幽门弹簧插入配合高盐热糊灌胃复制大鼠慢性萎缩性胃炎癌前病变模型形态学观察及早期细胞凋亡分析

幽门弹簧插入配合高盐热糊灌胃复制大鼠慢性萎缩性胃炎癌前病变模型形态学观察及早期细胞凋亡分析1张玉禄1，李军祥1*，鲁香凤2，戴欣2，朱陵群3，尹军祥2，孙海芸21 北京中医药大学东方医院消化内科，北京（100078）2 北京中医药大学东直门医院，北京（100700）3 北京中医药大学中医内科学教育部重点实验室，北京 (100700）E-mail：lijx970508@摘要：目的：研究幽门弹簧插入配合高盐热糊灌胃法复制CAG癌前病变大鼠形态学及早期细胞凋亡特征。

方法：采用幽门弹簧插入配合高盐热糊灌胃法复制CAG癌前病变模型，用双标记流式细胞术分析CAG癌前病变大鼠细胞凋亡的特征。

结果：光镜观察表明CAG 癌前病变模型复制成功，CAG癌前病变模型组大鼠早期凋亡率明显高于正常组（P<0.01）。

结论：幽门弹簧插入配合高盐热糊灌胃法成功复制CAG癌前病变大鼠模型, 细胞凋亡增强可能是CAG癌前病变的发病机理之一。

关键词：萎缩性胃炎，癌前病变，病理形态，流式细胞术，Annexin V，大鼠慢性萎缩性胃炎（Chronic Atrophic Gastritis，CAG）是消化系统常见病、疑难病之一，在CAG基础上伴发的肠上皮化生（Intestinal Metaplasia ，IM）和异型增生（Dispalsia ，Dys）是胃癌前期病变[1]。

从胃癌II级预防的角度注重对CAG癌前病变转归的研究,特别是建立类似人CAG癌前病变动物模型,在此基础上作干预阻断试验,寻找逆转癌变的方法,意义重大。

按赵凤志等[2]的方法复制大鼠CAG癌前病变模型，从早期细胞凋亡角度对疾病模型进一步分析，提高对疾病模型的认识。

1 材料1.1 实验动物雄性Wister大鼠，体重180～220g，清洁级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

实验动物许可证编号：SCXX（京）2002-0003。

大鼠在相同条件下分笼饲养，每笼5只，常规喂养标准颗粒饲料，自由饮用水。

1.2 流式细胞仪及试剂Annexin V-FITC试剂盒(美国BD公司) ，碘化丙啶(PI)（美国Sigma公司），Rnase A（美国Sigma公司）。

1.3 动物实验技术条件北京中医药大学东直门医院中药药理学实验室II级动物实验室，许可证号：SYXK 11-00-0029。

1.4 主要仪器（1）TP-1000 电子天平，湘仪天平仪器厂。

（2）OL YMPUS B×51 显微镜，日本制造。

1本课题得到国家自然科学基金项目(No．30572388)的资助。

（3）LEIKA RM2135 石蜡切片机，LEIKA ASP300 脱水机，德国制造。

（4）流式细胞仪:FACScalibur, 美国BD公司制造。

2 方法2.1 大鼠CAG癌前期病变模型的建立按赵凤志等[2]的方法，将雄性Wistar大鼠(体重230～260g)禁食不禁水16小时后，以1.0％戊巴比妥腹腔注射麻醉(0.5ml／100g)，称重，固定大鼠四肢，在无菌条件下开腹，暴露胃，在胃前壁距幽门环0.2cm无或少血管处切一小口，将一长约2cm，直径约0.2～0.3cm 的金属弹簧前1/3插过其幽门环进入十二指肠，用缝线将弹簧两端及中央固定，按手术常规逐层缝合胃及腹壁切口。

手术后禁食不禁水24h，恢复性饲养1周后，开始每周每只大鼠灌胃60～70℃高盐热淀粉糊2次(含15％氯化钠)，每次2ml，连续24周。

并于造模结束前随机抽取模型组大鼠8只进行胃粘膜病变理形态学检查，其中7只出现轻～中度不典型增生，符合统计学要求，确认造模成功。

2.2流式细胞术检测2.2.1单细胞悬液制备模型组、正常组大鼠各8只， 10%水合氯醛麻醉大鼠后，剖腹取胃，漂洗干净后，于胃窦部取米粒大小胃组织，剪碎成<1mm3大小，用组织匀浆器研磨成细胞悬液，过200目筛网，取滤液离心1000转/min，用PBS洗2遍，再过300目筛网，所得滤液即为单细胞悬液。

显微镜下细胞计数，调整细胞浓度2×106 ml-1，备用。

2.2.2 Annexin V/PI法检测细胞早期凋亡严格按说明书进行操作：取1×106细胞用冷的PBS洗两次，悬浮于100µl binding buffer，加入5 µl Annexin V- FITC及5 µl PI，混匀后室温避光染色15 min，加入400µl binding buffer，1小时内用流式细胞仪获取细胞并分析结果。

2.2.3 流式细胞仪分析光源为488 nm氩离子激光器，FITC受激发后发绿色荧光，PI发红色荧光,以CELLQuest 软件获取10,000个细胞并分析凋亡百分比,用HP-Deskjet 1600CM打印结果。

Annexin V- FITC/ PI双标记流式细胞术可以将实验样本中正常、机械损伤细胞、早期凋亡细胞和坏死细胞区分开。

以Annexin V- FITC和PI荧光作双参数散点图,可见细胞分为四个亚群:A: Annexin V- FITC -、PI-,代表正常细胞；B: Annexin V- FITC-、PI+代表机械机械损伤细胞；C: Annexin V- FITC+、PI -,为早期凋亡细胞；Ｄ: Annexin V- FITC+、PI +为坏死细胞。

3结果3.1 大鼠一般情况模型组动物喜蜷卧，皮毛散乱无光泽，体重559.38±38.92g，显著低于正常组体重661.00±22.93g（P＜0.01）。

如表1表1：两组大鼠体重比较例数（n）大鼠体重(g)正常组8 661.00±22.93模型组8 559.38±38.92△△△:△ P<0.01（与正常组比较）3.2 胃粘膜大体改变观察结果（1）正常组：大鼠胃粘膜呈粉红色，有光泽，被覆较多粘液，粘膜皱襞表面光滑，走向规则，胃壁弹性良好(图A)。

（2）模型组：造模24周时，大鼠胃壁弹力减弱，粘膜层变薄，色苍白或紫暗，皱襞变平或走向紊乱，有者粘膜表面黄染，部分大鼠胃粘膜糜烂充血或有溃疡形成。

大部分在胃窦部可见一至数个灰白色结节，质地偏硬(图B)。

3.3 胃粘膜组织学改变光境观察结果（1）正常组：大鼠胃粘膜上皮细胞排列整齐，无缺损或脱落，腺体形状规则，大小基本一致，腺上皮细胞多呈单层排列，固有层偶见少许慢性炎细胞浸润。

粘膜肌层平滑肌呈环行排列，未见增生及向粘膜层深入现象（图C）。

（2）模型组：大鼠出现多灶性萎缩性胃炎，表现为粘膜腺体减少，体积缩小，部分腺体呈囊性扩张，固有层可见较多慢性炎症细胞浸润，部分有淋巴滤泡形成，毛细血管扩张淤血，粘膜肌层增厚，结缔组织及平滑肌增生并向粘膜层萎缩的腺体间伸延。

8只大鼠中有7只伴有轻--中度不典型增生，表现为腺体大小、排列和形状不规则，出现共壁或“背靠背”现象，腺上皮细胞大小形状不一，核浆比增大，胞浆嗜碱性增强，分泌现象减少或消失，部分细胞排列成多层或呈乳头状增生。

（图D～G）。

3.4双标记流式细胞术检测结果CAG癌前病变模型组大鼠早期凋亡率明显高于正常组（P<0.01），如下表2：表2：两组大鼠早期细胞凋亡比较例数（n）早期凋亡（%）正常组8 2.22±2.26模型组8 5.36±1.78△△△△P<0.01（与正常组比较）4 讨论本模型复制的机理主要是由十二指肠液反流、金属弹簧、缝线的机械刺激及高渗盐和热损伤等综合作用的结果。

模型的病变部位主要在胃窦部，十二指肠液反流及高渗盐和热损伤等诱发原因又与人患胃癌的诱因相似，因此此模型可用于胃癌前期病变发生机理和防治作用的研究。

流行病学调查显示，长期高盐饮食可导致萎缩性胃炎，甚至胃癌的发生[3]。

动物实验也证实长期过热饮食可引起大鼠胃粘膜萎缩[4]。

热烫、高盐食物入胃后，可直接导致胃粘膜的损伤，粘液屏障的破坏，当胃粘膜上皮反复发生损伤和再生修复时，有可能启动基因的突变而发生癌变。

高盐饮食可以升高胃肠渗透压，使其蠕动减慢、排空延迟，也间接促进了对有毒成分的吸收。

因此，在胃癌及其癌前病变的发生过程中，烫热、高盐饮食是不容忽视的因素。

采用将金属弹簧置入幽门环而导致幽门环持久性扩张，从而引起碱性肠液如胆汁等返流入胃。

研究表明，碱性肠液，特别是胆汁的反流与胃癌及其癌前病变的发生发展密切相关。

Miwa等[5]通过手术造成Wistar 大鼠不同反流模型后50 周发现，胰十二指肠液反流组和假手术组均无胃癌发生，而2/8 的单纯胆汁反流组和11/29 的混合反流组大鼠发生了胃癌，且只在这两组动物中可见胃癌前病变存在，提示反流肠液中的胆汁是引发胃癌的成分，其他成分可能起一定的促进作用。

一方面，胆盐可使表皮细胞大量溶解，肥大细胞脱颗粒，提高胃粘膜内组织胺的水平，从而破坏胃黏液屏障和上皮细胞，促进致癌物质的吸收。

另一方面，胆酸尚可激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)[6]，可以影响与细胞形态密切相关的微丝组装蛋白的磷酸化，在细胞的恶性转化过程中起重要作用[7]。

在本次造模过程当中，模型组8只大鼠中，7 只出现了轻～中度异型增生，符合统计学要求，说明模型复制成功。

细胞凋亡是由自稳机制促发的细胞程序化死亡,受基因调控。

细胞凋亡事件发生的时间顺序一般依次为受体激活、线粒体功能减低、Caspase家族激活、PS暴露、DNA断裂、形态改变等。

检测凋亡早期细胞膜磷脂酰丝氨酸（PS）暴露的方法,比检测DNA断裂或形态改变更能反映凋亡的启动。

因此,使用能特异性结合细胞膜PS的Annexin V- FITC（共轭有荧光色素染料异硫氰酸荧光素（FITC）的膜联蛋白ⅴ）作为探针,可以检测细胞早期凋亡,同时利用碘化丙啶(PI)不能透过完整细胞膜的特点,可以使用Annexin V- FITC/ PI双标记流式细胞术可以将实验样本中正常、机械损伤细胞、早期凋亡细胞和坏死细胞区分开。

以Annexin V- FITC和PI荧光作双参数散点图,可见细胞分为四个亚群:A: Annexin V- FITC -、PI-,代表正常细胞；B: Annexin V- FITC-、PI+代表机械机械损伤细胞；C: Annexin V- FITC+、PI -,为早期凋亡细胞；Ｄ: Annexin V- FITC+、PI +为坏死细胞。

胃粘膜癌变并非由正常细胞一跃而成为癌细胞，而是由正常胃粘膜细胞→浅表性胃炎→萎缩性胃炎→肠上皮化生→异型性增生→胃癌[8,9]。

研究发现CAG胃粘膜细胞凋亡增加，并认为此种变化与粘膜萎缩、肠化、不典型增生乃至癌变都有密切关系[10,11]，有学者据此推测细胞调亡是胃癌演化进程中的早期事件[12]。