液体试样的抑菌效果。
将试验物质与菌液混合，通过培养一定时间后，观察菌液的浑浊度或使用菌落计数法来评估抑菌效果。
3. 筛选法该方法常用于筛选具有抑菌活性的试验物质。
将试验物质与菌液混合后，通过培养一定时间后，观察菌落情况，筛选出对菌株有明显抑制作用的试验物质。
4. 斑点法该方法常用于评估试验物质对特定细菌菌株的抑菌效果。
抑菌实验程序
抑菌实验程序2 抑菌实验基本程序，先确定抑菌性，后确定最小抑菌浓度(活性)2(1 抑菌性实验:在灭菌平皿中加入牛肉汤培养基后，中间划一线，两侧点接药物和细菌，35?孵育16~20h，看菌与药物接触处菌落是否变形，若变形即为有抑菌性，可进行下面的实验 2(2 最小抑菌活性确定:思路:菌种准备—抗菌培养基(不同梯度剂量)—温育—观察生长情况—确定最小浓度方法:2(2(1 菌种准备:准备10支试管，排成1排，内置去离子水配成的生理盐水(0.8%), 除第1管加入10 ml外，其余每管加入肉汤9ml，在第1管加入活化的菌1-2环，混匀振荡后，吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第10管，并从第10管中吸取1ml弃去，(使用时可通过预实验数菌落数，也可以直接选用其中的第7，8管)即为浓度为104 CFU,一般可直接用于接种测试。
2(2(2 培养基制备:牛肉浸膏琼脂培养基，以1NNaOH或HCl调pH7.2~7.4,灭菌后备用2(2(3 梯度药物浓度培养基制备:准备十支灭菌水的试管，排成一排，除第1管加入1.6ml无菌水外，其余每管加入肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第9管，并从第9管中吸取1ml弃去，第10管为不含药物的生长对照。
根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在45~50?水浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度3~4mm。
通常按1?9比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。
2(2(4 含药平板上接种:将1中的菌点接在准备好的药物琼脂培养基3中，每点直径可以用灭菌的打孔器打孔，直径5-8mm,接好后置35?孵育16~20h，观察2(2(5 结果评定:将平板置于白色底衬下，确定抑制细菌生长的最低药物浓度，与生长对照比较抑制80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。
实验十二 抑菌实验
2.细菌接种 2.细菌接种
0.1ml含菌量相当于麦氏比浊管第 含菌量相当于麦氏比浊管第1 1/2的 每管加入 0.1ml含菌量相当于麦氏比浊管第1管1/2的 金黄色葡萄球菌(相当于1.5亿/ml)，操作术式如下表。 金黄色葡萄球菌(相当于1.5亿/ml)，操作术式如下表。 1.5
思考题
1.圆纸片药敏试验操作时应注意什么事项？ 1.圆纸片药敏试验操作时应注意什么事项？ 圆纸片药敏试验操作时应注意什么事项 2.试述药敏试验的意义 试述药敏试验的意义。 2.试述药敏试验的意义。
操作程序 （以葡萄球菌对青霉素的敏感性为例） 以葡萄球菌对青霉素的敏感性为例） 1.青霉素稀释 1.青霉素稀释
将装有1ml肉汤的试管排成一列，编上1 将装有1ml肉汤的试管排成一列，编上1～9的管号， 1ml肉汤的试管排成一列 的管号， 在第1管内加入含64IU/ml 青霉素肉汤1ml 1ml， 在第1管内加入含64IU/ml 青霉素肉汤1ml，混匀后吸取 1ml到第 到第2 混匀，再取1ml至第3 1ml至第 依次类推到第8 1ml到第2管，混匀，再取1ml至第3管，依次类推到第8管。 管不含青霉素的肉汤作对照管。 第9管不含青霉素的肉汤作对照管。
实表1 实表1 细菌对不同抗菌药物敏感度标准
药物名称 抑菌圈直径（mm）
无抑菌圈 ＜10 11～26 ＞26 无抑菌圈 ＜10 11～15 ＞15 无抑菌圈 ＜10 11～25 ＞25
敏感度
不敏感 低度敏感 中度敏感 高度敏感 不敏感 低度敏感 中度敏感 高度敏感 不敏感 低度敏感 中度敏感 高度敏感
青霉素（50μg/ml）
链霉素（500μg/ml）
新霉素（300μg/ml）
（二）最低抑菌浓度试验
原理：将抗菌药物作倍比稀释， 原理：将抗菌药物作倍比稀释，在不同浓度的稀释 管内接种被检细菌，定量测定抗菌药物的最 管内接种被检细菌， 低浓度。 低浓度。本结论可作为其他药物敏感性试 验的标准方法。 验的标准方法。 实验材料： 实验材料： • • • • • 金黄色葡萄球菌肉汤培养物 普通肉汤 含青霉素64IU/ml 含青霉素64IU/ml 的普通肉汤各一管 麦氏比浊管 灭菌1ml 1ml刻度吸管 灭菌1ml刻度吸管
几种常用抑菌试验方法的评价及比较
几种常用抑菌试验方法的评价及比较
在生物医学研究中，常需要对各种物质的抑菌效果进行评价。
为此，人们开发了多种常用的抑菌试验方法，以便比较不同物质的抑菌效果。
本文将对几种常用抑菌试验方法进行评价及比较。
1. 纸片扩散法
纸片扩散法是一种常见的抑菌试验方法。
在该方法中，将待测物质涂敷在纸片上，然后将纸片放在含有细菌的琼脂平板上，观察细菌生长情况以评价抑菌效果。
该方法具有操作简便、试剂消耗少等优点。
但是，由于涂敷纸片的方法、纸片的大小和厚度等因素可能会影响试验结果，因此需要进行标准化操作以提高试验的准确性。
2. 微量稀释法
微量稀释法是一种通过测定物质最低抑菌浓度来评价抑菌效果的方法。
在该方法中，将待测物质加入不同浓度的液体培养基中，然后加入一定量的细菌。
经过一定时间后观察细菌生长情况，以确定最低抑菌浓度。
该方法具有操作简便、结果可靠等优点。
但是，由于需要进行多次稀释以确定最低抑菌浓度，因此需要耗费大量试剂和时间。
3. 光密度法
光密度法是一种通过测定细菌生长的光学密度来评价抑菌效果的方法。
在该方法中，将待测物质加入液体培养基中，然后加入一定量的细菌。
经过一定时间后，使用光学密度计测定细菌培养液的光学
密度，以确定抑菌效果。
该方法具有准确度高、操作简便等优点。
但是，由于需要使用光学密度计，因此设备要求较高。
综上所述，不同的抑菌试验方法各有优缺点，选择合适的试验方法应根据实际需要和试验条件进行综合考虑。
抑菌效力试验方案
抑菌效力试验方案以下是 8 条主题为“抑菌效力试验方案”的内容：1. 想知道怎么检测那些小细菌是不是能被有效抑制吗？那就得好好设计这个抑菌效力试验方案啦！比如可以先准备不同的抑菌剂，就像给小细菌们准备不同的挑战。
然后把它们放到培养皿这个小战场上，看看哪种抑菌剂能大获全胜！这多有意思呀！2. 嘿，你难道不想搞清楚哪种方法对抑菌最有效吗？来看看这个抑菌效力试验方案呗！就好比一场细菌和抑菌剂的激烈比赛，我们得设置好各种规则和条件。
用不同的浓度、不同的时间去试探小细菌，这不就是在寻找最佳抑菌策略嘛！3. 咱来说说抑菌效力试验方案哈，这可关系到能不能真正把细菌给拿捏住呢！可以像排兵布阵一样安排不同的实验组，不就是和细菌斗智斗勇嘛。
比如一组用这个温度，另一组用那个环境，看谁能把抑菌这件事做得最漂亮！是不是很吸引人？4. 你说说，抑菌效力试验方案是不是超级重要呀！要不怎么知道哪种东西能强力抑菌呢！就好像玩游戏打怪兽，得有策略有方法呀。
选取合适的细菌样本，就像挑对手一样，然后用各种手段去挑战它们，这过程多带劲啊！5. 哎呀呀，抑菌效力试验方案可得好好弄啊！这就好像一场和细菌的赛跑，我们得规划好路线。
比如选择不同的培养基，就如同给细菌准备不同的跑道，看它们在什么样的条件下最容易被抑制，你不想知道结果吗？6. 抑菌效力试验方案，听起来就很有挑战性呢！就像搭积木一样，一层一层地构建。
先确定好试验的步骤，一步一步地来，这多像在小心翼翼地搭建一个城堡呀，最后能不能成功抵御细菌，可就看这方案啦，是不是很想参与进来？7. 快来看这个抑菌效力试验方案呀！是不是感觉就像要开启一场神秘的探险？把各种因素都考虑进去，就像是准备好探险的装备。
然后勇敢地去面对细菌，看谁能笑到最后，难道你不想见证这个刺激的过程？8. 抑菌效力试验方案真的很关键耶！。
抑菌试验
1.O/129抑菌试验（1）原理：0／129（二氨基喋啶）对弧菌属细菌有抑制作用，而对气单胞菌属细菌无抑制作用。
（2）培养基：碱性琼脂平板。
（3）方法：将待检菌均匀涂布于碱性琼脂平板上，镊取0／129纸片（含药40μg）贴于平板上，35℃培养l8～24h 观察结果。
（4）结果：出现抑菌环为敏感，无抑菌环为耐药。
（5）应用：用于弧菌科的属间鉴别，弧菌属、邻单胞菌属对0／129敏感，而气单胞菌属耐药。
2.杆菌肽试验（1）原理：A群链球菌对杆菌肽几乎全部敏感，而其他群链球菌绝大多数对其耐药。
（2）培养基：血琼脂平板。
（3）方法：将待检菌纯培养物（肉汤）均匀涂布于血液琼脂平板上，稍于后贴上0.04U／片的杆菌肽纸片，35℃培养l8～24h观察结果。
（4）结果：抑菌环直径>lOmm为敏感，抑菌环直径<lOmm为耐药。
（5）应用：用于A群链球菌与非A群链球菌的鉴别。
3.奥普托欣（Optochin）试验（1）原理：几乎所有肺炎链球菌对奥普托欣试验敏感，而奥普托欣试验对其他链球菌则无抑制作用。
（2）培养基：血琼脂平板。
（3）方法：将待检菌菌落或肉汤培养液均匀涂布于血琼脂平板上，稍干后贴上含5μg/片的Optochin纸片，35℃培养l8～24h观察结果。
（4）结果：抑菌环直径：>14mm为敏感，若抑菌环直径≤14mm，对此菌株应再做胆汁溶菌试验，以证实是否为肺炎链球菌。
（5）应用：主要用于肺炎链球菌与其他链球菌的鉴别。
抑菌试验
抑菌试验：用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。
通过抑菌实验,可以测定一个药物的最低抑菌浓度,用以评价该药物的抑菌性能,这是抗菌药物的最基本的药效学数据。
主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。
1.常量肉汤稀释法抗菌药物贮存液制备1.1.1.抗菌药物贮存液制备抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。
溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。
抗菌药物直接购自厂商或相关机构。
所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。
例如：需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。
用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。
根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg 抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。
制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。
配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过6个月。
药敏试验用抗菌药物浓度范围1.1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。
培养基1.1.3. 培养基NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。
需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。
在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。
嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。
接种物的制备1.1.4.接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。
抑菌效果的检测方法
抑菌效果的检测方法全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：抑菌效果的检测方法在实际生活中具有重要意义，特别是在医疗、食品加工等领域。
为了确保产品的安全性和质量，我们需要对抑菌效果进行有效检测。
本文将介绍一些常用的抑菌效果检测方法及其原理，希望能够为读者提供参考。
一、菌落计数法菌落计数法是一种常用的抑菌效果检测方法，通过计算样品中细菌的数量来评估其抑菌效果。
具体操作步骤如下：1.准备不同浓度的细菌溶液，分别涂抹在含有抑菌物质的培养基上。
2.将培养皿放入恒温培养箱中，培养一定时间后观察细菌的生长情况。
3.根据培养皿上形成的菌落数量，计算出细菌的数量。
4.通过比较不同样品中细菌数量的差异，评估抑菌效果的高低。
菌落计数法的优点是操作简单易行，可以快速获得结果。
但也存在一些局限性，比如只适用于某些特定细菌的检测，对于耗时长的样品测试不太适用。
二、最小抑菌浓度法2.将不同浓度的溶液与含有一定数量细菌的培养基混合。
3.培养一定时间后观察细菌生长情况，确定不同浓度下的最小抑菌浓度。
最小抑菌浓度法的优点是可以准确地确定抑菌物质的抑菌效果，并且可以比较不同抑菌物质之间的差异。
但需要较长时间进行实验，操作相对复杂。
三、透明圈法透明圈法是一种通过测定抑菌物质在琼脂培养基上形成的透明圈直径来评估其抑菌效果的方法。
操作步骤如下：1.将含有一定数量细菌的琼脂培养基均匀涂抹在平板上。
3.培养一定时间后观察琼脂培养基上形成的透明圈直径。
透明圈法的优点是操作简单，能够快速得出结果。
但其仅适用于一些能够形成透明圈的细菌，对于其他细菌可能不太适用。
在实际应用中，以上三种抑菌效果检测方法可以结合使用，以提高检测结果的准确性和可靠性。
还可以根据不同的需求选择合适的检测方法，以更好地评估抑菌效果。
希望本文能够对读者有所帮助，谢谢！第二篇示例：抑菌效果的检测方法是指在实验室环境中，通过一系列的实验方法检测杀菌剂或杀菌产品对细菌、真菌等微生物的杀灭效果。
抑菌实验方案
实验试剂：石膏样小孢子菌、PBS、0.9%生理盐水、RPMI-1640培养基
实验器材：电子分析天平、研钵、移液枪、离心管、96孔板
一.菌悬液的配制
1.无菌条件下，取3支石膏样小孢子菌试管斜面，加入无菌生理盐水适量（量少一点），用接种环轻轻挑取培养基表面的丝状培养物，倒入无菌的研钵中研磨。
2.从研钵中吸取菌液，放入离心管中，移液枪吸打混匀，15s内完成。
用血细胞计数板计数，将菌悬液的浓度配制成1×104-5×104CFU/mL。
二.凝集素的配制
1.准确称取1mg凝集素粉末，加入100ul的PBS配制成10mg/mL母液。
采用96孔板，用RPMI-1640培养基（pH为6.9~7.1）进行稀释母液稀释100倍(取7ul的母液加入693ul的培养基)，每排1~10孔依次加入90uL的培养基和90uL的100ug/ml凝集素。
2.在1~10孔中加入20ul菌悬液，第11孔中加入180ul无菌不含药物培养基和20ul菌悬液，作为生长对照。
第12仅加入200ul无菌不含药物培养基做阴性对照。
3.每个样品设置三个重复。
三.培养和抑菌结果判定
1。
将接种菌悬液的药敏板置于28℃恒温培养箱中培养，7d后取出，用酶标仪在450nm波长下测定其浑浊度，与生长对照组相比第一个浑浊度下降50%的样品浓度为该凝集素对菌株的MIC值。
RPMI．1640培养液：取RPMI-1640 10．49，用约800ml去离子蒸馏水溶解，加入MOPS 34．539，葡萄糖209，混匀后用Imol／LNaOH调pH为7．0(25℃)定容至1000ml。
用0．22l，tm滤
器滤过灭菌后4℃保存待用。
抑菌实验
四、抑菌试验1．Optochin敏感试验(1)原理：Optochin(奥普托欣)是盐酸乙基氢化羟基奎宁的商品名。
对肺炎链球菌有特异抑制作用，其作用机制可能是干扰叶酸生物合成作用，而对其它链球菌则无此作用。
(2)方法：用棉拭子将待检菌的肉汤培养物均匀涂布于血琼脂平板上，贴上一张含5μg奥普托欣纸片，置烛缸或二氧化碳孵箱，35℃孵育18~24h，观察结果。
(3)结果：抑菌圈直径大于14mm为敏感，小于或等于14mm为阴性。
(4)应用：主要用于肺炎链球菌（敏感）与其它链球菌（耐药）的鉴别。
2．杆菌肽敏感试验(1)原理：A群链球菌对杆菌肽几乎是100%敏感，而其它群链球菌对杆菌肽通常耐药。
故此试验可对链球菌进行鉴别。
(2)方法：用棉拭子将待检菌的肉汤培养物均匀涂布于血琼脂平板上，稍干后贴一张含0.04U 的杆菌肽纸片，置35℃孵育18~24h，观察结果。
(3) 结果：抑菌圈直径大于10mm为敏感，小于10mm为耐药。
(4)应用：主要用于A群与非A群链球菌的鉴别。
从临床分离的菌株中有5%~15%非A群链球菌也对杆菌肽敏感，如6%的B群链球菌、7.5%的C群链球菌和G群链球菌等。
3．O/129试验(1)原理：O/129（2，4二氨基-6，7-二异丙基喋啶）能抑制弧菌属、发光杆菌属和邻单胞菌属细菌生长，而气单胞菌属和假单胞菌属细菌则耐药。
(2)方法：用棉拭子将待检菌菌悬液均匀涂布于碱性琼脂平板上，将10μg/片及150μg/片的O/129诊断纸片贴于平板上，置35℃孵育18~24h，观察结果。
(3)结果：出现抑菌圈者表示敏感，无抑菌圈者为耐药。
(4)应用：主要用于弧菌属、邻单胞菌属与气单胞菌属的鉴别，弧菌属和邻单胞菌属菌为敏感，气单胞菌属菌为耐药。
其它菌属有发光杆菌属为敏感，假单胞菌属为耐药。
细菌药敏试验2010-12-09 15:40:52| 分类：专业文章 | 标签：高校公共卫生 |字号订阅各种病原菌对抗菌药物的敏感性不同，同种细菌的不同菌株对同一药物的敏感性有差异，检测细菌对抗菌药物的敏感性，可筛选最有疗效的药物，用于临床，对控制细菌性传染病的流行至关重要。
检验操作规程(抑菌试验)
5.1 抑菌片的制备
按照要求将抑菌剂配置成试验所需浓度。取干燥备用的滤纸片，每片滴加20ul抑菌剂置37℃温箱或室温干燥备用。（溶出性抗抑菌产品，可直接制成直径为5mm，厚不超过4mm圆滤纸片，每片滴加无菌蒸馏水或抑菌剂溶剂20ul，干燥备用。
5.3 试验菌的接种
7.3 应保持琼脂浓度的准确性，否则可影响抑菌环的大小。
7.4 培养时间不得超过18h。培养时间过久，部分细菌可恢复生长，抑菌环变小。
7.5 抑菌环直径可受抑菌剂的量、抑菌性能和干湿度影响。故抑菌剂滤纸片应在试验当天制备。
6 判定规则
6.1抑菌环直径大于7mm者，判为有抑菌作用
6.2抑菌环直径小于或等于7mm者，判为无抑菌作用
6.3所有抑菌剂试验样片均有抑菌作用者，判为合格
6.4阴性对照组应无抑菌环产生，否则试验无效
7 注意事项
7.1 每次试验均应设置阴性对照，不可省略。报告中亦必须将对照组结果列出。
7.2 接种用细菌悬液浓度应符合要求。浓度过低，接种菌量少，抑菌环常因之增大，浓度过高，接种量过多，抑菌环则可减少。
用无菌棉拭子蘸取浓度为5×105cfu/ml～5×106cfu/ml试验菌悬液，在营养琼脂培养基平板表面均匀涂抹3次。盖好平板，置室温干燥5min。
5.4 抑菌剂样片贴放
每次试验贴放4个染菌平板，其中3个平板每个贴放1片试验样片，另外一个平板贴放1片阴性对照样片，用无菌镊子取样片贴放于平板表面。贴放好后，盖好平皿，置37℃培养箱培养16～18h观察结果。用卡尺测量抑菌环的直径（包括贴片）并记录。（测量抑菌环时，应选均匀而完全无菌生长的抑菌环进行。测量其直径应以抑菌环外沿为界）
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抑菌试验
1.2方法L2.1菌液制备将试验菌分别接种于肉汤培养基(金葡菌和大肠杆菌接种于营养肉汤,无乳链球菌接种于叠氮化钠葡萄糖肉汤)于37e培养箱培养18小时后,以倾注平板法培养计数,用无菌生理盐水稀释到含菌数为106cFu加LL备用"1.2.2药液稀释每组取8支试管,在一支试管加入smL原/乳炎康注射液,,药液,然后用灭菌肉汤进行倍比稀释,第2管至第6管中先后各加入2.smL灭菌肉汤,从第1管中取2.smL药液至第2管,混匀后取2.smL至第3管,依次类推,至第6管取2.smL弃之"使得第1至第6管药液浓度分别为50Omg/mL!250mg/mL!125mg/mL!62.5m留mL!31.25m留mL!巧.625mg/mL,第7管为smL无药液肉汤对照管,第8管为药液对照管"1.23细菌接种和琼脂平皿培养各试管中分别加入上述制备的菌液0.lmL,摇匀后置于37e恒温培养箱内培养24h,再于各试管中取样分别接种于各琼脂平皿,金黄色葡萄球菌接种于普通营养琼脂平皿;无乳链球菌接种于羊鲜血琼脂平皿;大肠杆菌接种于麦康凯琼脂平皿"置于37e恒温箱内再培养18一48h,在培养1811,24h和48h分别观察细菌生长情况"1.2.4最小抑菌浓度的判定以琼脂平皿中无细菌生长的试管药液浓度判定为/乳炎康注射液0的最低抑菌浓度(MIC)"2结果金黄色葡萄球菌在含药液浓度为50omg/mL浓度的肉汤中不生长,低于此浓度以下时生长良好;无乳链球菌在125m岁m工浓度以上的肉汤中不生长;大肠杆菌在25Omg/mL浓度以上肉汤中不生长"/乳炎康注射液0在肉汤中对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(Mlc)为500mg/mL,对无乳链球菌的MIC为125mg/mL,对大肠杆菌的呱C为25Om留mL"制备工艺金银花!蒲公英加水浸泡后.蒸馏.收集300ml蒸馏液"蒸馏后的药物渣与其他药物加水煎煮两次,第一次1.几.第二次1.Oh,合并煎液,#放冷,加入95%乙醇,使得药液乙醇浓度为85%,密闭冷藏24h,过滤,回收乙醇,药液冷却后再加入95%乙醇,使得酒精浓度达75%,冷藏抖11,j二滤,回收乙醇.药液减压浓缩至400耐"与蒸馏液合并,加入2%药用碳作用10二ill后过滤,调pH值至药液澄清,加入2%吐温一80和0.01%EDTA,静止后过滤.分装.灭菌.活菌平板计数法将被检菌株分别划线接种于固体培养基,金黄色葡萄球菌接种于却莆曼琼脂培养基,大肠杆菌接种于麦康凯琼脂培养基,无乳链球菌接种于绵羊鲜血琼脂培养基,置37e培养24h"在大肠杆菌麦康凯琼脂培养基平皿上挑选光滑!圆整的红色菌落1个,接种普通肉汤培养基中,置37e振荡培养16一20h"在一排小嫩底试管中先加稀释液灭菌生理盐水,第1管加1.smL,从第2管起各管加0.gmL,取0.2mL细菌原液加入第1管中,作为第1个稀释浓度,接下来从第1管中取0.lmL加入第2管,作为第2个稀释度,依次类推进行一系列稀释,从第1管10倍稀释到10.9,然后取106,107,105,109四个稀释度中菌液0.lmL进行涂板,每个稀释度涂3块板,置37e倒置培养24h"选取菌落数介于30一300之间的平板作为有效计数平板,取3块板的细菌平均数乘以稀释倍数再乘以10,即为被检细菌原液中每mL细菌活菌数"金黄色葡萄球菌和无乳链球菌同大肠杆菌的计数方法进行平板计数".用无菌生理盐水稀释到含菌数为106cFu/mL备用.药物敏感试验在倒好的M一H琼脂平板上倒入0.2mL以校正好的细菌悬液(1护CFu/mL),用无菌棉拭子涂匀"平板加盖放置干燥至少3min,但不得超过巧min,用无菌镊子将药敏纸片贴在涂好菌液得平板上,各纸片中心相距至少24Inlll,两纸片中心至少30~"在15min内将平板置37oC培养18一24h"最低抑菌浓度(MIC)的测定按微量稀释法(microdilution)进行:先准备13支灭菌试管,每管加肉汤回,第1管加药物稀释液Inil,混合后取Inil加入第2管,依次倍比稀释到第13管(此时第1一13管药液浓度依次为:1280一0.3125u留而)"取u型底96孔聚苯乙烯微孔板,经紫外消毒,用微量移液器在每孔中加入上述稀释好的药液,浓度由低到高,每孔50ul,至第13孔,第14孔加肉汤IO0ul(空白对照),第15孔加药液100ul(药物对照),第16孔加肉汤SOul(菌液对照),1一13孔及第16孔加入上述制备好的应用菌液,每孔SOul,加液完毕盖上消毒玻板,振荡混匀,放入垫有湿纱布的方盘内,36e培养18一24h,观察结果"中药制备每味中药及方剂均按水提法进行制备。
抑菌圈法实验流程
抑菌圈法实验流程抑菌圈法（Kirby-Bauer法）是一种常用的抗菌药物敏感性试验方法，用于评估抗菌药物对细菌的抑菌效果和选择性。
实验流程如下：1.材料准备- 霍乱弧菌（Vibrio cholerae）培养基：将霍乱弧菌分离菌落接种到琼脂平板上，培养过夜。
-纯培养的霍乱弧菌菌液：选择一颗单菌落，将其转移到无菌培养基中，培养到对数生长期。
-抗菌药物纸材：将抗生素敏感纸片切成适当大小的圆片。
-灭菌钎子：用于将纸材固定在平板上。
-显微镊子：用于取出抗生素纸片。
2.制备琼脂培养基平板-在无菌条件下，将琼脂培养基加热至溶解。
-将琼脂培养基均匀倒入培养皿中。
-放置琼脂培养基凝固。
3.制备菌液悬液-用无菌生理盐水洗涤培养的霍乱弧菌菌落，使其悬浮在生理盐水中。
-用光度计测量悬浮液的浓度，调整到0.5的麦克斯韦尔稀释系数。
4.菌液接种-用梅林巴赫管（或吸管）吸取菌液悬液，通过刮平盖玻片法将其涂抹在琼脂平板上。
-用无菌棉签将菌液均匀涂抹在琼脂平板上。
5.抗生素纸片覆盖-用灭菌钎子将抗生素纸材固定在琼脂平板表面。
-用无菌镊子将预先标定好的抗生素纸片覆盖在菌液层上。
6.孵育-将平板倒置，放入37℃恒温培养箱中孵育24小时。
7.测量抑菌圈直径-孵育后，观察平板上的抗生素纸片周围是否出现抑菌圈。
抑菌圈呈透明带状。
-用尺度卡测量抑菌圈的直径。
8.数据分析-根据抑菌圈的直径，查阅相关参考表确定该抗生素对该菌株的敏感性。
注意事项：-所有步骤都要在无菌条件下进行，以避免外部细菌的干扰。
-保持实验环境的洁净和安全，并进行相应的实验室安全措施。
-实验中要保持手部和工具的清洁，避免交叉污染。
-实验后应妥善处置实验废弃物，如纸材和实验用具。
抑菌圈法是一种简单、可靠的药敏试验方法，可用于评估抗生素的抑菌效果和终止治疗浓度建议。
通过该试验可以指导临床医生合理使用抗菌药物，防止药物滥用和耐药菌株的产生。
同时，该方法也可以用于研究新发现的抗生素的抗菌特性和敏感度。
药物的体外抑菌试验
实验五药物的体外抗菌试验药物的抗菌试验是为了检查药物的抗菌能力。
该项试验方法已广泛应用于新药研究和指导临床用药。
如抗菌药物的筛选，提取过程的生物追踪、抗菌谱的测定、耐药谱的测定、药敏试验、药物血浓度测定等各个方面.药物的体外抗菌试验在实验室进行，优点是方法简便、需时短、用药量少,不需要活的动物、实验条件容易控制.因此，药物的体外抗菌试验已广泛应用各种测定了.药物的体外抑菌试验是常用抗菌试验方法,其中最常用的方法用系列稀释法和琼脂扩散法.(一)稀释法（结果示教）稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种.这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度,通常用μg∕ml或U/ml表示.（二）琼脂扩散法它是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面,抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散,其浓度随扩散距离增大而降低,在药物一定的扩散距离内，由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长，此无菌生长的范围称为抑菌圈，抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比.琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法.滤纸片法（K—B纸片法)－学生操作滤纸片法是最常用的方法，适用于新药的初筛试验（初步药物是否有抗菌作用)及临床的药敏试验(细菌药物第三性试验、以便选择用药）.滤纸片分湿、干两种，可以在试验时用无菌纸片沾取药物溶液放在含菌的平板表面，也以预先做成一定浓度的干燥纸片。
一般来说预先做成的干燥纸片实用一些而且准确一些.至于干燥纸片的制备方法：选用吸水力强而且质地均匀的滤纸，用打洞机制成6mm直径的圆纸片，120℃干燥灭菌2小时.然后把配制好的各种适宜浓度的抗生素溶液，每100张纸片加入0。
5ml药液,使它均匀浸润,放在无菌平皿中，37℃，使它干燥，分装小瓶中，封口，4℃保存.如果是β－内酰胺类抗生素还要放在—20℃保存.这就制成了干燥的含药液的纸片。
一般药敏试验常采用滤纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性,是敏感，中度敏感还是耐药。
抑菌试验
在牛津杯周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制， 形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度 （药敏实验）或药物对指示细菌的抑菌程度（抑菌 试验）。
实验三 牛津杯法抑菌试验 （杯碟法）
扩散法又包括纸片法、牛津杯法和打孔法。 由于扩散法操作简单，成本低，已经被大多数 实验室和基层单位所采用
BETTER
稀释法包括试管稀释法和微量稀释法，通 过测试细菌在含不同浓度药物培养基内的 生长情况，判断其最低抑菌浓度（MIC）。
扩散法
一、实验原理
一、实验原理
抗生素浓度越高，抑菌圈越大。 在抑菌圈的边缘处，琼脂培养基中所含抑菌
物质的浓度即为该菌悬液中对该种指示菌的 最低抑菌浓度（MIC） 。 抑菌圈直径与药物对测试菌的最低抑菌浓度 呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
二、实验材料
培养基： 牛肉膏蛋白胨固体培养基 菌种：
大肠杆菌（E.coli) 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus) 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis) 药品：阿莫西林、黄芪多糖、 其他：牛津杯、培养皿、酒精棉、酒精灯、涂布器、 移液枪、 1mL、200uL 枪头、 恒温培养箱、 超净工 作台、接种环
牛津杯
注意事项
在超净工作台中或酒精灯旁操作 平板倒好，一定要平 牛津杯立直，才能保证杯内抑，位置安排适
中，防止出现抑制圈重叠，可在平皿中央 摆一个，外周等距离摆5－6个。
思考题
青霉素、头孢菌素类药物的抗菌机制如何？
抑菌实验原理
抑菌实验原理
抑菌实验原理
抑菌实验是一种常用的实验方法，用于评估化合物或制剂对细菌生长的影响。
其原理基于抗菌剂与细菌的相互作用，通过评估化合物对细菌的生长抑制能力来确定其是否具有抗菌作用。
实验步骤：
1.选取需要评估的细菌株并培养：在实验开始前需要选择优良的细菌株并进行培养。
培养条件需要与实验条件一致并注意菌群的纯化。
2.稀释细菌悬液：选择的细菌株需要用生理盐水等稀释至指定的浓度，以便更好的观察和比较细菌生长的情况。
3.加入待测化合物：将待测的化合物加入到试验瓶或板中，使其充分均匀地分布。
4.接种细菌悬液：将稀释好的细菌悬液分别分装进试验瓶或板中，在培养条件下进行生长。
5.生长评估：观察并记录细菌的生长情况。
在实验中，对于不同的细菌株和化合物，其作用机制和实验设置可能不尽相同。
但是无论是哪种情况，都需要关注细菌与化合物之间的交互关系，在实验过程中充分考虑到实验因素的影响。
此外，在实验过程中也应注意安全和环境保护问题。
实验室要做到整洁和齐全，使用化学品和试剂时避免摆放在易碎和易燃物品附近。
实验后的废弃物要做好分类处理，以免对环境造成污染。
总的来说，抑菌实验是一种简单而有效的方法，用于评估化合物的抗菌能力。
在实验过程中需要注意安全和环保问题，并在实验设计和数据处理中严谨科学，以做到准确评估化合物的抑菌能力。
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利用吸附法测定壳聚糖无纺布抑菌性能试验方案
一、实验原理：本实验参考了国标GB/T20944方法，根据我们的材料特性进行了微调。
即：选取革兰氏阴性菌（大肠杆菌（25922））和革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌（25923））两类代表性指示微生物。
将测试材料浸泡在活化好的菌悬液（浓度控制为107CFU/ml）中，设置不同处理时间，稀释涂布，平板单菌落计数，计算无纺布材料的抑菌性能。
二、实验方法：
2.1试验菌种的活化
1）冻干粉接种至大豆蛋白肉汤(TSB)培养基，37℃培养24h。
一部分用于抑菌试验，另一部分用于划线接种至斜面或平皿冷藏保藏（可保藏1个月）。
2）培养液稀释。
活化好的菌悬液用稀释液稀释20倍，取1ml培养液添加到19ml稀释液（应提前灭菌）中。
3）式样预处理。
大小合适的试样饱和吸水，灭菌处理。
（周教授负责）
4）菌悬液洗涤。
将稀释好的菌悬液转移到试样中，分别震荡15min 和30min，为防止微生物传代，影响试验结果，立即放入冰箱冷藏。
5）洗涤液梯度稀释。
处理后的洗涤液立即梯度稀释到10-1, 10-2,10-3,10-4和10-5。
具体方法：取1ml洗涤原液加入9ml稀释液此时为10-1梯度；取1ml稀释后的10-1菌液加入到9ml稀释液，此时为
10-2梯度；······。
6）涂布。
分别取10-3,10-4和10-5的稀释液200ul涂布到平板（计数培养基，简称EA），每个处理做2个平行，37℃，培养24-48h，计数。
7）抑菌效果评价。
参照GB/T20944。
三、试验简易流程
注：如果活化后的菌液浓度较高，可取10-4、10-5和10-6梯度稀释液涂布。
四：所需准备耗材：
1、大豆蛋白液体培养基（7.1，TSB）
250ml培养瓶装100ml 3瓶，2瓶分别接种，1瓶备用；
2、大豆蛋白固体培养基,（7.2，TSA）
250ml培养瓶装100ml 1瓶，到平板后用于菌种保藏；
3、稀释液（7.5）
15或18ml试管装9ml 50支，42支稀释，8支备用；4、计数固体培养基（7.6，EA）
250ml培养瓶装160ml 6瓶，准备50皿。
5、枪头5ml，1ml，200ml枪头各1盒。
6、75%酒精及棉球若干，玻璃棒15支
7、记号笔，标签纸若干。