人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为脂肪细胞

3.会议论文 王忠.高毅.汪艳.潘明新 人骨髓间充质干细胞的分离培养与鉴定 2007
目的:建立一种简便可行的人骨髓间充质干细胞的体外培养扩增方法，并就人骨髓间充质干细胞的表型、细胞周期、生长曲线、超微结构、核型等方 面进行初步鉴定. 方法:应用密度梯度离心法分离人骨髓间充质干细胞，条件培养基培养.相差显微镜下观察HMSCs形态学变化；流式细胞仪检测HMSCs的表面标记以及 细胞周期；绘制HMSCs的生长曲线，计算细胞倍增时间；扫描电镜和透射电镜观察HMSCs的超微结构；Giemsa染色检测HMSCs的细胞核型. 结果:密度梯度离心法能分离出纯度较高的HMSCs.HMSCs贴壁生长，以长梭形为主.细胞存活率均大于95%.流式细胞仪检测HMSCs CD29、CD34、CD44、 CD45、CD71、CD105、CD166、HLA-ABC、HLA-DR、UEA-1阳性表达细胞比率分别为95.3%、1.8%、94.7%、0.8%、96.2%、96.6%、92.7%、96.3%、1.1%、 98.7%.HMSCs的生长曲线呈S形，在传代7代之前具有较好的生长特性.超微结构显示HMSCs表面较多突起，孔隙较多，胞质丰富，粗面内质网发达，囊腔扩 张，可见大量蛋白分泌物.核
4.期刊论文 王忠.高毅.汪艳.潘明新.WANG Zhong.GAO Yi.WANG Yan.PAN Ming-xin 人骨髓间充质干细胞的分离培 养与鉴定 -中华神经医学杂志2006,5(10)
万方数据 收稿日期： &""+ $ "! $ !" ；修回日期：&""+ $ "# $ "%
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人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为脂肪细胞
作者： 作者单位： 李海红， 付小兵， 张庆红， 周岗， 孙同柱 李海红(解放军总医院304临床部全军创伤修复重点实验室,北京,100037;郧阳医学院附属太 和医院,湖北,十堰,442000)， 付小兵,周岗,孙同柱(解放军总医院304临床部全军创伤修复 重点实验室,北京,100037)， 张庆红(郧阳医学院附属太和医院,湖北,十堰,442000) 创伤外科杂志 JOURNAL OF TRAUMATIC SURGERY 2006，8(1) 1次
& 李海红!， ， 付小兵! ， 张庆红& ， 周 , 岗! ， 孙同柱!
（ !- 解放军总医院 ’"% 临床部全军创伤修复重点实验室， 北京, !"""’( ；&- 郧阳医学院附属太和医院， 湖北 十堰, %%&""" ） , 探讨人骨髓间充质干细胞 （ /0123 ） 体外分离培 , , 摘要： 养、 鉴定以及分化。认为 /0123 在体外很容易分离培养和扩 增， 成人骨髓间质干细胞在体外可以分化为脂肪细胞。 关键词：人骨髓间充质干细胞；分离培养；脂肪细胞 中图分类号：4 ’&#- &, , 文献标识码：5 骨髓中存在着一类被称为间充质干细胞 （ 673789/:6;< 3=76 97<<3， 0123） 的非造血干细胞， 这些细胞具有强大的多向 分化潜能， 特别是跨胚层分化能力， 且 0123 来源丰富、 分离 培养简单、 具有高度增殖能力。笔者就人间充质干细胞的分 离、 培养和诱导分化作一探讨。 材料与方法 4 , 实验方法, 无菌条件下穿刺正常人髂后上嵴， 抽取骨髓 采用直接贴壁法， 以含 !"> 胎牛血清、 青霉素 （ !"" 约 &6<， ? @ 6<） 和链霉素 （ !"" !A @ 6<） 的 B0C0 @ D!& 为培养液 （ 即 /0E 123 培养液） ， 在 ’(F 、 体积分数 +> 2G& ， 饱和湿度的孵育箱 内培养， &% 小时后更换培养基，弃掉未贴壁细胞， 以后每 & H ’ 天换液 ! 次。待细胞达 *"> 融合时， 用 "- &+> 的胰蛋白酶 ’(F 消化， 加入上述 /0123 培养液， 按 !I ’ 比例传代培养。 分别用免疫细胞化学法和流式细胞仪法对 /0123 的表面标 记进行检测， 同时检测第 ’ 代和第 !" 代 /0123 的细胞周期。 第 !" 代 /0123 达 *"> H #"> 融合后， 行定向脂肪诱导， 试验 组加入 JEB0C0 诱导液 （ 含 !"> 胎牛血清， !""? @ 6< 青 霉 素， !"" !A @ 6< 链霉素， ! !6K< @ L 地塞米松， !" !A @ 6< 胰岛素， "- +66K< @ L M50N， 对照组加入 JEB0C0 培养液 （ 含 !"> 胎 牛血清， !""? @ 6< 青霉素， !"" !A @ 6< 链霉素） ， 每 & H ’ 天换液 ! 次。分别在培养第 ! 和第 & 周行油红 “ G” 染色， 苏木素复 染。 5 , 结果, 采用直接贴壁法培养 /0123， &% 小时后可观察到 培养的上清中有很多的漂浮细胞及少量贴壁细胞， 根据形态 的不同， 贴壁细胞可分为 ’ 种：小圆细胞、 星形细胞和梭形 细胞 （ 即 /0123） 。贴壁细胞前 & H ’ 天生长缓慢， 之后迅速 增殖， 且以梭形细胞占优势， ( 天左右达融合。通过间断摇动 培养瓶， 可使骨髓血中大量的红细胞、 白细胞等漂浮细胞与 贴壁细胞分离。由于梭形细胞的优势生长， 第 ’ 代时， 几乎 全为 梭 形 细 胞， 随 着 传 代 次 数 的 增 加， /0123 变 得 宽 大 扁 平， 。第 ’ 代 培 养 的 细 胞 免 疫 细 胞 化 学 示 /0123 2B%% 和 2B!"+ 表达阳性， 但 2B!"+ 的强度弱于 2B%% 的强度， 2B’% 基金项目：国家重点基础研究发展规划资助项目 （ .!###"+%&"%） , , , , , 国家自然科学基金 （ ’"!("#)) ， ’"&’"’(" ） , , , , , 国家杰出青年基金 （ ’#+&+"&% ） 表达阴性； 流式细胞仪示 2B%% 阳性率为 *#- )%> ， 2B’% 为 "- !!> 。细胞周期检测显示第 ’ 代 /0123 中 ." @ .! 期的细 1 O .& O 0 期占 #- %)> ， 第 !" 代中 ." @ .! 期 胞占#"- +%> ， 的细胞占 (*- )&> ， 1 O .& O 0 期占 &!- ’*> 为， 提示绝大部 分细胞处于静止态， 少部分处于功能态。第 !" 代 /0123 加 入脂肪诱导剂后， 诱导第 ! 周油红 “ G” 染色见胞质中有许多 红染的细小颗粒， 第 & 周胞质中红染颗粒聚集增大， 脂滴聚 集达高峰。诱导时间延长达 % 周以上， 脂肪细胞因从基质脱 离而死亡。 讨, 论 0123 存在于骨髓基质中， 对骨髓中的造血干细胞起支 持作用， 骨髓中的 0123 含量极少， 约占骨髓中有核细胞的 "- ""!> H "- "!> ， 但由于 012 很容易分离纯化和扩增， 并且 具有多能性而使其成为理想的干细胞来源。 目前， 尚未发现 0123 的特异性标志， 而是借用间充质细 胞、 内皮细胞、 上皮细胞和肌细胞的特点， 0123 的表面标志 主要有黏附分子、 生长因子和细胞因子、 生长因子受体和细 胞因子受体、 整合素等， 尤其是强表达 2B%% — — —多种配体的 受体， 但 不 表 达 典 型 的 造 血 干 细 胞 抗 原 2B%+ 、 2B’% 和
2.学位论文 郭新 人骨髓间充质干细胞体外分离培养和向内皮细胞诱导分化的研究 2003
该实验从人骨髓中分离纯化MSCs,采用联合鉴定和反向证明法,确定为高度同源细胞群.体外联合应用生长因子和不同细胞外基质,对其进行内皮诱导 分化.采用免疫组化、细胞化学、免疫荧光、电镜、流式细胞分析及RT-PCR技术,在蛋白及核酸水平检测其分化标志,探讨其分化机制.结果显示,诱导分化 后的细胞群为hMSCs和EPC之间的过渡细胞类型,具有内皮分化趋势,由此类型细胞再分化为内皮细胞.hMSCs的内皮诱导分化受局部微环境(细胞外基质 ECM和生长因子)——干细胞小生境影响,ECM-整合素受体和生长因子-受体之间相互作用,调控hMSCs分化.该研究首次系统地探讨hMSCs的最适内皮分化条 件,为将来体外大量产生内皮细胞提供实验依据,并为最终应用于缺血性疾病治疗,促进组织工程化器官的血管再生,达到微血管替代治疗目的,提供重要的 实验和理论基础.
［’］ 2B!% 。本研究 培 养 的 /0123 免 疫 细 胞 化 学 示 2B%% 和
2B!"+ 表达阳性， 但 2B!"+ 的强度弱于 2B%% 的强度， 2B’% 表达阴性， 流式细胞仪示 2B%% 阳性率为 *#- )%> ， 2B’% 为 "- !!> ， 符合 0123 的基本特征标志。细胞周期检测显示第 ’ 代 /0123 中 ." @ .! 期的细胞占 #"- +%> ， 1 O .& O 0 期占 #- %)> ， 第 !" 代中 ." @ .! 期的细胞占 (*- )&> ， 1 O .& O 0 期占 &!- ’*> 为， 提示绝大部分细胞处于静止态， 保留自我更 新、 增殖和分化能力， 少部分处于功能态。 为了诱导 /0123 向脂肪细胞分化， 我们选择了含 !E甲 基E’E异丁基E黄嘌呤 （ M50N） 、 地塞米松、 胰岛素、 和牛血清的 培养基， 用油红染色证实获得大量的脂滴， 在诱导 ! 周时就 可检测到脂滴， & 周时脂滴聚集达高峰， 诱导时间延长达 % 周 以上， 因脂肪细胞从培养瓶脱落而死亡。/0123 向脂肪细胞 分化的具体机制尚不清楚， PQKR7< 等用 4PES24 方法分析发 现基础培养条件下的 0123 表达脂肪细胞特异性的转录活性 基因：脂蛋白脂酶、 ;S& 以及参与控制脂肪分化的转录因子 2 @ C5S" 和 SST4 #! ， 诱导 ’ 周时， 细胞表达成熟脂肪细胞的 其它标志：SST4#& （ SST4# 的另一剪接同工型） 和脂素。未 分化的细胞表达许多种系特异性的转录活性基因， 可能是从 广泛干细胞室来源的细胞， 在不同的分化能力间波动， 当给 予一定的条件刺激时， 就向特定的终末细胞分化， 这是细胞 具有可塑性的基础， 也是 012 的主要特性。 （ 本文编辑： 章洛秋）
创伤外科杂志 &"") 年第 * 卷第 ! 期, U PQ;V6; 1VQA， &"") ， WK<- * ， XK- ! 文章编号： !""# $ %&’( （ &"") ） "! $ ""*+ $ "!
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人骨髓间充质干细胞定向诱导分化为脂肪细胞
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刊名： 英文刊名： 年，卷(期)： 被引用次数：
相似文献(10条) 1.期刊论文 李海红.付小兵.周岗.白晓东.陈伟.朱国俊.蔡存良.孙同柱 人骨髓间充质干细胞体外分离培养、鉴定 及标记 -创伤外科杂志2005,7(4)
目的探讨人骨髓间充质干细胞(hMSCs)体外分离培养、鉴定和标记的方法以及生物学特性.方法无菌条件下穿刺人髂后上嵴抽取骨髓,采用直接贴壁法 分离纯化hMSCs,体外扩增,用免疫细胞化学法及流式细胞仪分别对培养的hMSCs进行鉴定,同时检测第3代和同代溴脱氧尿嘧啶(5-bromo-2'deoxyuridine,BrdU)标记的hMSCs细胞周期.结果体外培养的原代hMSCs在培养24小时内可见少量贴壁细胞,7天达到融合,免疫细胞化学示CD44和CD105表达 阳性,CD34表达阴性,流式细胞仪示CD44阳性率为89.64%,CD34为0.11%.大部分hMSCs核抗BrdU染色阳性,阳性率达90%.细胞周期显示第3代和同代BrdU标记 的hMSCs约有90%的细胞处于G0/G1期,第10代为80%.结论 hMSCs在体外很容易分离培养和扩增,但随着传代次数的增加,hMSCs变得宽大扁平且增殖速度减慢 ,出现衰老现象;用BrdU标记hMSCs对其细胞周期无明显影响,可作为标记细胞的一种有效手段.