乙酸镍对人支气管上皮细胞系的恶性转化研究

【Ａｂｓｔｒａｅｔ】ｎｌ枇：Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｗａｎｓｆｏｎｎｅｄ ｈｕｍａｎ ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ（１６ＨＢＥ）ｍｏｄｅｌ ｂｙ ｎｉｃｋｅｌ
ａｃｅｔａｔｅ＾·ｒ ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｄｅｅｐｌｙ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｎｉｃｋｅｌ ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ Ｍｅｔｌｍｄｓ：１６ＨＢＥ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｔｗｅｌｖｅ ｔｉｍｅｓ（ａ ｔｈｎｅ ｅｖｅｒｙ ２０ ｄａｙｓ）ｗｉｔｈ ｎｉｃｋｅｌ ａｃｅｔａｔｅ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．卟ｅ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｍａｂｇ－
本研究通过建立乙酸镍诱发１６ＨＢＥ细胞恶性转 化模型，进一步为以后结合分子生物学方法研究镍 化合物的分子致癌机制做出了必要的准备。
Ｃｍａｎ－ｄｅｌ
２．ＷＵ
Ｚｈｏｎｇ－ｌｉａｎｇ ２（１．Ｌｎｏｈ，ｕ
ｆｏｒ ｃｅｎｔｅｒ
Ｄｉｅａｓｅ
Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ
Ｐｒｅｖｅｒａｉｎａ．Ｓｈｅｎｚｈｅｎ
５１８０２０；２．Ｉｍｓｔｉｔｕｋｅ ｆｏｒ ｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ
Ｃ．ｕａｍｚｔｗ．１ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅｓ Ｇｎａｎｄｄｍｕ ５１０１８２，ｃｈｉｎａ）
ｆｉｒｍｅｄ ｂｙ ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｅａｌ ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｎｉｃｋｅｌ ｓｕｆｆｉｄｅ，ｎｉｃｋｅｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ａｎｄ ｎｉｃｋｅｌ ａｃｅｔａｔｅ ａｌｌ ｃｏｕｌｄ ｉｎｄｕｃｅ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｍｍｔｉｏｎ ｏｆ １６ＨＢＥ ｃｅｌｌｓ
脂培养实验鉴定其锚着不依赖性。采用６０ ｍｍ平皿， 每ｍｔ）ＪⅡ人３ ｍｌ ０．７％底层琼脂－ＭＥＭ完全培养基 （１ ４％底层琼脂和ＭＥＭ完全培养基１：ｌ混合）， 待凝固后加上顶层为３ ｍｌ含１ ０００个待测细胞的 ０ ２５％琼脂．ＭＥＭ完全培养基（０．５％顶层琼脂和 ＭＥＭ完全培养基１：１混合），每组细胞设５个平行 样，培养３周后计数每组细胞的集落形成率。 １．２ ５ 裸鼠成瘤实验 ４周龄的ＢＡＬＢ／Ｃ裸鼠６ 只（雌雄各半）。取０．２ ｍｌ含４×１０６个乙酸镍转化的 细胞的无血清ＭＥＭ混悬液注入裸鼠右侧颈部与背 部交界处＋阴性对照组注射含等量未经处理的１６ＨＢＥ 细胞的无血清ＭＥＭ，每组３只。每周观察记录注射部 位及肿块发生情况，３周后处死动物，分离肿块常规 病理切片检查和成瘤细胞的纯化培养。
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】ｎｉｃｋｅｌ ａｃｅｔａｔｅ；ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｒａｎｓｆｏｍｍｔｉｏｎ；１６ＨＢＥ
镍化合物是一类多器官毒物，可累及肝、肾、 肺和心血管系统、血液等多种重要器官。某些镍化合 物具有较强的致癌性，可以引起接触者肺癌和鼻咽
癌“１。但其致癌的确切机制仍未完全明了…。作为体 内化学致癌过程中最直接的体外模拟——细胞转化 实验，已被逐渐用于探索多种镍化合物的细胞转化
①收稿日辫：２０６２—０９—２０；修订日期：２００２一ｌｌ一１９ 基金项目：国家白然科学基金项目（Ｎｏ ３９１７０６５１） 作者简彳『：陈抟德（１９７６一 ｝，男，安徽叶集人，医学硕士．研究方向：化学致癌。
万方数据
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活性。圮卫东等用不溶性结晶型硫化镍对人支气管 上皮细胞（１６ＨＢＥ）进行了恶性转化…。本文用水溶性 乙酸镍对１６ＨＢＥ进行转化研究，以期比较两种镍化 合物的佃胞恶性转化能力，并为下一步研究镍化合 物的致癌机制提供细胞模型。
—－ —－ －一 癌变．畸变．突变 ２００３年４月第１５卷第２期
文章编号：１００４—６１６Ｘ（２００３）０２—００７２—０３
Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，Ｔｅｒａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ肌ｄ Ｍｕｌａｇｅｎｅｓｉｓ Ｖｏｌ １５ Ｎｏ ２ Ａｐｔ，２００３
·论著·
乙酸镍对人支气管上皮细胞系的恶性转化研究①
胞进行分阶段多次染毒：每隔２０ ｄ染毒１次，每次染毒２４ ｈ。染毒１２次后，通过软琼脂集落形成试验和裸鼠体内致瘤试验鉴定
细胞恶性转化程度。结果：经乙酸镍多次处理１６ＨＢＥ细胞至７５代时，细胞，ｔ长速度加快，排列紊乱，失去接触抑制，出现复层
生长，并ｒ Ｔ在软琼脂ｊ：生Ｋ，且警剂量反应关系．但在第７５代之前的细胞则不能在软琼脂匕生长。转化细胞在裸鼠体内成瘤，病
２ ２ 乙酸镍对１６ＨＢＥ细胞的转化作用 阴性对照组及在第１２次染毒之前的各实验组细
胞均仍呈单层生长，排列有序，未观察到转化灶的 形成，见图１（封三）。而经第１２次染毒后，乙酸镍各 实验组细胞生长速度加快，均可观察到转化灶的出 现，灶内细胞排列紊乱，失去接触抑制并出现重叠生 长，见图２（封三）。 ２．３ 乙酸镍对细胞软琼脂集落形成的影响
２ 结果 ２ １ 乙酸镍对１６ＨＢＥ细胞的毒性作用
乙酸镍的绝对克隆形成率和相对克隆形成率随 着剂量的增加而降低，呈现剂量反应关系（表１）。选 择相对克隆形成率在１０％～９０％范围之内的１００、 ４００和８００ Ｐｔｍｏｌ／Ｌ ３个剂量作为转化实验的剂量。
表１．乙酸镍对１６ＨＢＥ细胞的毒性作用
Ｔａｂｌｅ １．Ｔｏｘｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｃｋｅｌ ａｃｅｔａｔｅ Ｏｉｌ １６ＨＢＥ
１６ＨＢＥ细胞未经处理或经乙酸镍第６、１０次处 理后均不能在软琼脂上生长，见图３（封三），而经第 １２次处理后的各实验组均能在软琼脂上生长形成集 落，见图４（封三），呈现剂量反应关系（表２），并明
万方数据
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理组织学证实为低分化鳞状细胞癌。结论：已酸镍具有使１６ＨＢＥ细胞发生恶性转化的能力。
【关键词ｌ己酸镍；人支气管上皮细胞系；细胞转化
中图分类哥：Ｒ１３５
文献标识码：Ａ
１锄Ｅ ｓｒ兀】ＤＹ ｏＮ ＴＨＥ ＡＢＩＬｎＹ ｏＦ ＮＩＣＫＥＬ ＡＣＥｒＡＴＥ ＴＯ ＴＲＡＮＳＦｏＲＭ
ＭＡＬｌＧＮＡＮｎ．Ｙ
ＣＨＥＮ
３讨论 用体外细胞培养技术研究环境中各种致癌因子
的致癌性及致癌机制，是一种比较理想的有效方 法。本研究采用乙酸镍对第１６ＨＢＥ进行多阶段多次 染毒，发功ｌ第１２次染毒之前的细胞均不能获得锚着 独立性，稚第１２次染毒以后才具有锚着非依赖性和
动物致瘤性。而１６ＨＢＥ细胞经水不溶性结晶型硫化 镍按相同的染毒方式染毒６次后，就可恶性转化，包 括锚着独立性和裸鼠致瘤性”１，表明乙酸镍相对于结 晶型硫化镍来说转化能力较弱。刘云岗等用氯化镍、 硫酸镍和结晶型硫化镍对ＢＡＬＢ／Ｃ．３Ｔ３细胞进行了 转化的研究Ｂ ５。…，在较短的时间内就可获得转化成 功，而本研究则需要较长的时问才使１６ＨＢＥ细胞得 以恶性转化，这可能是因为人细胞的基因组比较稳 定而且还具有有效的ＤＮＡ修复机制，对外来损伤有 较强的抵抗力，故其相对于动物细胞来说较难转化。
ｎｅｇｍｉｖｅ ｃｏｎｔｒ０１．Ｐ‘Ｏ Ｏ
２．４裸鼠致瘤性 裸鼠接种乙酸镍转化细胞１周后，在注射局部均
开始出职！小肿块，并逐渐长大，见图５（封三），而阴性 对照组未见肿块形成。肿块病理诊断均为低分化鳞 状细胞癌：镜下可见细胞大部分呈巢团状分布，少数 形成乳头状腺样结构；间质很少，细胞巢团中央可见 灶状坏死。置。细胞大小形态不一，核大，可见病理性 分裂相，见图６（封三）。
１材料与方法 １ １ 村料 １．１ １ 细胞与动物人支气管上皮细胞系（１６ＨＢＥ） 由广州市呼吸病研究所徐军教授馈赠，ＢＡＬＢ／Ｃ裸鼠 由中山苤科大学实验动物中心提供。 １．１ ２ 主要试剂分析纯乙酸镍购自汕头市化 学试剂广，ＭＥＭ培养基、胰蛋白酶为Ｇｉｂｃｏ公司产品， 乙二胺四乙酸二钠（ＥＤＴＡ）为汕头市光华化学厂产 品，小牛札清购自广卅Ｉ市畜牧场，低熔点琼脂粉、二 甲基亚砜（ＤＭＳＯ）为Ｓｉｇｍａ公司产品。 １．２ ，７法 １．２．１ 细胞培养 １６ＨＢＥ细胞用含ｌＯ％小牛血清 的ＭＥＩＶＩ培养液，在３７℃，５％ＣＯ：饱和湿度的环境 中培养，细胞大致按１ ０×ｌ ０４／ｃｍ２密度接种。隔１３换 液，每：，～４ ｄ传代１次。 １．２ ２细胞毒性实验接种１６ＨＢＥ细胞２００个于 ６０ ＩＴＩＢＩ的培养皿（内置５一培养液），培养２４ ｈ后， 加入乙酸镍，终浓度分别为８００、４００、２００、ｔ００、５０ ／Ｚｍｏｌ／１．，并设三蒸水溶剂对照。每个剂量设５个平行 样。在３７ ｏＣ，５％ＣＯ：的培养箱中培养２４ ｈ后，细 胞用ＰＢＳ洗两次，加入新鲜培养液继续培养７ ｄ。用 甲醇同定细胞１０ ｍｉｎ，然后用１０％Ｇｉｅｍｓａ染色，观 察统计各组生长的克隆数，并计算绝对克隆形成率 （ａｂｓｏｌｕｌｅ ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ。ＣＦＥ）和相对克隆 形成率（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ、ＲＦＥ）。选择 相对克隆形成率为１０％～９０％的浓度为转化实验 浓度ｏ“， １．２．３ 细胞转化实验用２５ ｃｉｎ ２培养瓶，每瓶加 ５ ｒｒＩｌ ＭＥＭ培养基，接种２．５×１０５个细胞；至细胞处 于对数生长期后，加入不同浓度的不同镍化合物或 三蒸水（阴性对照），培养２４ ｈ后弃去处理液，用ＰＢＳ 洗两次；加入新鲜培养基继续培养至细胞长至８５％ 左右，月ｊ消化液消化后，１：４传代。每隔２０ ｄ按上述 方法处理细胞，共１２次，每天观察、记录各瓶细胞生 长及形态变化。 １ ２．４ 锚善非依赖性生长实验细胞经处理６次 （３３代）、１０次（６０代）和１２次（７５代）后，分别用软琼
陈传德。２，昊中亮２，陈家望２ （１深圳罗湖陡疾病预防控制中心，广东深圳
５１８０２０；２广州医学院化学致癌研究所，广东广州
５１０１９２
【摘要】目的：建奇＝乙酸镍（ｎｉｃｋｅｌ ａｃｅｔａｔｅ Ｊ对永生化人支气管上皮细胞系ｔ１６ＨＢＥ）的恶性转化模型，为下一步关于镍化合物致癌
的分子棚制的研究提供相应的恶性转化细胞。方法：通过克隆形成率实验确定乙酸镍对１６ＨＢＥ细胞转化浓度后，对１６ＨＢＥ细