生物技术 3. 酶工程

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酶分离纯化常用方法
性质

方法
透析、超滤、差速离心、凝胶过滤 等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀
分子大小 溶解度


电荷
吸附性质 对配体分子
电泳、离子交换层析
吸附层析
的生物亲和力 亲和层析
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（1）酶分离的沉淀技术 1）盐析———溶解度的差异
向蛋白质溶液中加入大量的中性盐 [（NH4)2SO4，Na2SO4，NaCl]，当溶液的离子强 度增加到一定数值时，蛋白质溶解度开始下降。 当离子强度增加到足够高时，例如饱和或半饱 和的程度，很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出 来，这种现象称为盐析（salting out）。 盐析沉淀一般不引起蛋白质变性。当除去 盐后，复可溶解。
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盐溶
盐溶—盐析
• 等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉 淀溶解—盐溶 • 原因？
分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少
量盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶 2012-10-10
于水中(此时称为盐溶）
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盐析（（NH4）2SO4）
盐析
• 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白 质会沉淀析出 • 原因？
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4）等电点沉淀法——溶解度的差异
• 蛋白质是两性电解质，其溶解度与其净电荷 数量有关，随溶液pH变化而变化。在溶液pH值 等于蛋白质等电点时，蛋白质的溶解度最小。 • 不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调 节溶液pH到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而 与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。 一般用于酶的粗分离。
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3)有机溶剂沉淀法——溶解度的差异 与水互溶的极性有机溶剂如甲醇、乙醇、丙酮 等能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。 • 室温下，这些有机溶剂不仅能使蛋白质沉淀， 而且伴随着变性。若预先将有机溶剂冷却至0℃ 以下，然后在不断搅拌下将其逐渐加入蛋白质溶 液中，防止有机溶剂局部浓度过高，则在很大程 度上解决变性问题。 • 不同的蛋白质由于水化层厚度不同，发生沉 淀需要的有机溶剂浓度不同，因此可利用不同浓 度的有机溶剂分离不同的蛋白质。
(NH4)2SO4
血清
50%饱和度
球蛋白
析出
清蛋白
饱和
析出
分子量越大，沉淀所需盐的量越少；
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• 2）PEG沉淀法———溶解度的差异 • 空间排阻学说：PEG分子在溶液中形成 网状结构，与溶液中的蛋白质分子发生空间排 挤作用，从而使蛋白质分子凝聚而沉淀下来。
• PEG是一种特别有用的沉淀剂，因为无毒，不 可燃性且对大多数蛋白质有保护作用。PEG沉 淀法能在室温下进行，得到的沉淀颗粒较大， 收集容易。
其中固定化酶技术是酶工程的核心。实际上 有了酶的固定化技术，酶在工业生产中的利用价 值才真正得以体现。
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一、酶制剂的生产
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（一）酶的提取与分离纯化 目的：把酶从生物体中提取出来，使之与杂质 分开而达到与使用目的相适应的纯度；防酶变 性失活。
1.酶生产原料选择 （1）对酶源的要求 1）酶含量丰富 2）提取、纯化方便 （2）微生物作为酶的优势 1）易得到所需的酶类 2）易获得高产菌株 3）生产成本低 4）微生物生长周期短 5）提高微生物产酶能力的途径较多
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常用支持介质：琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚 丙烯酰胺凝胶，其中聚丙烯酰胺凝胶最常用 载体两性电解质:一系列脂肪族多氨基多羧酸同 系物和异构体，具有很多既不相同又十分接近 相互连接的pI值。在外电场作用下，自然形成 pH梯度，是一种特殊的缓冲液。 加成反应 丙烯酸+多乙烯多胺→→→ Ampholine（LKB）
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一维电泳
非变性电泳(native PAGE)：
迁移率由分子大小、分子形状、净电荷多少决定。
SDS-PAGE（变性聚丙烯酰胺凝胶电泳）
在凝胶与缓冲系统中加入阴离子表面活性剂十二
烷基硫酸钠（SDS），蛋白质分子被大量SDS阴离子
包裹，消除了它们间原来携带的电荷差别，电泳时
蛋白质向正极移动。因而其迁移率仅反映蛋白质分
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• 浓度梯度凝胶电泳 从凝胶顶部到底部丙烯酰胺的浓度呈梯度变化，如 通常顶部凝胶浓度为5％，底部凝胶浓度为25％。 • 梯度凝胶比单一浓度凝胶的分离范围更宽，可以 同时分离较大范围分子量的蛋白质。
• 另一个优点是梯度凝胶可以分辨分子量相差较小， 在单一浓度凝胶中不能分辨的蛋白质。
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㈢电泳结束后的变化 所有的载体两性电解质分 子以增加pI级数的办法将 分别在阳、阴极之间到达 它们自己的位置而给出一 个pI梯度。 蛋白质在此pH梯度凝胶 中泳动，当迁移至pH值等 于pI处时，就不再泳动， 而被浓缩成狭窄的区带。
pH范围：pH3~10
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㈠没通电时的变化 所有的载体两性电解质分子都荷电，只是 溶液中荷正电和荷负电的基团数目相等，净电 荷为零。
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㈡引入电场时的变化
载体两性电解质分子 将向阴极或阳极迁移，带 有最低等电点的分子（荷 最多的负电）将最快地向 阳极迁移。当它达到净电 荷是零的位置时才停止。 其次一些低pI的载体 两性电解质分子（荷其次 多的负电）也将向阳极移 动，直到它的净电荷被减 少到零才停止。
第二章 酶工程
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• 酶工程是现代酶学理论与化工技术的交叉技 术，是在一定的生物反应器中，将相应的原 料转化成所需的产品。它的应用主要集中于 食品工业、轻工业、医药工业和环保等领域。
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酶工程的内容 （1）对天然酶的开发和生产（包括微生物酶的 发酵和提取以及从动植物中提取酶的技术）、包 括酶的分离纯化及鉴定技术； （2）酶分子的修饰技术，人工设计及与其他生 应 物技术领域的交叉和渗透。 用 （3）酶的固定化技术（酶和细胞固定化）； （4）酶反应器的研制和应用；
1）凝胶过滤层析：分离酶蛋白时，分子大小大
于凝胶孔径的蛋白被凝胶排阻，因而在凝胶颗粒间隙中 移动，速度较快；小分子蛋白质则可自由出入凝胶颗粒 的小孔内，路径加长，移动缓慢。这样通过一定长度的 凝胶层析柱后，大小不同的分子蛋白就被分开了。
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Gel Filtration.swf
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ห้องสมุดไป่ตู้
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2）离子交换层析法 原理:不同蛋白质等电点不同,在同一pH介质 中电离情况不同，分子所带电荷不同,与离子交换 剂的吸附能力不同. 将离子交换树脂装入层析柱。
带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有 负电荷的称之阳离子树脂。阴离子交换基质结合 带有负电荷的蛋白质，阳离子交换基质结合带有 正电荷的蛋白质.
蛋白质脱去水化层而聚集沉淀
当盐浓度不断上升时，蛋白质和酶的溶解度又以不同程 度下降并先后析出，称为蛋白质的盐析。
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分段盐析
不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极 性基团的种类、数目以及排布的不同，其水 化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不 一样，因此调节蛋白质中盐的浓度，可以使 不同的蛋白质分别沉淀。如：
DY89-I型 电动玻璃匀浆机
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高 压 细 胞 破 碎 机
细 胞 破 碎 珠
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3、酶的生产及分离纯化
超滤 透析
粗提酶液→脱盐 凝胶过滤 离子交换浓缩 →浓缩 凝胶干燥 →分离 凝胶色谱层 析等
离子交换层 析
亲和层析
→纯化 等电聚集 等 →酶的结晶
一种新型的微生物酶纯化手段——制备型聚丙烯 酰胺凝胶电泳 (未被广泛应用于酶的制备)
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Ion Exchange
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离子交换层析的基本原理 物质在树脂上结合的牢固程度即亲和力大小有 差异，因此选用适当的洗脱液便可将混合物中 的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。
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3） 亲和层析法
原理：利用生物大分子间特异的亲和能力来纯化生 物大分子，如：抗原和抗体；酶和底物或辅酶或 抑制剂；激素和受体；RNA和其互补的DNA等。 将待纯化物质的特异配体通过适当的化学反应共 价的连接到载体上，待纯化的物质可被配体吸附， 杂质则不被吸附，通过洗脱杂质即可除去。被结 合的物质再用洗脱剂把它从柱上洗脱下来。
子大小，故广泛用于蛋白质分子量的测定。
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支持物：聚丙烯酰胺凝胶。具有分子筛的作用。
凝胶的孔隙大小通过适宜的浓度和加入交联剂（亚甲 基双丙烯酰胺）加以控制
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电泳条带
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水平板式电泳槽
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• PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不 连续系统两大类， • 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相 同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分 子筛效应。 • 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶 浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场 中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有 浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均 较前者佳。
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在蛋白质组学中对电泳的分类
一维电泳(one dimensional gel electrophoresis, 1DE)，现在普遍采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE）
二维电泳(two-dimensional gel electrophoresis, 2DE)，又称双向电泳