Shh在雷奈酸锶促进骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用_靳思思

液蛋白 （ bone sialoprotein，BSP） 、ALP 和 骨 钙 素 （ osteocalcin，OCN） 等［2-3］，其中，Ｒunx2 特异性表达于成 骨细胞，是启动成骨作用的一个关键的转录因子［4］。 成骨细 胞 来 源 于 骨 髓 间 充 质 干 细 胞 （ bone marrow
Байду номын сангаас
ALP 活性增高，钙结节形成增加。Sr（ 0． 1 ～ 5 mmol / L） 作用 BMSCs 7 d，可明显促进 Shh 和 Ｒunx2 蛋白的表达，且
Shh 蛋白在 1 mmol / L Sr 作用时表达最多，而 Ｒunx2 在 3 mmol / L Sr 作用时表达最多。1 mmol / L Sr 作用 BMSCs 不同
中国病理生理杂志 Chinese Journal of Pathophysiology 2014，30（ 1） ： 159-164 ［文章编号］ 1000-4718（ 2014） 01-0159-06
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Shh 在雷奈酸锶促进骨髓间充质干细胞 成骨分化过程中的作用*
靳思思1，2 ， 胡洁芬1，2 ， 吴 文2△
Sonic Hedgehog（ Shh） 属于 Hedgehog 家族成员，
研究对象，根 据 不 同 实 验 需 要 将 细 胞 种 植 于 培 养 皿 或培养板中，待细胞融合至 80% ～ 90% 融合后加入 含不同药物浓度的成骨诱导液 （ 含 10% 胎牛血清、 1 × 10 － 8 mol / L 地塞米松、10 mmol / L β-甘油磷酸钠 和 50 mg / L 抗坏血酸的 DMEM / F12 培养液） 培养。 2． 3 ALP 活性检测 选取第 3 代细胞 1 × 1011 / L 密
（ 1南方医科大学，广东 广州 510515； 2 广东省人民医院，广东省医学科学院东病区内分泌科，广东 广州 510080）
［摘 要］ 目的： 研究 Sonic Hedgehog（ Shh） 在雷奈酸锶（ strontium ranelate，Sr） 促进大鼠骨髓间充质干细胞
（ BMSCs） 向成骨细胞分化中的作用。方法： 采用全骨髓贴壁培养法分离、纯化、培养大鼠 BMSCs，取第 3 ～ 5 代 BM-
SD 大鼠 1 只，颈椎脱臼法处理后用 75% 乙醇浸泡 5 min，在无菌条 件 下 分 离 出 两 侧 股 骨 和 胫 骨，剔 除 周 围的肌肉、筋 膜 等 组 织，剪 去 股 骨 近 端 及 胫 骨 远 端， 暴露骨髓腔，用含 10% 胎牛血清、1 × 105 U / L 青霉素
mesenchymal stem cells，BMSCs） ，因此，BMSCs 向 成 和 100 mg / L 链霉素的 DMEM / F12 培养基反复冲洗
时间（ 1、3、5、7 d） ，呈时间依赖性地上调 Shh 和 Ｒunx2 蛋白的表达。Cy（ 10 μmol / L） 不仅拮抗 Sr 对 Shh 和 Ｒunx2 表
达的上调作用，还抑制 Sr 对 ALP 和钙结节形成的促进作用。结论： Sr 可通过上调 Shh 蛋白及成骨特异性转录因子
Ｒunx2 的表达促进 BMSCs 向成骨细胞分化。
骨细胞分化在骨形成中必不可少。而 BMSCs 向成骨 细胞的分化由多个信号通路介导调控。Peng 等［5］发 现 Sr 可以通过激活丝裂原活化蛋白激酶 （ mitogenactivated protein kinases，MAPK） 信号通路，包括调控
骨髓腔，收集细胞，1 000 r / min 离心 5 min，弃上清， 加入 5 mL 上述 DMEM / F12 培养液重悬细胞，接种于 25 cm2 的培养瓶中，置于 37 ℃ 、5% CO2 的培养箱中 培养。24 h 后换液，以后每隔 2 ～ 3 d 换液 1 次，倒置
达，促使 BMSCs 向成骨细胞分化。我们的前期实验 2． 2 BMSCs 的成骨分化 选取第 3 ～ 5 代 BMSCs 为
证明转化生长因子 β1 （ transforming growth factor β1 ， TGF-β1 ） 、骨形态发生蛋白 2（ bone morphogenetic protein 2，BMP-2） 和骨形态发生蛋白 7 （ bone morphogenetic protein 7，BMP-7） 在 Sr 促进 BMSCs 成骨分化中 起重要作用［6-8］。
细胞外信号调节激酶 1 /2 （ extracellular signal-regula- 相差显 微 镜 下 观 察 细 胞 生 长 状 况，直 至 细 胞 接 近
ted kinase 1 /2，EＲK1 /2） 、p38 MAPK 及 Ｒunx2 的表 80% ～ 90% 融合时进行 1∶ 2 传代纯化。
骨质疏松药，能显著地降低绝经后妇女的椎体和非 Servier 公司惠赠； ALP 检测试剂盒购自南京建成生 椎体骨折的风险［1］。在细胞水平上，一些研究认为 物工程研究所； 细胞茜素红（ alizarin red） 钙染色试剂
Sr 具有多种促进骨形成的机制，例如，增强前成骨细 盒购自上海杰美生物技术有限公司； Shh 抗体购自
JIN Si-si1，2 ，HU Jie-fen1，2 ，WU Wen2
（ 1 Southern Medical University，Guangzhou 510515，China； 2 Department of Endocrinology，East Ward，Guangdong General Hospital，Guangdong Academy of Medical Sciences，Guangzhou 510080，China． E-mail： wuwen1964@ 163． com）
［ABSTＲACT］ AIM： To study the role of Sonic Hedgehog （ Shh） in strontium ranelate （ Sr） -induced osteogenic differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells （ BMSCs） ． METHODS： BMSCs was isolated from 4-week-old rats by adherent culture． The cells in the 3rd ～ 5th generations were induced to differentiate into obteoblasts，and then were treated with different concentrations of Sr and cyclopamine （ Cy） ． The activity of alkaline phosphatase （ ALP） was measured by colorimetry． Mineralized nodules were observed by alizarin red staining． The cellular Shh and Ｒunx2 expression was detected by Western blotting． ＲESULTS： Sr at concentration of 3 mmol / L increased the activity of ALP and induced the formation of mineralized nodules． Sr at concentrations ranging from 0． 1 to 5 mmol / L increased the expression of Shh and Ｒunx2 in the BMSCs at 7 d． Furthermore，the peak expression of Shh occurred following the exposure of Sr （ 1 mmol / L） or Ｒunx2 （ 3 mmol / L） ． On the other hand，Sr at concentration of 1 mmol / L showed a time-dependent increase in the expression of Shh and Ｒunx2 from 1 d to 7 d． Cy at concentration of 10 μmmol / L not only obviously inhibited Sr-induced expression of Shh and Ｒunx2，but also antagonized the increase in the ALP activity and mineralization induced by Sr in the BMSCs． CONCLUSION： Sr promotes osteogenic differentiation of BMSCs by increasing the expression of Shh and Ｒunx2．
SCs 加入成骨诱导液诱导成骨分化，再加入不同浓度 Sr 及 Shh 拮抗剂 cyclopamine（ Cy） ，分别观察它们对 BMSCs 向
成骨细胞分化的影响。酶标法检测成骨细胞分化早期标志物碱性磷酸酶（ alkaline phosphatase，ALP） 的活性； 茜素
红染色检测细胞钙化水平； Western blotting 法检测 Shh 和 Ｒunx2 蛋白的表达情况。结果： Sr（ 3 mmol / L） 可以使细胞
胞和成骨细胞的复制及功能活动，包括骨基质合成 Abcam； Ｒunx2 抗体购自 CST； Cyclopamine 购自 Sell-
增多、碱性磷酸酶（ alkaline phosphatase，ALP） 活性增 eckchem。
高以及上调成骨细胞相关蛋白，如 Ｒunt 相关转录因 2 主要方法
子 2（ Ｒunt-related transcription factor 2，Ｒunx2） 、骨唾 2． 1 大鼠 BMSCs 的分离、纯化及培养 取 4 周龄