细胞培养—传代—冻存—western blot等实验相关步骤
细胞培养实验步骤大全(精华版)
细胞培养实验步骤大全(精华版)细胞培养是生物学研究中常用的技术，在许多实验室中都扮演着重要角色。
下面是细胞培养的一般步骤，供参考。
材料准备1. 细胞培养基：根据实验需求选择适当的培养基，如DMEM、RPMI 1640等。
2. 细胞培养器具：培养皿、离心管、移液器等。
3. 细胞培养室：确保环境清洁、无菌。
细胞准备1. 细胞来源：选择要培养的细胞系或原代细胞。
2. 细胞传代：如果使用的是细胞系，根据需要进行传代，确保细胞状态良好。
细胞培养1. 细胞计数：使用显微镜和细胞计数仪等工具，准确计算细胞数目。
2. 细胞接种：按照实验要求，在含有培养基的培养皿中接种适量的细胞。
根据细胞类型的不同，可能需要预先涂覆培养皿。
3. 细胞培养条件：根据细胞类型的要求，提供适宜的培养条件，如温度、湿度和CO2浓度等。
4. 培养培养：定期更换培养基，保持细胞处于良好的生长状态。
5. 细胞观察：使用显微镜观察细胞形态和生长情况，检测是否存在异常。
细胞处理1. 细胞传代：根据细胞数量和状态，决定是否进行细胞传代。
传代可以延续细胞的寿命和维持细胞应答。
2. 细胞刺激：根据实验设计，给予细胞适当的刺激，如添加药物、因子或介质等。
3. 细胞采集：当需要获取细胞样本时，使用细胞剥离剂或胰蛋白酶等方法将细胞从培养皿中采集。
4. 细胞冻存：如果需要长期保存细胞，可以使用液氮冷冻保存的方法。
先加入冻存液，然后将细胞在适当条件下冷冻保存。
以上是细胞培养的一般步骤，根据具体实验和细胞类型，步骤可能会有所调整和细化。
在进行细胞培养实验时，请始终注意无菌操作和合理使用实验工具，以确保实验结果的准确性和可靠性。
细胞实验的基本操作方法
细胞实验的基本操作方法
细胞实验的基本操作方法可以包括以下步骤：
1. 细胞培养：将待实验的细胞株从冷冻保存中取出，放入无菌培养皿内，并加入适宜的培养基。
设置适当的培养条件，如温度、湿度和二氧化碳浓度等。
定期观察细胞生长情况并进行细胞的传代。
2. 细胞传代：当细胞培养达到一定密度时，将细胞通过酶消化方法从培养皿中取出，然后转移到新的培养皿中重新培养。
该方法可以获得更多的细胞数量，以维持细胞培养的供应。
3. 细胞分离：对于某些实验需要用到单独的细胞的情况，可以采用细胞分离的方法，如通过胰蛋白酶消化细胞外基质、抑制细胞黏附等，使细胞单个分散。
4. 细胞检测：使用显微镜观察细胞的形态变化，细胞生长情况和细胞颜色等。
也可以利用荧光显微镜观察细胞内的特定荧光标记物，如细胞核染色剂、蛋白质荧光探针等。
5. 细胞培养基交换：定期更换细胞培养基，以保持细胞的生长状态和代谢活性。
6. 细胞处理：根据实验需要，在培养皿中添加不同浓度或种类的化合物，如药物、抗生素等，对细胞进行处理。
7. 细胞采集：根据实验需求，利用细胞刮刀、吸球等方法将细胞从培养皿中收集起来。
8. 细胞冻存：将细胞保存在液氮中，以便长时间保存和后续使用。
9. 细胞裂解：对于某些实验需要提取细胞内的特定分子或蛋白质，可以使用细胞裂解液将细胞内组分释放出来。
10. 细胞计数：通过显微镜或细胞计数仪等方法，对细胞数量进行计数和测定。
请注意，具体细胞实验的操作方法可能因不同的实验目的和细胞类型而有所差异，上述仅为一般的基本操作方法。
在进行细胞实验时，应严格遵守相关实验室规范和安全操作指南。
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编.doc细胞培养传代、冻存、复苏操作规程第一章总则第一条目的为规范细胞培养实验室的操作流程，确保细胞培养的质量和安全，特制定本操作规程。
第二条适用范围本规程适用于所有进行细胞培养、传代、冻存和复苏的实验室人员。
第三条安全与健康实验室人员在操作过程中必须遵守生物安全和个人防护的相关规范。
第二章细胞培养传代第四条传代前的准备检查细胞培养基、血清、胰蛋白酶等消耗品的质量和数量。
确保无菌操作台、培养箱、显微镜等设备正常运行。
第五条传代操作步骤细胞观察：在显微镜下观察细胞形态，确认细胞健康状况。
培养基更换：使用无菌操作吸去旧培养基，加入适量的胰蛋白酶。
细胞分离：待细胞变圆后，轻敲培养瓶，使细胞脱落。
细胞计数：使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
细胞传代：根据细胞密度和传代比例，将细胞加入新的培养基中。
第六条传代后的观察观察细胞在新培养基中的附着情况。
定期检查细胞的形态和生长状态。
第三章细胞冻存第七条冻存前的准备准备冻存管、冻存液（含DMSO）、标签等。
确保液氮罐或程序降温仪处于良好状态。
第八条冻存操作步骤细胞计数：确保细胞密度和活力符合冻存要求。
冻存液配制：按照比例加入DMSO至冻存液中。
细胞悬液制备：将细胞与冻存液混合均匀。
细胞冻存：将细胞悬液分装至冻存管中，标记信息。
降温过程：将冻存管放入程序降温仪或直接浸入液氮中。
第九条冻存后的管理将冻存管放入液氮罐中，记录存放位置。
定期检查液氮罐的液位和温度。
第四章细胞复苏第十条复苏前的准备准备培养基、胰蛋白酶、无菌操作台等。
检查培养箱、显微镜等设备是否正常。
第十一条复苏操作步骤取出冻存管：从液氮罐中取出所需冻存管。
快速解冻：将冻存管置于37°C水浴中快速解冻。
细胞悬液制备：将解冻后的细胞迅速转移到含有培养基的离心管中。
离心去除DMSO：低速离心以去除DMSO。
细胞培养：将细胞重悬于新鲜培养基中，转入培养瓶中培养。
WB实验步骤详解
WB实验步骤详解Western blotting（简称WB）是一种常用的蛋白质检测技术，通过将蛋白质分离、转移和检测，可以用来确定特定蛋白质的存在和表达水平。
本文将详细介绍WB实验的步骤，以帮助读者了解该技术的操作流程。
1. 细胞培养和蛋白提取。
首先，需要培养细胞并收集细胞样本。
将细胞样本离心，去除培养基，然后用PBS洗涤细胞。
接下来，加入细胞裂解液并振荡离心，收集上清液，即为蛋白提取物。
2. 蛋白质浓度测定。
使用BCA或Bradford方法测定蛋白提取物的浓度，以确保后续实验中使用的蛋白质量一致。
3. SDS-PAGE凝胶电泳。
将蛋白提取物加入蛋白负载缓冲液，然后加入SDS-PAGE凝胶槽中。
进行电泳分离蛋白质，根据蛋白质大小和电荷不同，蛋白质会在凝胶中形成不同的条带。
4. 蛋白质转印。
将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质转移到膜上，通常使用半湿式或全湿式转印。
将蛋白质从凝胶转移到膜上，使得蛋白质可以与抗体结合。
5. 阻塞。
将膜放入含有蛋白质的溶液中，如5%脱脂奶粉或蛋白质阻塞缓冲液中，阻塞非特异性结合位点。
6. 一抗孵育。
加入第一抗体，孵育过夜。
第一抗体与目标蛋白结合，形成抗原-抗体复合物。
7. 洗涤。
用TBST或PBS洗膜，去除未结合的抗体。
8. 二抗孵育。
加入HRP标记的二抗，孵育1小时。
二抗与第一抗体结合，形成复合物。
9. 洗涤。
用TBST或PBS洗膜，去除未结合的二抗。
10. 显色。
加入ECL显色液，使得膜上的蛋白质产生发光反应。
将膜放入暗室中，用X光片曝光，然后用显影液显影。
11. 图像获取和分析。
将X光片放入X光片扫描仪中，获取蛋白质条带的图像。
使用图像分析软件，如ImageJ，分析蛋白质的相对表达水平。
以上就是WB实验的详细步骤，每一步都至关重要，需要严格按照操作规程进行。
希望本文能够帮助读者更好地理解WB实验的操作流程，并在实验中取得准确、可靠的结果。
--Western blot 详细步骤(中文版)
Western blot 步骤一、蛋白样品制备1.细胞样品：弃去培养基→预冷PBS洗涤3次→弃去PBS，加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，冰上轻摇裂解30min→将裂解液及细胞碎片移至离心管→4℃下12000rpm离心5min→取少量上清，BCA法测定蛋白浓度→其余上清加入蛋白上样缓冲液，煮沸变性，-80℃保存。
2.组织样品：直径5mm组织放入1.5ml EP管→加入RIPA和蛋白酶抑制剂→冰上剪碎→电动匀浆器间歇匀浆1min→间断超声破碎2min→4℃下12000rpm离心5min→取少量上清，BCA法测定蛋白浓度→其余上清加入蛋白上样缓冲液，煮沸变性，-80℃保存二、电泳、转膜1.组装制胶版，按目的蛋白分子量配制7ml对应浓度的分离胶液，摇匀后迅速灌胶至胶板2/3高度。
2.以ddH2O封闭胶液，室温下静置30分钟。
倾去覆盖水层，以滤纸小心吸去剩余的水。
3.配制5％积层胶3ml，迅速混匀，加到分离胶上至胶版上缘，小心插入梳子，室温下聚合时间1h。
4.将聚合好的两块胶安装至电泳槽中，倒入1×电泳缓冲液5.将取等质量蛋白样品及蛋白Ladder，每孔上样10-20μL。
6.接通电源，积层胶电压为60V。
7.待溴酚兰电泳至积层胶与分离胶分界处，将电压调为100V继续电泳，待溴酚兰电泳至底部时终止电泳，小心取胶，放置于转膜缓冲液中。
8.剪下同样大小的PVDF膜，甲醇浸泡30秒后转膜缓冲液轻漂洗。
9.组装“三明治”，以恒定电流350mA转膜2小时10.转膜完毕后，取出PDDF膜，蛋白面向上，5％脱脂奶粉室温下轻摇封闭2小时。
11.取出PVDF膜，吸去表面奶液后放入杂交袋，蛋白面向上，一抗TBS稀释后加入杂交袋，4℃孵育过夜。
12.取出PVDF膜，1×TBS摇床漂洗10分钟，漂洗3次后放入杂交袋。
13.二抗TBST稀释后加入杂交袋，室温孵育2小时。
14.以1×TBST洗膜三次，每次10分钟。
Westernblot实验操作详细步骤
Westernblot实验操作详细步骤1.样本制备：a.收集细胞或组织样本并加入提取缓冲液，破碎细胞或组织以释放蛋白质。
b.用超声波破碎机或搅拌器处理样本，使其彻底破碎。
c.避免加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂以防止蛋白质的降解。
2.蛋白质分离：a.将样本加入离心管中，并用高速离心分离细胞碎片和细胞核。
b.收集上清液，其中包含溶解的蛋白质。
3.蛋白质浓度测定：a. 使用BCA或Bradford等方法测定提取的蛋白质浓度。
b.根据需要调整蛋白质浓度，以确保每个样本使用相同的蛋白质量。
4.准备SDS-凝胶：a.准备解聚凝胶和浓缩凝胶以进行垂直电泳。
b.根据需要选择合适的胶百分比和凝胶组装器。
c.制备足够的凝胶和凝胶缓冲液。
5.蛋白质电泳：a.将蛋白质样本加入加载缓冲液，并在煮沸过程中使其变性。
b.将蛋白质样本加载至凝胶槽中。
c.根据需要在凝胶中加入预定分子量标记物，以便于蛋白质分子量的确定。
d.以恒定电流进行电泳，直到预定分子量标记物到达所需位置。
6.蛋白质转膜：a.选择合适的膜材料（例如聚偏氟乙烯或硝酸纤维素）。
b.用蛋白质转膜装置将凝胶上的蛋白质转移到膜上。
c.确保膜与凝胶完全贴合，并尽量避免气泡的产生。
7.阻塞和抗体孵育：a.将膜放入含有5%非脂奶粉或1%牛血清蛋白的TBST缓冲液中进行阻塞。
b.在蛋白质靶向抗体中稀释贮存液，并使用适当的稀释倍数进行孵育。
c.将膜和抗体一起放入摇床或孵育箱中，在适当的温度下进行孵育。
8.洗涤：a.用TBST缓冲液洗涤膜以去除未结合的抗体。
b.进行3至5次洗涤，每次洗涤持续5到10分钟。
9.二次抗体孵育：a.将膜放入稀释过的二抗溶液中进行孵育。
b.孵育时间和温度根据抗体种类和需求进行调整。
10.再洗涤：a.用TBST缓冲液进行大约3至5次洗涤。
b.确保彻底洗涤以去除未结合的二抗。
11.信号检测：a.使用化学发光或荧光探针对膜上的蛋白质进行检测。
b.按照探针供应商的说明进行操作。
WB实验步骤
Western blot 实验步骤及注意事项1.细胞蛋白提取1)25ml培养瓶弃干净培养基，可倒置于吸水纸或正立使液流至瓶底，用枪头吸净；再用预冷的PBS清洗3次，枪头吸净。
2)配制细胞裂解液RIPA:PMSF=100:1（PMSF使用浓度为1mM，由17.4mg PMSF粉末和1ml异丙醇配制），每培养瓶加200μl细胞裂解液。
于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动。
3)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5ml 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）4)于4℃下 12000rpm 离心 15min。
（提前开离心机预冷）5)将离心后的上清分装转移至0.5min 的离心管中放于－80℃保存。
6)蛋白变性：蛋白上清与5x SDS蛋白上样缓冲液按4:1混合（即每100μl蛋白中加25μl缓冲液），置于100℃水浴箱中水浴5min使之充分变性，置于－20℃保存。
2.制胶与上样1)清洗玻璃板：扣紧玻璃板用洗洁精轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水超纯水冲洗干净后立在筐里晾干。
a 测漏实验（那个玻璃板装好，再整体装在板子上）2)灌胶与上样：（从一侧加入胶液9混匀，匀速加入）①10% SDS--- SDS 10g+水100ml （将10g SDS加到90ml水中,加热溶解，然后定容至100ml，室温保存;常温放置若出现沉淀，可放37℃水浴箱中温浴）②10%过硫酸铵（AP）---过硫酸铵 0.1g+超纯水10ml (溶解后，4℃保存，保存时间为1w)③根据分离胶及浓缩胶表的浓度制胶，分离胶灌胶后用无水乙醇或水压胶，灌浓缩胶后马上放梳子。
（胶一定要平，不留气泡）④配制电泳液：1L纯水+3.03g Tris+18.77 Glycine+1g SDS，溶解后室温保存。
⑤将玻璃板放入电泳槽中（小玻璃板向内，大玻璃板向外）。
加入足够电泳液，最少没过小玻璃板，两手捏住梳子两边轻轻拔出。
western blot实验步骤
蛋白质的提取（整个过程冰上进行）一．组织膜蛋白裂解液bufferA+1%蛋白酶抑制剂蛋白保存液40%SDS+60%RIPA+1%蛋白酶抑制剂1.-80°C冰箱中取出组织放入研磨管中（研磨管和配套的研磨棒事先用去离子水冲洗，用纸吸干水)按600-700μl/100mg组织加裂解液研磨（研磨后研磨管和研磨棒用去离子水冲洗，用纸吸干水）2.用1000枪转入1.5ml离心管中4°C离心，1500转15min3.用1000枪将上清转入差速离心专用离心管中（离心管事先用去离子水冲洗）用裂解液配平4.差速离心33000-35000转（45000g）30min5.弃上清，沉淀加入150μl左右蛋白保存液（根据沉淀的量调整）用枪来回吹打使沉淀溶解，枪头在液面下，尽量不要出沫6.将上述液体分装到0.5ml离心管中，每管20-25μl，留一管-20°C保存测浓度，其余放入-80°C保存二．组织总蛋白裂解液40%SDS+60%RIPA+1%蛋白酶抑制剂1.-80°C冰箱中取出组织放入研磨管中（研磨管和配套的研磨棒事先要用去离子水冲洗，用干净的纸擦干)按600-700μl/100mg组织加裂解液研磨（研磨后研磨管和研磨棒用去离子水冲洗，用纸吸干水）2.用1000枪转入1.5ml离心管中4°C离心，13500转30min3.取上清分装到0.5ml离心管中，每管20-25μl，留一管-20°C保存测浓度，其余放入-80°C保存三．细胞总蛋白裂解液RIPA+1%蛋白酶抑制剂1.将培养瓶中培养液倒掉，加入PBS冲洗5-6遍，倒掉PBS，用枪吸出倒不尽的PBS2.每瓶加100-150μl裂解液，用细胞刮刀尽量将细胞刮下来（刮刀用前去离子水冲洗，用纸吸干水，用完一样处理）用200枪转入1.5ml离心管中3.超声破碎细胞，频率80-100间，超声探头（用前用纸擦，用后用纸擦并盖上盖）插入液面下，超声3-5s停3-5s，总共20s左右，停止5min左右4.重复上步4-6次5.4°C离心13500转15min6.取上清分装到0.5ml离心管中，每管40μl，留一管-20°C保存测浓度，其余放入-80°C保存。
培养细胞的流程
培养细胞的流程
细胞培养是生物学实验中非常重要的一项技术，它可以用于细胞生物学研究、药物筛选、疾病模型建立等多个领域。
下面将介绍一般细胞培养的流程。
首先，准备工作。
在进行细胞培养前，需要准备培养皿、培养基、细胞传代所需的胰酶等材料。
同时需要消毒工作台和培养箱，确保实验环境的无菌。
接着，解冻细胞。
如果是从冷冻状态中取出细胞进行培养，首先需要将冻存管放入37摄氏度的水浴中迅速解冻，解冻后将细胞转移到预先加热的培养基中。
然后，传代细胞。
当细胞生长到一定密度时，需要进行传代操作，以保证细胞的健康生长。
传代操作需要用到胰酶等酶类物质，可以将细胞从培养皿中剥离出来，然后转移到新的培养皿中。
接下来，细胞培养。
将细胞悬浮在培养基中，放入培养箱中进行培养。
培养箱中需要保持适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度，以提供良好的生长环境。
最后，细胞观察和实验。
在细胞培养的过程中，需要定期观察细胞的形态和生长状态，确保细胞的健康生长。
同时可以进行相关的实验，如药物处理、基因转染等。
综上所述，细胞培养是一个复杂而又重要的实验技术，需要严格控制实验条件，确保细胞的健康生长。
通过以上流程，可以有效地进行细胞培养，并为后续的实验提供可靠的细胞基础。
Western Blot操作步骤
一、细胞蛋白的抽提6孔细胞培养板中细胞培养液弃去，加入80ul 1×loading buffer，置冰上用刮刀刮匀，吸入EP管煮沸5min。
冷却后12000rpm低温离心5min，上清分装冻存（27ul/支）。
二、Western blot 试剂配方（一）母液1、1 mol/L Tris.HCl pH HCl mlTris 30.29g 7.4 17水200ml * 7.5 16 浓盐酸调pH，完后加H2O定容至250ml. 7.6 158.0 102、10% SDSSDS 10g水100ml 50℃水浴溶解3、10% 过硫酸胺（AP）过硫酸胺0.1g水 1.0ml 4.℃保存,1周内使用.4、1.5mol/L Tris.HCl（pH 8.8）Tris 45.43g水200ml浓盐酸调pH.至8.8，完后加H2O定容至250ml.5、1.0mol/L Tris.HCl（pH 6.8）Tris 30.29g水200ml浓盐酸调pH.至6.8，完后加H2O定容至250ml.6、30%聚丙烯酰胺丙烯酰胺14.55g甲叉双丙烯酰胺0.45g水20ml搅拌后加水到50ml 、棕色瓶４℃保存（１个月／更久）7、20%Tween 20Tween 20 20ml加水至100ml，４℃保存.8、TEMED 直接取用9、G250 考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用）考马斯亮蓝G250 100mg95%乙醇50ml磷酸100ml加水至1000ml注：乙醇先溶解，再加磷酸、水，混匀后过滤，４℃保存。
（二）胶的配制（现配）10% 12%（常用）分离胶（μl）5% 浓缩胶（μl）水4000 3300 270030%丙烯烯酰胺3300 4000 6701.5M Tris.HCl（pH 8.8）2500 1M Tris.HCl（pH 6.8）50010% SDS 100 4010% AP（最后加）100 40TEMED（最后加） 4 4步骤：1、分离胶灌胶至离梳子下缘1cm左右，上覆水100~200μl，30~60min聚合；2、用滤纸吸去水，配浓缩胶，灌入，插入梳子，注意赶净气泡，约30min聚合；3、放入电泳液中，拔去梳子。
干货I细胞复苏、冻存、传代之实验操作及注意事项
干货I细胞复苏、冻存、传代之实验操作及注意事项细胞培养之实验操作及注意事项｜细胞复苏/冻存/传代一、细胞培养前期准备工作细胞培养仪器设备：●细胞培养通风橱（即生物安全柜）●培养箱（通用推荐：湿式二氧化碳培养箱）●离心机●医用冰箱（4℃）和冰柜（-20℃）、生物超低温冰箱（-80℃）、液氮冷冻罐●倒置显微镜其他用品：细胞培养容器（培养瓶、培养皿、多孔板等），吸管和移液器，培养基、血清和试剂注意事项:●无菌工作区域：细胞培养实验室的主要要求是需要维持细胞培养操作工作区域处于无菌状态，最简单经济的方式就是使用细胞培养通风橱。
●无菌试剂和培养基：商品化试剂和培养基经过严格的质量控制以确保无菌，注意操作过程中不要被污染，其他试剂和溶液需要选择适当的灭菌方法（例如：高压蒸汽、无菌过滤等）进行灭菌。
●无菌操作：要求操作人员在实验开始前对工作区域和双手操作部分进行75%酒精消毒；尽量使用一次性塑料吸管进行单次操作，避免交叉污染；试剂瓶和培养用具使用时方可开盖，用后要第一时间盖上，暴露于环境中的时间尽可能要短。
●整体的细胞实验环境也弥足重要，需要定期对实验室环境进行较为彻底的清扫消毒和杀菌，包括实验用仪器和室内地面、桌面等。
二、细胞的复苏与冻存细胞复苏：在细胞状态不足以满足实验需求或者出现细胞污染的情况下，需要进行细胞复苏：a)从超低温冰箱或者液氮中取出自保存或商品化购买的冻存细胞后，快速转移至37℃水浴条件下轻轻转动融化（一分钟内）。
b)75%酒精擦拭冻存管外部后，转移至通风橱中。
c)加入适量新鲜的完全培养基混合，约800-1000rpm下离心5-10分钟，实际离心速度时间取决于细胞种类和细胞状态。
d)新鲜培养基重悬后接种于相应的培养器皿中，做好标记，37℃，5%CO2条件下培养。
细胞冻存：为现有细胞系做细胞储备，需要对代数相对靠前的细胞进行扩增培养和细胞冻存：a)准备细胞冻存液，置于2℃-8℃下备用。
b)观察待冻存的细胞，密度达到80%-90%左右，将贴壁/悬浮细胞分别按照传代方法收集。
细胞培养传代及冻存操作规程
细胞培养、传代及冻存操作规程一、细胞的复苏1、实验器材及试剂保温杯、温度计、镊子、温水（39℃）、培养板(根据需要选择相应孔数的培养板如6孔板，12孔板，24孔板等)、培养基DMEM+10%血清、双抗、1.5ml 离心管。
2、操作步骤①取相应体积的培养基放入到培养板中并加入双抗，放入CO2培养箱中预热，然后取适量的冷水加入到保温杯中，把温度计置于保温杯中，边加开水边用温度计搅拌，时刻关注温度计的度数直到温度升至39℃为止（为防止在移动过程中温度降低可把温度调高1——2℃。
②用镊子将所需要的细胞从液氮中取出，迅速放入提前准备好的温水中并不停的搅拌使其迅速解冻，细胞解冻好之后用移液枪把冻存管中的细胞连同冻存液一起吸出放到1.5ml离心管中，5000rpm/min 离心2min，尽量的除掉上清，然后在加入500μl培养基反复吹打待混合均匀后放入到事先准备好的培养板中并注明名称、日期及操作人。
二、细胞的传代培养1、操作步骤①准备好培养板加入相应体积的培养基之后放入培养箱中预热，添加培养基的方法如下表②将长满的细胞取出，吸除培养基，用DPBS清洗两遍，在加入相应体积的0.25％胰蛋白酶，使板底细胞都浸入溶液中，然后将培养板置于培养箱中 6 分钟后取出，在显微镜下观察消化情况。
添加胰蛋白酶的体积如下表所示③消化时间完成后应立即终止消化，一是直接加入培养基，二是吸除胰蛋白酶之后在加培养基，加入培养基以后反复吹打在此期间通过显微镜观察培养板中的细胞是否成为单细胞悬液，如果为单细胞悬液则停止吹打，将此单细胞悬液平均分配到已经预热好的培养板中，摇动混匀后放入培养箱24小时后换液。
2、注意事项在细胞传代培养中要时刻注意细胞的生长状态，以便于下一步实验的顺利进行。
其中有两点很重要，第一消化的时间，消化的时间并不是一成不变的，要根据细胞的状态随时终止消化，上面②中所诉的6分钟只是较为理想的时间；第二吹打的力度跟全面性，吹打的力度一定要适中，不能太用力避免将细胞打碎，另外每个培养板都是有边角的，那里会有很多细胞残留，需要提醒的是一定要在显微镜下观察细胞是否全部离开培养板底，如有残留可用枪头将其刮下在吹打。
细胞培养—传代—冻存—western blot等实验相关步骤
围绕siRNAs的相关实验详细步骤及总结实验一: 细胞传代培养材料: 15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、培养瓶、含10%FBS 的RPMI—1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、PBS、trypsin等1、步骤: （以下均在超净台内, 酒精灯旁操作）（SKOV-3）2、打开超净台, 将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；含10%FBS的RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。
取一个生长良好的细胞培养瓶（密度适中, 细胞成梭形连接, 贴壁良好）, 弃旧培养基, PBS 2ml 清洗2次（切勿用力吹打）。
用移液枪取trypsin 1ml沿细胞生长壁对侧壁注入, 然后放平培养瓶, 使贴壁细胞与trypsin充分接触, 置于CO2培养箱2min左右（时间不能太长, 以免损伤细胞）。
4.往培养瓶中加入1640 1~2ml, 随后用移液枪将悬液移到15ml离心管中, 离心1000 r/min, 5min。
5.弃上清液, 加入少量10%FBS的1640培养基使成细胞悬液。
6、分装, 按1:2~3传代, 每瓶4~5ml。
倒置显微镜下观察（细胞突起消失变圆形, 细胞间隙等距）, 标记。
7、放入CO2培养箱中培养, 第二天观察生长状况。
总结: 1.在用离心机时, 看清楚是RCF还是RPM；调节Temp.以及Time。
2.在用移液枪吸出trypsin充分消化后的细胞后, 须知用少量培养液清洗一下培养瓶, 并将清洗液移入离心管中。
3、每取用一个容器, 拧开或者拧上盖子时, 注意在酒精灯上旋转一圈。
另外, 记住用酒精棉球经常擦拭台面。
4、在用移液枪或者吸管混匀细胞悬液过程中, 动作轻柔, 避免产生气泡等。
实验二: 细胞冻存材料: 15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、冻存管、RPMI —1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、FBS、PBS、trypsin、DMSO等步骤: （以下均在超净台内, 酒精灯旁操作）（OVCAR-3）1.打开超净台, 将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；FBS、RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。
Western Blot 步骤
Western Blot 步骤：1、样品处理（细胞样品的处理）：1）培养细胞或药物处理2）弃上清，1*PBS漂洗细胞2遍，去尽残留培养基3）加入1*SDS电泳缓冲液，刮落细胞，转移到EP管中（注意冰上操作）4）4摄氏度下搅拌30分钟5）4摄氏度离心，转速和时间根据细胞不同进行改变，一般是12000转/分，20min。
6）离心管取出，置于冰上，吸取上清，其余丢弃。
7）测定蛋白浓度（BSA、BCA、Lowry、Bradford法），-20摄氏度或-70摄氏度冻存备用。
8）加入Loading Buffer， 95~100摄氏度煮沸5min，若测多种蛋白时，70摄氏度加热5~10分钟更为合适。
2、配胶：将两块玻璃清洗干净，先用洗洁精，再用70%乙醇，最后用ddH20，有Bio-Bad字样朝上，完成后加入H2O，约10分钟，确认无漏水后倒出H20，残留的用滤纸吸干（不要伸到里面去，倾斜后在边缘吸）。
3、根据分子量大小配分离胶:在干净的15mL离心管内配制（过硫酸铵APS最后加入，且需分装），混匀，用1mL枪加至绿线下方1~2mm处，注意不要将液体全打出来，防止气泡产生，从一边到另一边缓缓加入无水乙醇，ddH20溢出后，室温放置25~30分钟，可看到分离胶与ddH20之间有一条清晰的分界线，倒出上层的乙醇，并用ddH2O洗涤两遍，用滤纸吸去残留的水。
（Tris pH：8.8，配制10mL的量）4、配制浓缩胶：APS最后加入，快速加至液体溢出，将清洗干净的梳子水平插入，擦干外面，静置60分钟后应用于下一步试验；或4摄氏度冰箱过夜。
（Tris pH：6.8，一般配制4mL的量）分离胶与浓缩胶的pH一定要调准，否则严重影响实验结果。
APS1周内使用。
5、加样：将配制好胶的玻璃板轻轻取出，不可分离，放入电泳仪，矮面朝内，放平加紧，倒入1*电泳缓冲液，最好内外液面基本持平，或外液面稍矮，放置检查有无漏电泳液，电泳液配制约1000mL，如果电泳仪有漏液情况，则配制1200mL，使内外液面基本持平。
Westernblot基本操作步骤
W e s t e r n b l o t基本操作步骤IMB standardization office【IMB 5AB- IMBK 08- IMB 2C】W e s t e r n b l o t基本操作步骤一、细胞蛋白的提取弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mMPMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10min。
取上清，用BCA法测定蛋白浓度。
用于westernblot的蛋白样品取一定量加4×loadingbuffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。
离心，使蛋白沉底。
将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。
二、BCA法测蛋白浓度操作步骤将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl分装，-20℃冷冻保存。
完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为ml。
据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA 工作液，充分混匀。
BCA工作液室温24小时内稳定。
将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。
加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS到20μl。
各孔加入100μlBCA工作液，37℃放置30分钟。
测定580nm条件下吸光度。
根据标准曲线计算出蛋白浓度。
三、Westernblot基本操作步骤1、溶液配制：①RunnigBuffer(1×)：SDSRunnigBuffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L；②TransferBuffer(1×):TransferBuffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ 水至1L；③TBST缓冲液1MTris·HCl（）：60.5gTris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至，加MiliQ水至500ml。
western blot操作流程
Western blot 操作流程1、取一生长状态良好的培养皿（10cm），胰酶消化传代，以1：4传代2、培养24后换液（或第二天更换培养液）3、观察细胞的生长状态，取在对数生长期细胞，占满70%-80%皿4、用PBS洗涤一次后，更换新培养液5、加入BBR预处理半小时后，加入H2O2致凋亡处理6、共培养4小时后，用不含EDTA的胰酶消化收集细胞7、PBS洗涤细胞2次（1200rpm，5-8min）附：BBR计算公式：500μM/L*XμL=10μM/L*10000μL X=200μLH2O2计算公式：200μM/L *10000μL=ρV/34*10 moL ρ=1.11g/mlV=68000/ρ*10-3（μL）V’=68/ρ（μL）=61.3（μL）BBR上调哪些信号通路蛋白磷酸化（AKt/p-AKt、ERK/p-ERK、p38/p-p38、JNK/p-JNK）1、选取对照组、1uM BBR、5uM BBR、10uM BBR、20uM BBR2、制作6孔板培养细胞24~48小时3、更换培养液后四小时，加入BBR共培养1小时4、准备：碎冰、蛋白提取试剂盒、PBS、1.5ml EP管5~8只、1ml EP 管5~8只。
5、配置蛋白裂解液，每1ml+1uL+10uLPMSF+5uL配置，预冷离心机4度6、在超净台操作，弃培养液，PBS洗涤三次7、将培养皿置于冰上，每十分钟震荡一下，共计30分钟8、用1ml的枪头吹打细胞呈悬液，收集至1.5ml EP管9、置于预冷的离心机，离心：12000~14000转，5min10、吸取上清液至1ml EP管，-80度保存BBR上调哪些信号通路蛋白磷酸化（caspase-3、Bcl、Bax、β-actin）1、选取对照组、模型组、1uMBBR、5uM BBR、10uM BBR、20uM BBR2、制作6孔板培养细胞24~48小时3、更换培养液后四小时，加入BBR共培养1小时4、准备：碎冰、蛋白提取试剂盒、PBS、1.5ml EP管5~8只、1ml EP 管5~8只。
本实验室Western blotting 实验步骤
Western blotting 实验步骤第一步：蛋白质的提取取冻存或新鲜组织黄豆大小200μl 细胞裂解液（用时加DTT1：100，PMAF 1：100）用玻璃匀浆器捣碎，匀浆---200μl 涮管（注意：组织一定要碎到几乎所有的细胞都破裂）转移至冻存管中液氮反复冻溶裂解细胞：液氮冷冻---RT自来水冲洗解冻3-5次转移至离心管中，4℃高速离心12000转/分钟80min（60min+30min）离两次，每次30min取上清液，分装，-20℃保存备用如果定量检测蛋白质，做Bradford检测；如果只是定性，此步可省！《精编分子生物学实验指南》P332第二步：跑胶将制胶装置洗净装好,配分离胶（随所测蛋白的分子量而变化）注意：最后加聚合剂TEMED时一定要边加边摇动配液烧杯，否则会发生局部聚合而使配胶失败用枪将胶沿边缘小心，快速注如板中，体积[3.2 ml]蒸馏水水封(加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。
）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。
再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
用枪头和滤纸吸净蒸馏水配浓缩胶（与所测蛋白分子量无关）1ml注胶，插梳子RT，静置30min自来水冲掉多余的胶装电泳内槽，加电泳Buffer，拔梳子50μgSample蛋白+Sample Buffer（6x;微波煮沸3min，冷却加样，10-15ul，具体加多少看跑的条带清晰度而定注意：1.样品中如果有非蛋白成分会影响电泳效果，应除去。
例如：乙醚可抽提掉脂肪成分。
2.空跑泳道会影响其邻近泳道的效果，所以所有泳道都应加样插电极，开电源，调电压（160V）当溴酚兰跑到离底端2CM 左右，关电源取胶，切胶，做标记，考马斯亮蓝染色，看跑的带如何，也可不染快速染色法：加考马斯亮蓝后于微波炉中加热几十秒，不能沸腾将绵纸，吸水纸用转膜Buffer 浸泡，PVDF膜甲醇10S，三蒸水洗2-3min，在转膜Buffer中平衡30min装胶，装PVDF膜，100V电压,100min注意：因为蛋白带负电荷，所以胶与PVDF膜的叠放顺序应正确！依次为:夹板黑面,海绵,吸水纸,胶,膜, 吸水纸, 海绵, 夹板白面.取膜，丽春红染色看是否转膜彻底，然后洗脱，也可不染注意：操作过程中，PVDF膜蛋白面始终朝上．．．．．．．3-5% BSA+0.01%TWEEN PBS 封闭液，RT 3h加一抗，4℃冰箱，摇动孵育过夜，RT 2-3hPBS洗ALP-GAR二抗 1：25000，RT 2-3 小时PBS洗显色溶液配置1.分离胶：2.浓缩胶：3.细胞裂解液：Tris 30mMEDTA 1mM (先溶)Malybdate 10mM调PH 7.4Glycerol 10% v/v用时再加：dTT 1mM -20℃保存PSMF 1mM -20℃保存4. 电泳Buffer：E-running buffer2.27g Tris + 14.07g Glycine + 7.5ml 10% SDS + dd-Water=750ml 5. Loading sample Buffer：2XTris-HCl 1.0 mol/L PH6.8 1mlGlycerol 1ml10%SDS 2ml10% 溴酚兰 5ulβ-巯基乙醇 0.5ml蒸馏水 0.5ml6. 考马斯亮蓝染液：200ml Methanol + 160ml dd-water + 40ml acetic acid + 1g R-250 7. 转膜Buffer：Transfer buffer3.03g Tris + 14.4g Glycine + 200ml Methanol + dd-Water=1000ml 8. 丽春红染液：Poneaus 0.5g 溶于 1% 的乙酸/蒸馏水溶液中。
细胞传代冻存复苏步骤
准备工作：1、进入细胞室前，首先用75%酒精擦试工作台,接着紫外灭菌30—50min，过后，关闭紫外灯，通风10min。
2、从冰箱中取出胰酶、PBS缓冲液、培养基注意事项:1、所有实验用的器械，仪器灭菌，消毒,烘干.2、打开溶剂，培养瓶瓶盖时，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下。
3、用完溶剂，培养瓶时，瓶口及瓶盖也要在酒精灯上烤一下。
开始工作：1、实验前换衣帽,开风淋，吹风。
2、75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下台面，点燃酒精灯。
3、取待用的细胞，旋紧瓶盖。
4、弃去旧的培养液，把培养瓶放回原处。
5、取移液管一支,塞棉花端，及管身,均在酒精灯上烤一下，套好吸球。
6、用移液管加入适量的PBS缓冲液，缓慢荡洗一下细胞，然后将PBS 缓冲液弃掉。
7、用移液管（微量枪）吸取适量胰酶约2ml（所用胰酶的量），弃掉枪头。
8、将细胞置于5％CO2、37度培养箱中1min-2min，目的：提高酶活性,促进消化。
9、取待用细胞,取移液管一支，塞棉花端，及管身，均在酒精灯上烤一下，套好吸球。
10、用移液管加入适量的完全培养液冲洗（吹散细胞）细胞,将瓶底粘着的细胞吹散下来，再将细胞悬液移入的离心管中,封口，标签.11、离心5min，1000转/min。
以下分别介绍:一换液1、取待用的细胞，旋紧瓶盖。
2、弃去旧的培养液，把培养瓶放回原处。
3、取移液管一支，塞棉花端,及管身，均在酒精灯上烤一下，套好吸球.4、用移液管加入适量的PBS缓冲液,缓慢荡洗一下细胞，然后将PBS 缓冲液弃掉。
5、取移液管一支,塞棉花端，及管身，均在酒精灯上烤一下,套好吸球。
6、用移液管加入适量的细胞培养液于培养瓶中。
7、将细胞置于5％CO2、37度培养箱培养。
二传代1、细胞离心毕，拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液，吸取已配制的培养基适量,加入离心管中，将细胞重悬、吹匀.2、取4-6滴细胞悬液到新的培养瓶中,培养瓶中应先加好适量细胞培养液，吹散细胞,镜下观察，细胞密度适宜则置入5％CO2、37度细胞培养箱中。
细胞培养实验步骤
细胞培养实验步骤细胞培养是一种常用的实验技术，用于研究和培养人类及动物细胞以及微生物细胞，以便进行细胞生物学、免疫学、生物药剂学等领域的研究。
下面是细胞培养的一般步骤，供参考：1.预备培养物品：包括培养基、生长因子、惰性气体（例如二氧化碳、乙烷等）等。
2.消毒操作：将培养器皿、培养板、培养液等较小的物品放入70%乙醇中浸泡，或用高温高压灭菌。
3.培养基配制：根据需要的培养细胞类型选择相应的基础培养基（例如DMEM、RPMI-1640等），根据实验要求添加适当的补充物质（如胎牛血清、抗生素等），调节pH值。
4.细胞分离和传代：a）将需要培养的细胞从体内或体外取出；b）用消化酶（如胰蛋白酶）或化学脱附剂（如牛血清白蛋白）处理细胞；c）通过离心等操作，去除胶原颗粒、纤维素等杂质；d）将细胞悬浮于培养基中，数量适量；e）将细胞装入培养皿中，加入适量的培养基。
5.细胞观察：使用显微镜观察细胞的生长状态、数量、形态特征等。
6.细胞培养环境控制：a）保持恒定的温度：多数细胞培养在37℃下进行；b）提供合适的湿度：使用培养器内的水槽或加入水来增加湿度；c）提供适度的无菌环境：在洁净工作台或无菌箱内进行，注意操作无菌技术，避免细菌等污染细胞。
7.细胞培养的传代：细胞的生长速度快，细胞排列紧密，细胞密度太高会使细胞分泌代谢产物过多，阻碍细胞增殖，因此需要定期传代。
传代前要先将细胞分散（用胰蛋白酶或牛胰酶等处理），将培养皿中的细胞悬液分装到新的培养皿内。
8.细胞培养的净化：细胞培养过程中，细胞环境容易被菌落污染，因此需要进行细胞净化。
方法有：检测培养液的菌落数目，观察培养皿内是否有细菌、真菌等的生长，如发现污染现象，立即停止使用被污染的培养皿和培养液。
9.细胞培养的冻存：细胞培养过程中，保留一部分细胞进行冻存，以备后续的实验使用。
常用方法是将细胞悬液和DMSO混合后，存放在液氮中保存。
以上是细胞培养的一般步骤。
但不同类型的细胞具有不同的培养要求，实验者还需根据实际情况进行具体调整和处理。
WB实验步骤
WB实验步骤Western blot 实验步骤及注意事项1.细胞蛋白提取1)25ml培养瓶弃干净培养基，可倒置于吸水纸或正立使液流至瓶底，用枪头吸净；再用预冷的PBS清洗3次，枪头吸净。
2)配制细胞裂解液RIPA:PMSF=100:1（PMSF使用浓度为1mM，由17.4mg PMSF粉末和1ml异丙醇配制），每培养瓶加200μl细胞裂解液。
于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动。
3)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5ml 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）4)于4℃下 12000rpm 离心 15min。
（提前开离心机预冷）5)将离心后的上清分装转移至0.5min 的离心管中放于－80℃保存。
6)蛋白变性：蛋白上清与5x SDS蛋白上样缓冲液按4:1混合（即每100μl蛋白中加25μl缓冲液），置于100℃水浴箱中水浴5min使之充分变性，置于－20℃保存。
2.制胶与上样1)清洗玻璃板：扣紧玻璃板用洗洁精轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水超纯水冲洗干净后立在筐里晾干。
a 测漏实验（那个玻璃板装好，再整体装在板子上）2)灌胶与上样：（从一侧加入胶液9混匀，匀速加入）①10% SDS--- SDS 10g+水100ml （将10g SDS加到90ml水中,加热溶解，然后定容至100ml，室温保存;常温放置若出现沉淀，可放37℃水浴箱中温浴）②10%过硫酸铵（AP）---过硫酸铵 0.1g+超纯水10ml (溶解后，4℃保存，保存时间为1w)③根据分离胶及浓缩胶表的浓度制胶，分离胶灌胶后用无水乙醇或水压胶，灌浓缩胶后马上放梳子。
（胶一定要平，不留气泡）④配制电泳液：1L纯水+3.03g Tris+18.77 Glycine+1g SDS，溶解后室温保存。
⑤将玻璃板放入电泳槽中（小玻璃板向内，大玻璃板向外）。
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围绕siRNAs的相关实验详细步骤及总结实验一：细胞传代培养材料：15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、培养瓶、含10%FBS 的RPMI—1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、PBS、trypsin等步骤：（以下均在超净台内，酒精灯旁操作）（SKOV-3）1、打开超净台，将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；含10%FBS的RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。
2、取一个生长良好的细胞培养瓶（密度适中，细胞成梭形连接，贴壁良好），弃旧培养基，PBS 2ml 清洗2次（切勿用力吹打）。
3、用移液枪取trypsin 1ml沿细胞生长壁对侧壁注入，然后放平培养瓶，使贴壁细胞与trypsin充分接触，置于CO2培养箱2min左右（时间不能太长，以免损伤细胞）。
4、往培养瓶中加入1640 1~2ml，随后用移液枪将悬液移到15ml离心管中，离心1000 r/min，5min。
5、弃上清液，加入少量10%FBS的1640培养基使成细胞悬液。
6、分装，按1:2~3传代，每瓶4~5ml。
倒置显微镜下观察（细胞突起消失变圆形，细胞间隙等距），标记。
7、放入CO2培养箱中培养，第二天观察生长状况。
总结：1、在用离心机时，看清楚是RCF还是RPM；调节Temp.以及Time。
2、在用移液枪吸出trypsin充分消化后的细胞后，须知用少量培养液清洗一下培养瓶，并将清洗液移入离心管中。
3、每取用一个容器，拧开或者拧上盖子时，注意在酒精灯上旋转一圈。
另外，记住用酒精棉球经常擦拭台面。
4、在用移液枪或者吸管混匀细胞悬液过程中，动作轻柔，避免产生气泡等。
实验二：细胞冻存材料：15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、冻存管、RPMI —1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、FBS、PBS、trypsin、DMSO等步骤：（以下均在超净台内，酒精灯旁操作）（OVCAR-3）1、打开超净台，将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；FBS、RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。
2、取一个生长良好的细胞培养瓶（密度适中，细胞成梭形连接，贴壁良好，汇合度达到95%左右），弃旧培养基，PBS 2ml 清洗2次。
3、用移液枪取trypsin 1ml沿细胞生长壁对侧壁注入，然后放平培养瓶，使贴壁细胞与trypsin充分接触，置于CO2培养箱2~3min。
4、往培养瓶中加入1640 1~2ml，随后用移液枪将悬液移到15ml离心管中，离心1000 r/min，5min。
5、取冻存管一个，往里面分别加入100ul DMSO（须避光保存）、200ulFBS、700ul 1640，用移液枪轻轻吹打混匀。
标记好细胞类型，时间等。
6、弃上清液，加入冻存液使成细胞悬液。
7、细胞悬液加入冻存管后，放在降温盒中，置于-80°C冰箱过夜，第二天再放入液氮罐中保存。
总结：1、常用细胞保护剂有甘油和二甲基亚砜（DMSO），可使冰点降低，在缓慢解冻过程中，能够使细胞内水分在冻结前透出细胞外。
2、细胞冻存和复苏应遵循缓慢降温、快速复苏的原则。
细胞冻存中DMSO 浓度一般为5%—15%，常用10%。
冻存液中血清可促进细胞复苏后的存活率。
2、细胞置于-80°C可保存半年左右，液氮长期保存。
3、冻存细胞从-80°C低温冰箱中转移到液氮罐中，这个操作应该在2min 内完成。
（冻存管会以10°C/min的速度升温，若温度上升超过-50°C，细胞会迅速恶化）实验三：细胞复苏材料：15ml离心管、枪（头1ml）、无菌吸管、培养瓶、RPMI—1640(OVCAR-3)、FBS、PBS等步骤：（以下均在超净台内，酒精灯旁操作）（OVCAR-3）1、打开超净台，将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；FBS、RPMI—1640放在37°C水浴恒温箱中预热。
2、快速（2min内）从低温冰箱中取出OVCAR-3细胞置于37°C水浴箱内解冻。
3、往培养瓶中加入1640 10ml，随后用移液枪将悬液移到15ml离心管中，离心1000 r/min，5min。
4、弃上清液，加入新的培养基，用移液枪轻轻吹打混匀成悬液。
5、按照1:2分装到培养瓶中，做好标记。
6、置于CO2培养箱中培养观察。
总结：1、细胞在-5°C—0°C最易受损，故复苏时应快速置于37°C水浴箱中（尽量2min内完成）。
2、由于DMSO突然稀释会给细胞造成严重的渗透性伤害，稀释细胞存活率降低，复苏后应该缓慢稀释细胞悬液，3、冻存细胞从-80°C低温冰箱中转移到液氮罐中，这个操作应该在2min内完成。
（冻存管会以10°C/min的速度升温，若温度上升超过-50°C，细胞会迅速恶化。
）4、倘若细胞冻存状态不是很好，可用含血清培养基稀释DMSO至终浓度为1%，或者低速离心800rpm左右。
实验四：细胞铺板及siRNA转染材料：15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、EP管、6孔板、siRNA、10%FBS的RPMI—1640(SKOV-3)、M5A(OVCAR-3)、PBS、trypsin、SiRNA转染试剂等步骤：（以下均在超净台内，酒精灯旁操作）（本实验采用OVCAR—3，V Roche ：M siRNA=5:1，培养基V=1ml）1、打开超净台，将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；1640、trypsin、FBS放在37°C水浴恒温箱中预热。
2、取一个生长良好的OVCAR—3细胞培养瓶（密度适中，细胞成梭形连接，贴壁良好），弃旧培养基，PBS 2ml 清洗2次。
3、用移液枪取trypsin 1ml沿细胞生长壁对侧壁注入，然后放平培养瓶，使贴壁细胞与trypsin充分接触，置于CO2培养箱2~3min。
（细胞突起消失，渐变圆形，细胞间隙增大停止消化）4、加入1640 1ml配成悬液，随后用移液枪将悬液移到15ml离心管中，离心1000r/min，5min。
5、弃上清液，加入1640混成1ml悬液；细胞计数。
6、取6孔板分别标记为CTL、NC、S2，孔板先加培养基1ml/孔，然后细胞100ul/孔。
倒置显微镜下观察（细胞突起消失变圆形，细胞间隙等距），标记日期，姓名，细胞种类等。
7、取6个无酶EP管，分别标记为CTL、CTL1、NC、NC1、S2、S2a。
CTL管、NC管、S2管分别加入无血清的Opti-MEMI培养基100ul，然后用移液枪往三管中各加入10ul的SiRNA转染试剂（Roche）；CTL1管、NC1管、S2a管分别加入无血清Opti-MEM I培养基100ul，然后NC1管、S2a管依次加入7.58ul 的NC、7.58ul SiRNA（S2）。
最后，CTL1移入CTL、NC1移入NC、S2a移入S2，用移液枪吹打混匀。
7、按CTL组每孔105ul CTL管液；NC组每孔108.79ul NC管液、S2组每孔108.79ul S2管液，依次加入。
8、充分混匀后，放入CO2培养箱中培养48h，western blotting用。
实验五：western印迹法材料：EP管、15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、高速离心机、分光光度仪、—20°C低温冰箱、摇床、垂直板电泳转移装置、96孔板、PBS（0.01mol/L PH7.3）、细胞裂解液（RIPA+PMSF+磷酸酶抑制剂）、碧云天SDS-PAGE试剂盒、甲醇、PVDF膜、4xSDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转膜缓冲液、丽春红染液、考马斯亮蓝溶液、脱脂奶粉、TBST、抗体、显影液等液体配制：1×电泳缓冲液：Tris 3.03g + 甘氨酸14.4g + SDS 1g 加蒸馏水至1L（溶解后常温保存，可重复使用3—5次）10×电泳缓冲液：Tris 30.3g + 甘氨酸144g 加ddH2O，定容至1000ml（此储存液可长期常温保存。
配置时，可先加入700ml去离子水，待全部溶解后，加水至1000ml）转膜缓冲液：Tris 5.8g + 甘氨酸2.9g + SDS 0.37g + 甲醇200ml 加蒸馏水1L（溶解后常温保存，可重复使用3—5次）封闭液（5%）：脱脂奶粉5g +TBST 100ml（溶解后4°C保存）TBST ：20x TBS 25ml+ 蒸馏水475ml+ Tween-20 500ul（0.05‰~1‰）细胞蛋白提取步骤：1、准备材料，配备好细胞裂解液（RIPA : PMSF : 磷酸酶抑制剂=100:1:1），置于4°C冰上待用。
2、将六孔板的培养基去掉，用预冷的PBS 1ml/孔，洗2次。
3、加入预冷的细胞裂解液，70ul/孔；置于冰上30min，裂解过程中经常弹一弹使细胞充分裂解。
EP管标记为CTL、NC、S2。
4、用细胞塑料刮将贴壁细胞轻轻地刮下。
用移液枪将已裂解的细胞分别移入预冷的已标记好的EP管中。
5、将分装标记好的EP管置于—80°C保存待用。
蛋白含量测定步骤：1、取已冻存的蛋白液室温融化后，4°C离心12000rpm，30min。
2、将EP管置于4°C冰上，弃去沉淀，吸取上清液于新的预冷EP管中，分别标记为CTL1、NC1、S2a。
3、取一个96孔板，采用其中6孔作为标准孔分别加入各种试剂（ul）。
编号 1 2 3 4 5 6 ddH2O 25 20 15 10 5 0 BSA 0 5 10 15 20 25(Total volume：25ul )4、往三个加样孔中分别加入22. 5ul ddH2O（DDI），CTL1、NC1、S2a 三管中各取2.5ul蛋白液分别加入到三个加样孔中。
按照反应液A∶B=50∶1，三个样品孔和六个标准孔中分别加入200ul AB混合液。
5、混匀后，放在37°C培养箱中30min。
6、在生物分光光度计上比色分析，制作标准曲线。
随后得到样品蛋白质浓度。
按照上样蛋白35ug计算蛋白上样体积，加入蛋白上样缓冲液制成电泳上样品，100°C金属浴10min左右即可，—80°C保存备用。
总结：1、当反应液和待测蛋白放在37°C培养箱中30min后，尽快测定蛋白浓度(随反应时间推移，所测蛋白浓度会增高)。
SDS-PAGE电泳步骤：1、清洗玻璃板玻璃板两面先用洗衣粉或者清洁剂轻轻擦洗，然后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后置于烤箱中烘干。